Las inyecciones intrafemorales simplificadas con ratones vivos permiten un análisis continuo de la médula ósea

Resumen

Este protocolo describe la inyección intrafemoral de unas pocas células madre hematopoyéticas o leucémicas, incluidas las células editadas genéticamente, en modelos de xenoinjertos murinos, lo que no solo permitirá el trasplante rápido y seguro de células, sino también análisis seriados de la médula ósea.

Resumen

A pesar de la complejidad del trasplante de células hematopoyéticas en humanos, los investigadores suelen realizar inyecciones intravenosas o intrafemorales (IF) en ratones. En modelos murinos, esta técnica se ha adaptado para mejorar la eficiencia de siembra de células madre y progenitoras hematopoyéticas (HSPC) trasplantadas. Este artículo describe un procedimiento técnico detallado paso a paso de la inyección de FI y la posterior aspiración de médula ósea (MO) en ratones que permite la caracterización en serie de las células presentes en el MO. Este método permite el trasplante de muestras valiosas con un número bajo de células que son particularmente difíciles de injertar por inyección intravenosa. Este procedimiento facilita la creación de xenoinjertos que son críticos para el análisis patológico. Si bien es más fácil acceder a la sangre periférica (PB), la composición celular de la PB no refleja la BM, que es el nicho de las HSPC. Por lo tanto, los procedimientos que proporcionan acceso al compartimento de la MO son esenciales para el estudio de la hematopoyesis. La inyección de FI y la aspiración seriada de BM, como se describe aquí, permiten la recuperación prospectiva y la caracterización de células enriquecidas en el BM, como las HSPC, sin sacrificar a los ratones.

Introducción

El sistema sanguíneo es mantenido durante toda la vida por las células madre hematopoyéticas (HSC), que residen en la médula ósea (MO)^1,2. Para estudiar los cambios dinámicos en el ambiente de la MO, es importante comprender la biología de la hematopoyesis normal y maligna ^3,4. El trasplante de HSCs directamente en el MO humano produce un mayor injerto que la infusión de sangre periférica (PB), pero la alta complejidad del procedimiento y el mayor riesgo de infección impiden que este método forme parte de la práctica estándar⁵. En ratones, los procedimientos que facilitan el acceso a la MO sin sacrificar a los animales proporcionan un recurso para monitorear la hematopoyesis en serie. El procedimiento descrito tiene como objetivo producir ratones con un alto injerto de células trasplantadas y permitir el muestreo en serie de la MO de ratones vivos. Este artículo se centrará en la producción de modelos de xenoinjertos utilizando ratones inmunodeficientes injertados con células humanas, que son más difíciles de producir que los modelos de alotrasplante ratón-ratón. En comparación con el trasplante convencional de células madre y progenitoras hematopoyéticas (HSPC) a través de la cola o la vena retroorbitaria, las ventajas de este procedimiento son un alto injerto celular con una baja cantidad de material de partida.

Aunque la inyección intrafemoral (IF) de células en la cavidad BM de ratones se utiliza habitualmente para estudiar las HSPC humanas in vivo ^6,7,8, no se ha publicado previamente un procedimiento formal paso a paso que ilustre/filme esta técnica. Este protocolo permite un alto injerto a partir de un bajo número de células trasplantadas y un mecanismo para muestrear la MO en serie. Además, es posible utilizar este método para analizar los efectos de la inyección de drogas directamente en la cavidad BM en el tratamiento de enfermedades de la sangre. El procedimiento descrito aquí ayuda a obtener acceso a BM donde residen las células hematopoyéticas sin sacrificar a los ratones.

Este protocolo es similar a la técnica utilizada para las aspiraciones de MO⁹. La diferencia clave es que este artículo y el protocolo de video que lo acompaña detallan un procedimiento seguro para inyectar células en la médula, mientras que los artículos anteriores trasplantaron células a través de la vena y luego realizaron una aspiración BM en serie. Este protocolo permite el injerto exitoso con un pequeño número de una línea celular (Figura 1), HSPC derivadas de sangre de cordón umbilical normal (CB) (CD34⁺) (Figura 2) y HSC (CD34 ⁺ CD38-CD45RA-CD90 ⁺) (Figura 3), HSPC normales derivadas de BM (CD34 ⁺ CD38^-) (Figura 4), células madre leucémicas derivadas del paciente (CD34 ⁺ CD38^-) (Figura 5), HSPC normales derivadas de CB editadas genéticamente por CRISPR/Cas9 (CD34⁺) (Figura 6) y leucemia mieloide aguda (LMA)-iPSC (Figura 7). Especialmente para las HSC normales derivadas de la sangre del cordón umbilical, pudimos hacer con éxito el injerto con solo 10 células. Este método es especialmente valioso para experimentos realizados con poblaciones celulares raras o difíciles de generar, como la leucemia mieloide aguda humana primaria no modificada o editada genéticamente o las células CB. Además, este procedimiento describe un método eficiente para el análisis en serie de células injertadas, que se puede utilizar inmediatamente en experimentos posteriores. Para evitar el desperdicio de muestras valiosas y garantizar la inyección de FI, también hemos descrito brevemente aquí las¹⁰ prácticas del procedimiento basado en Akaluc para ayudar a solidificar esta técnica.

Protocolo

Macho o hembra de seis a diez semanas de edad. En este protocolo se utilizaron ratones Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG), pero se puede aplicar a todo tipo de ratones. La irradiación depende del contenido experimental y del tipo de ratones, la irradiación o no de los ratones depende de los objetivos de la investigación. Todos los procedimientos con animales descritos aquí se llevaron a cabo de acuerdo con las Directrices para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y fueron aprobados por el Panel Administrativo de Cuidado de Animales de Laboratorio de la Universidad de Stanford (APLAC #22264). Todas las poblaciones normales de células sanguíneas se clasificaron frescas. Se obtuvieron muestras humanas de LMA de pacientes del Centro Médico de Stanford con consentimiento informado, de acuerdo con los protocolos aprobados por la junta de revisión institucional (IRB, por sus siglas en inglés) (Stanford IRB, 33818).

1. Inyección intrafemoral de líneas celulares, células madre y progenitoras hematopoyéticas (HSPC) o células madre leucémicas (LSC)

NOTA: Para analizar fácilmente las células inyectadas con un dispositivo de imagen, se generó una línea celular K562 Akaluc/tdTomato-positiva, y se utilizó AkaLumine-HCl/Akaluc como sustrato¹⁰. Si no se dispone de equipo de imagen, las células pueden marcarse con un tinte fluorescente mediante lentivirus o PiggyBac y analizarse mediante citometría de flujo. Independientemente de los detalles de la preparación celular, es importante disponer de una forma de demostrar que las células administradas en la médula ósea han entrado de forma fiable en la MO (Figura 1).

1. Prepare suspensiones celulares (hasta 3 × 10⁶ células sanguíneas) con 20 μL de tampón de clasificación celular activado por fluorescencia (FACS) (solución salina tamponada con fosfato (PBS) + 2% de suero fetal bovino (FBS) + 2 mM de EDTA) o medio de descongelación (IMDM + 20% FBS + Pen/Strep) en tubos de PCR o 1,5 mL y manténgalo en hielo antes de la inyección.
   NOTA: Evite hacer burbujas de aire mientras suspende las celdas con la aguja. Las burbujas deben eliminarse tanto como sea posible justo antes de la inyección, ya que inyectar burbujas de aire puede causar la muerte súbita de los ratones.
2. Acondicione ratones adultos de 6 a 10 semanas de edad con 200 cGy (225 kV, 13,3 mA, 2 Gy totales [modo de control de dosis]) hasta 48 h antes de la inyección de las células.
3. En primer lugar, anestesiar a los ratones con inhalación de isoflurano en una cámara de inducción y mantener al 2% de isoflurano en oxígeno al 100% a un caudal de 1-2 L/min a través de un cono nasal para alcanzar un estado estable de anestesia. Verifique la profundidad de la anestesia con un reflejo de pellizco del dedo del pie y una respiración lenta y constante, y mantenga este estado durante todo el procedimiento de isoflurano.
   NOTA: Controle la profundidad de la anestesia cada 3-5 minutos durante todo el procedimiento para asegurarse de que no haya cambios en la frecuencia cardíaca y respiratoria con la manipulación quirúrgica y/o el pellizco de orejas, dedos de los pies y la cola. El color de las membranas mucosas y la piel se puede utilizar como indicador de oxigenación, ya que serán rosáceas si los ratones están en buen estado. Tenga cuidado cuando se coloquen cortinas opacas sobre el mouse, ya que no siempre es posible ver lo que está sucediendo con el mouse.
4. Antes del procedimiento, administre a los ratones 10 mg/kg de carprofeno por vía subcutánea para minimizar el dolor y caliente 0,5-1,0 ml de solución salina al 0,9% para el tratamiento de soporte.
5. Aplique ungüento oftálmico en los ojos del ratón para evitar la sequedad de la córnea.
6. Mantenga el mouse sobre una almohadilla térmica u otra superficie controlada termostáticamente para evitar la hipotermia durante el procedimiento.
   NOTA: Después del procedimiento, se utiliza una almohadilla térmica ajustable en temperatura. La temperatura corporal del ratón suele ser de 37-39 °C, y lo ideal es que la almohadilla sea ligeramente inferior a esta. En la práctica, la temperatura suele fijarse entre 32 y 36 °C.
7. Desinfecte toda la pierna que contiene el fémur que se va a inyectar con tres juegos de exfoliantes alternos (alternando con un exfoliante de povidona yodada o clorhexidina y esponjas de gasa empapadas en etanol al 70%).
   NOTA: 1) Si el operador es zurdo, el fémur izquierdo del ratón puede ser más fácil de inyectar que el fémur derecho. 2) En este estudio, el pelaje no se retiró para inyecciones para evitar daños innecesarios en la piel, y el sitio de entrada de la aguja se puede ubicar fácilmente sin cortar el pelaje. Sin embargo, en ratones con pelaje oscuro, puede ser difícil localizar el sitio de la punción, en cuyo caso, considere cortar el pelaje, ya que es rápido y fácil comenzar la inyección.
8. Pellizque el fémur suavemente con los dedos pulgar e índice para estabilizar la pierna. Empuje la tibia con el dedo anular o el quinto dedo para mantener la tibia doblada del fémur. El posicionamiento es importante para el éxito de la inyección (Figura suplementaria S1-S5).
   NOTA: Use fórceps para pellizcar el hueso y evitar lesiones en los dedos; Sin embargo, puede ser difícil sentir el cuerpo del fémur y agregará tiempo al procedimiento.
9. Inserte una aguja estéril vacía de 27 g (1/2 pulgada) con una jeringa adjunta justo debajo del tendón rotuliano para que la aguja quede firmemente alojada entre los dos cóndilos del fémur. Utilice el borde de la aguja y picotee ligeramente el tendón rotuliano en la parte superior del fémur un par de veces para encontrar el mejor lugar para insertar la aguja (Figura suplementaria S1-S5).
   NOTA: Es necesario conocer la anatomía del área de la rodilla del ratón antes de realizar este procedimiento. Los principiantes deben tomarse el tiempo para comprender la anatomía del área y practicar el procedimiento en un ratón sacrificado antes de intentarlo en un ratón vivo.
10. Gire la aguja hacia afuera y hacia arriba para asegurarse de que quede paralela a la diáfisis del fémur.
    NOTA: Esta maniobra proporciona un camino confiable a la cavidad de la médula, facilita la recuperación del contenido de la médula de la diáfisis femoral y minimiza las molestias para el animal durante el procedimiento.
11. Gire la aguja en círculos mientras avanza lentamente hacia la cavidad de la médula femoral. Inserte la aguja hasta que haya una reducción notable de la resistencia. Confirme la posición correcta de la aguja moviendo suavemente la jeringa lateralmente. Si es posible tocar el borde de la aguja con los dedos saliendo del hueso, regrese al paso 1.9 y busque otro ángulo y lugar para perforar la aguja.
    1. Asegúrese de que el ángulo de entrada de la aguja sea perpendicular a la cara del extremo del hueso.
       NOTA: Teóricamente, la aguja debe inyectarse paralela al fémur y debe estar en un ángulo de 90° con los extremos del hueso. Si hay resistencia de la superficie interior, la aguja se ha colocado correctamente en la cavidad femoral. Para asegurarse de que la aguja esté paralela al hueso, coloque una luz en el costado del hueso y observe la sombra del hueso paralela al eje de la aguja. La disminución de la resistencia al entrar en la cavidad de la médula ósea depende de la edad del ratón: cuanto más joven es el ratón, más fácil es reconocer la disminución de la resistencia.
12. Cree presión negativa tirando suavemente del émbolo de la aguja hacia atrás mientras mueve la aguja hacia adelante y hacia atrás dentro de la cavidad BM. Si la aguja está en la cavidad del médula ósea, saldrá algo de sangre/médula en la jeringa.
    1. Si no se ve la sangre/médula, cambie a una aguja nueva y trate de encontrar la misma ruta.
       NOTA: La razón para cambiar a una nueva aguja es que una vez que el hueso obstruye la aguja, se vuelve difícil verificar el reflujo de la sangre / médula. Minimizar el número de vías de inyección en la cavidad BM es crucial, ya que las células inyectadas en la médula ósea tienen el potencial de filtrarse fuera del fémur a través de los puntos de entrada anteriores. Si son necesarias varias vías de inyección, el riesgo de fuga puede reducirse inyectando las células gradualmente en lugar de un bolo rápido.
13. Retire la aguja lentamente e inserte la jeringa que contiene células por la misma ruta. Intente insertar la aguja hasta que se detenga (en el borde de la cavidad BM) y tire un poco hacia atrás (1-2 mm) desde allí para inyectar las células fácilmente. Antes de presionar el émbolo y liberar las células, aspire ligeramente y verifique si hay sangre/médula para asegurarse de la colocación correcta de la aguja. Primero revise el reflujo de la sangre/médula ósea y luego empuje la jeringa lentamente para inyectar las células.
    NOTAS: Es muy importante recordar la ruta y el ángulo de la primera inyección cuando se cambia a una nueva aguja. Si no se puede encontrar la misma ruta, inténtelo de nuevo con la aguja original utilizada para hacer la primera ruta. Se puede usar una aguja nueva en este momento, pero si se usa la aguja original, el hueso atascado debe empujarse una vez antes de usarlo. No use la aguja con las células para encontrar una nueva ruta para inyectar; De lo contrario, los trozos de hueso atascados en la aguja pueden impedir la dispersión de las células. Aunque la cavidad BM es muy pequeña, el volumen de inyección debe ser inferior a 30 μL, teniendo en cuenta la cavidad muerta.
    1. Asegúrese de que la velocidad de inyección sea lenta para evitar que el aire de la jeringa entre en la médula ósea y para evitar que las células se filtren por el lugar de la punción. Si siente resistencia al empujar la jeringa, mueva la aguja hacia arriba y hacia abajo para encontrar un área menos resistente en la cavidad.
14. Una vez que las células se hayan inyectado con éxito en el fémur, retire la aguja y la jeringa del ratón mientras mantiene la presión sobre la jeringa.
    NOTA: Vuelva a intentarlo con el otro fémur si no se puede completar la inyección. El procedimiento es muy estresante para el ratón, incluso bajo anestesia. Controle siempre los signos vitales (frecuencia cardíaca y respiratoria) del ratón e intente finalizar el procedimiento lo antes posible.
15. Retire el ratón del cono de la nariz y colóquelo sobre una toalla de papel limpia para evitar la aspiración de la ropa de cama. Durante la recuperación, mantenga el mouse sobre una almohadilla térmica u otra superficie controlada termostáticamente. Supervise todos los ratones para verificar la recuperación de la anestesia antes de volver a colocarlos en el estante del ratón.
    NOTA: No debería haber complicación ni angustia después de la aspiración si se hace correctamente. El procedimiento se completará cuando los ratones anestesiados se hayan recuperado y sean capaces de deambular y alcanzar la comida y el agua.
16. Observe a los ratones en busca de signos de angustia o infección después del procedimiento durante las próximas 24 horas. Los signos de angustia o infección incluyen sangrado constante, anemia y letargo. Si se observa alguno de estos signos después del procedimiento, eutanasiar al animal (s) por inhalación de CO₂ o dislocación cervical de acuerdo con el protocolo de manejo del animal.

2. Aspiración de células de médula ósea del fémur para el análisis FACS

NOTA: El procedimiento para aspirar las células BM de los ratones es muy similar a los métodos descritos en la sección 1 y se puede aprender de la literatura previa ^9,11,12. A continuación se presenta una descripción general de algunas diferencias entre los protocolos de inyección y aspiración de BM.

1. Prepare 500 μL de PBS + 10 mM de EDTA (medio de suspensión celular: CSM) por muestra para suspender la aspiración de BM.
2. Humedecer una jeringa de 0,5 mL y 27 g con CSM antes de aspirar el BM. Llene la jeringa con 200-500 μL de CSM y expulse inmediatamente. Repita este procedimiento 2-3 veces.
3. Aspire el BM suavemente retirando el émbolo de la jeringa, produciendo 20-50 μL de BM de ratón. A continuación, retire completamente la aguja del fémur y suspenda la muestra aspirada en CSM (500 μL en un tubo de 1,5 mL) para el siguiente paso de tinción. Retire el ratón del cono de la nariz y colóquelo sobre una toalla de papel limpia para evitar la aspiración de la ropa de cama durante la recuperación. Supervise todos los ratones para verificar la recuperación de la anestesia antes de volver a colocarlos en el estante del ratón.
   NOTA: La aspiración/muestreo de la médula ósea se puede repetir, pero el procedimiento de repetición el mismo día debe realizarse en el fémur opuesto para evitar traumatismos repetidos en la misma pierna. Aunque hay poca información sobre la frecuencia de la aspiración de MO, creemos que la aspiración de MO femoral generalmente se repite cada 4 semanas y se puede realizar al menos 3-4 veces en total sin ningún problema (por ejemplo, infección) según nuestra experiencia. Sin embargo, hay que tener en cuenta que la médula ósea en el lado contralateral de la médula ósea trasplantada generalmente tiene un menor injerto celular.
4. Las células granuladas de la médula ósea se aspiran mediante un centrifugado de 5 minutos a 300 × g, 4 °C.
5. Aspire el sobrenadante, añada 0,5-1 mL de tampón de lisis ACK (150 mM NH₄Cl, 10 mM KHCO₃, 0,1 mM EDTA) a cada tubo y vórtice para resuspender las células. Coloque sobre hielo durante 5-10 min.
6. Filtre cada tubo a través de la malla de nailon en un tubo nuevo.
7. Enjuague el tubo con 1 ml de tampón FACS y agréguelo a través de la malla de nailon en un tubo nuevo también.
8. Las células de pellets giran 5 min a 300 × g, 4 °C.
9. Aspirar el sobrenadante y añadir la solución de tinción que contenga los anticuerpos deseados¹³. Colocar en hielo durante 20 min.
10. Lave las células y analícelas según la configuración experimental.
    1. Lavar las células con tampón FACS (PBS, 2% FBS, 2 mM EDTA) y teñirlas con anticuerpos durante 30 min en hielo en un volumen total de 50 μL. Lavar y teñir las células con yoduro de propidio (PI) a una concentración final de 1 μg/mL inmediatamente antes del análisis o la clasificación. Realice análisis posteriores a la clasificación para verificar la pureza de las poblaciones de células clasificadas.
       NOTA: Todos los anticuerpos utilizados para la citometría de flujo se detallan en la Tabla de Materiales.
    2. Utilice las siguientes estrategias de compuerta FACS (Figura 2-7) para analizar las células injertadas de la médula ósea del ratón.
       1. Distinga las poblaciones de celdas por sus propiedades de dispersión frontal (tamaño) y lateral (granularidad).
       2. Realice la discriminación de dobletes trazando FSC-H frente a FSC-W, siguiendo SSC-H frente a SSC-W.
       3. Excluir las células muertas.
       4. Distinguir poblaciones de células por CD45 humano y CD45 de ratón. Estas combinaciones de tinción de anticuerpos permiten la detección de CD3, CD19 y CD33 humanos, así como dentro de la fracción CD45 humana.
          NOTA: Antes de teñir las muestras, recuerde utilizar bloques Fc de ratón y humanos para evitar la unión de anticuerpos inespecíficos. Solemos teñir con los bloques Fc (ratón + humano) durante 10 min en hielo y luego añadimos los anticuerpos sin lavar las células. Consulte las instrucciones de cada compañía sobre cómo usar los anticuerpos del bloque Fc.

Resultados

Siguiendo estos protocolos 1,14,15,16,17,18,19,20, se trasplantó cada muestra y se estableció el modelo de ratón xenoinjerto. El objetivo de los experimentos fue mostrar la inyección de FI con varios tipos de células humanas y la posterior aspiración/anális...

Discusión

Los modelos de xenoinjertos murinos son importantes para el estudio de la hematopoyesis humana tanto normal como patológica. La MO es la fuente de hematopoyesis³; por lo tanto, el estudio de las enfermedades hematológicas requiere el injerto exitoso de células madre humanas raras en el BM murino. Hasta ahora, se han descrito métodos de trasplante como la vena de cola, la vena retroorbitaria y la inyección de FI, y se sabe que cualquiera de estos métodos puede inje...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Jeringa de 1/2 mL, 27 g	BD	305620	https://www.bd.com/en-ca/offerings/capabilities/bd-luer-lok-syringe-with-attached-needle/305620
ACK Tampón de lisado	Qualoty Biological	118-156-101CS	https://www.qualitybiological.com/product/ack-lysing-buffer/
Irradiador biológico	Kimtron	IC-250	https://www.kimtron.com/ic-250
Clorhexidina	Nolvasan	NDC 54771-8701-1
https://www.zoetisus.com/products/petcare/nolvasan-skin-and-wound-cleanser Alcohol etílico, prueba 190	Gold Shield		https://goldsd.com/line-card/
FACSCanto II	(Becton Dickinson and Company (BD), Franklin Lakes, NJ, EE. UU
. Suero fetal bovino (FBS)	Omega Scientific	FB-01	https://www.omegascientific.com/product/fetal-bovine-serum-usda-certified/
Citómetro de flujo, AriaII	Beckton Dickinson (BD)		clasificación de células
IMDM	Gibco	12440053	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/12440053
Isoflurano, USP	Dechra	NDC 17033-094-25	https://www.dechra-us.com/our-products/us/companion-animal/dog/prescription/isoflurane-usp-inhalation-anesthetic
NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) ratones	Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, USA	br/> Cepa #:005557	Macho o hembra de seis a diez semanas de edad
Pomada oftálmica, USP	Bausch Lomb	NDC 24208-780-55	https://www.bausch.com/contentassets/2914df881e4344a 7a202cc5a0673c977/neomycin-and-polymyxin-b-sulfates-gramicidin-ophthalmic-solution.pdf
OstiFen Inyección (Caprofeno)	VetOne	NDC 13985-748-20	http://vetone.net/Default/CatHeaderPage?id=9534ccca-eac5-4d68-8ad8-46436067587b
PBS, pH 7.4	Casero
Penicilina-estreptomicina	Gibco 15140122		https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122
Povidona yodada	Betadine	NDC 67618-155-16	https://www.betadine.com/veterinary-surgical-scrub-and-solution/
TokeOni (en los EE. UU.)	Sigma-Aldrich	808350-5MG	AkaLumine-HCl/Akaluc; https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/808350
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0	Invitrogen	15575020	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15575020
Engraftment antibody panel (in vivo, médula ósea de ratón)
Antígeno			Dilución
Antígeno: Anti-humano CD45 fluoróforo: V450 Clone: HI30	BD Biosciences	560367	1:25
Antígeno: Anti-ratón CD45.1 Fluorophore: PE-Cy7 Clone: A20	eBioscience	25-0453-81	1:50
Antigen:Anti-ratón TER-119 Fluorophore: PE-Cy5 Clone: TER-119	eBioscience	15-5921-83	1:100
Antígeno: Anti-humano CD3 Fluoróforo: APC-Cy7 Clone: SK7	BD Biosciences	341090	1:12.5
Antigen:Anti-humano CD19 Fluorophore: APC Clone: HIB19	BD Biosciences	555415	1:25
Antígeno:Anti-humano CD33 Fluoróforo: PE Clon: WM53	BD Biosciences	555450	1:25
Vivo/Muerto tinción			Conc.
PI	Invitrogen		1 y mu; g/mL
Cuentas de compensación
Control negativo	BD Biosciences Consulte las		instrucciones para obtener más detalles
Anti-ratón Ig, κ	BD Biosciences Consulte las		instrucciones para obtener más detalles