Summary
Canlı hücre analiz sistemini kullanarak nötrofil hücre dışı tuzaklarını (NET'ler) ölçmek için membran geçirgenliğine bağlı çift boya yaklaşımıyla birleştirilmiş otomatik bir yüksek verimli yöntem sunuyoruz.
Abstract
Nötrofiller, doğuştan gelen bağışıklık sisteminin çok önemli bir bölümünü oluşturan miyeloid soy hücreleridir. Son on yılda, nötrofillerin, antimikrobiyal savunmada çok önemli yapılar olan nötrofil hücre dışı tuzakların (NET'ler) oluşumu da dahil olmak üzere çoklu mekanizmalar yoluyla immün düzensizliğin başlatılmasına ve sürdürülmesine katkıda bulunarak kanser, otoimmün hastalıklar ve çeşitli akut ve kronik inflamatuar durumların patogenezinde oynadığı ek kilit roller ortaya çıkmıştır. NET oluşumunu tarafsız, tekrarlanabilir ve verimli bir şekilde ölçme tekniklerindeki sınırlamalar, nötrofillerin sağlık ve hastalıklardaki rolünü daha iyi anlama yeteneğimizi kısıtlamıştır. Hücre içi ve hücre dışı DNA'yı görüntülemek için iki farklı DNA boyası kullanan bir membran geçirgenliğine bağlı çift boya yaklaşımı ile birleştirilmiş bir canlı hücre görüntüleme platformu kullanarak NET oluşumuna uğrayan nötrofillerin miktarını belirlemek için otomatik, gerçek zamanlı, yüksek verimli bir yöntem açıklıyoruz. Bu metodoloji, nötrofil fizyolojisinin değerlendirilmesine ve NET oluşumunu hedefleyebilen moleküllerin test edilmesine yardımcı olabilir.
Introduction
Nötrofil hücre dışı tuzaklar (NET'ler), çeşitli enflamatuar uyaranlara yanıt olarak nötrofillerden ekstrüde edilen ağ benzeri kromatin yapılardır. NET'ler, enfeksiyöz patojenleri yakalayan ve öldüren ve inflamatuar yanıtları tetikleyen DNA, histonlar ve çeşitli anti-mikrobiyal proteinler/peptitlerden oluşur1.
NET'ler patojenlere karşı konak savunması için faydalı olmakla birlikte, çeşitli otoimmün hastalıkların2, tromboz3, metabolik hastalıkların4 ve kanserlerin metastatik büyümesinin5 potansiyel bir itici gücü olarak dikkat çekmiştir. Bu nedenle, NET oluşumunun inhibisyonu bu hastalıklar için potansiyel bir terapötik seçenektir. Bununla birlikte, gelişim6'daki bazı umut verici NET hedefleme moleküllerine rağmen, bu mekanizmayı spesifik olarak etkileyen onaylanmış bir tedavi hala yoktur. Bu, en azından kısmen, NET oluşumu için nesnel, tarafsız, tekrarlanabilir ve yüksek verimli niceleme yöntemlerinin eksikliğine atfedilebilir.
Çift renkli canlı hücre görüntüleme platformu 7,8 kullanan yeni bir yöntem oluşturduk ve raporladık. Membran geçirgen nükleer boya ve membran geçirimsiz DNA boyası ile boyanmış nötrofillerin hızlandırılmış görüntüleri yazılım tarafından analiz edilir ve NET oluşturma öncesi ve sonrası nötrofillerin sayıları birden fazla zaman noktasında sayılır. PKCa aracılı Lamin B ve CDK4/6 aracılı Lamin A/C demontajı9'un düzenlenmesi ile NET oluşumu sırasında plazma zarının bütünlüğü kaybolduğundan, NET oluşturan nötrofiller membran geçirimsiz DNA boyası ile boyanırken, sağlıklı nötrofiller boyanmaz. Bu yöntem, NET oluşumunu ölçmek için daha önce bildirilen tekniklerin sorunlarının üstesinden gelir ve otomatik bir şekilde tarafsız, yüksek verimli, tekrarlanabilir ve doğru NET nicelemesi sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Sağlıklı insan deneklerden alınan nötrofiller, Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB) onaylı protokol kapsamında bilgilendirilmiş onam verildikten sonra elde edildi. Protokol, NIH insan araştırmaları etik komitesinin yönergelerini takip eder.
1. Nötrofillerin boyanması ve test plağının hazırlanması
- Her enstitünün kılavuzunu izleyerek uygun yazılı bilgilendirilmiş onam ile periferik kan alın ve istenen herhangi bir yöntemi kullanarak nötrofilleri izole edin. Örneğin, Ficoll-dekstran yöntemi10,11, nötrofillerin insan periferik kanından izolasyonu için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir.
NOT: Burada tartışılan yöntem insan nötrofillerini kullansa da, fare nötrofilleri de benzer bir protokol kullanılarak analiz edilebilir. - Roswell Park Memorial Enstitüsü'nde nötrofiller (RPMI; Malzeme Tablosuna bakınız) 1640 ortamında 2.0 x 106 nötrofil / mL'de yeniden süspanse edin ve nötrofil süspansiyonunu 1.5 mL santrifüj tüpüne yerleştirin.
NOT: Genellikle kültür ortamına fetal sığır serumu (FBS) eklemiyoruz çünkü FBS'deki albümin NET oluşumunu12 azaltabilir ve FBS'deki ısıya dayanıklı nükleaz NET'leri13 bozabilir. - 1.5 mL nötrofil süspansiyonu başına 1 μL'de membran geçirgen kırmızı DNA boyası ( Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin.
- Karanlıkta 5 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 2500 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın.
- Nötrofilleri 1 mL RPMI'de yeniden süspanse edin, ardından oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 2500 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın. 2x tekrarlayın (toplam 3x yıkayın).
- Nötrofilleri 1 mL RPMI'de yeniden süspanse edin ve bir hücre sayacı kullanarak sayın. Nötrofil süspansiyonunu 1.5 x 105 nötrofil / mL'ye seyreltin.
- 1 mL nötrofil süspansiyonu başına 4 μL 1:100 önceden seyreltilmiş membran geçirimsiz yeşil DNA boyası ( Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin.
- Kuyucuk başına 100 μL nötrofil süspansiyonunu berrak doku kültürü ile muamele edilmiş 96 oyuklu bir plakaya koyun (bkz. Her koşulu üç kopya halinde ayarlayın.
NOT: Nötrofiller poli-L-lizin kaplamalı veya kaplamasız plakalara yerleştirilirse, bu yöntemle NET oluşumu ve miktar tayininde hiçbir fark olmadığını daha önce7 göstermiştik. Bu nedenle doku kültürü ile tedavi edilmiş plak kullanımı bu yöntem için yeterlidir. - İnhibitörlü veya inhibitörsüz uyarıcı reaktifler içeren 100 μL RPMI veya ilgili kuyucuklara ilgilenilen başka herhangi bir reaktif ekleyin. Her zaman 500 nM forbol 12-miristat 13-asetat (PMA) veya 2.5 μM kalsiyum iyonofor (A23187) eklenerek pozitif kontrol kuyuları kullanın, burada 30 μM AKT inhibitörü kullanılmıştır.
- Plakayı% 5 CO2 inkübatörde bulunan canlı hücre analiz sistemine (Malzeme Tablosuna bakınız) yerleştirin.
NOT: Bu adımdan birkaç dakika sonra plakanın üstünde ve altında yoğuşma görünebilir. Bu, doğru görüntülemeyi engelleyebilir. Taramaya başlamadan önce yoğuşmayı iyice silin ve giderin. Plakayı makineye yerleştirin, yazılımı başlatın, tarama protokolünü girin ve ardından ilk taramadan hemen önce plakayı silin.
2. NET oluşturan nötrofilleri görselleştirmek için tarama plakası
- Yazılımı başlatın (yazılım ayrıntıları için Malzeme Tablosuna bakın). Sol üst köşedeki + tuşuna basarak Add Vessel'i başlatın.
- Zamanında Tara'yı seçin. Yeni'yi seçin.
NOT: Bu oluşturulduktan sonra, Öncekini Kopyala'yı seçerek ve bir sonraki ekranda saklanan protokolü seçerek aynı tarama protokolünü çalıştırın. - Standart'ı seçin. Tarama ayarlarını şu şekilde ayarlayın: Hücre Hücre seçenekleri: Yok; Görüntü kanalları: Faz, Yeşil (Edinme Süresi: 200 ms), Kırmızı (Edinme Süresi: 400 ms); Amaç: 20x.
- Listeden kullanılan plakayı seçin. Plakanın canlı hücre görüntüleme sisteminin tepsisine yerleştirileceği damar konumunu seçin.
- Numunelerin bulunduğu kuyuları seçin ve kuyu başına kaç görüntü alacağınıza karar verin. Kuyucuk başına görüntü sayısına bağlı olarak, plaka için tahmini bir tarama süresi oluşturun. Genellikle, kuyu başına 4 görüntü yeterlidir; Ancak bu, taramaların koşullarına ve sıklığına bağlı olarak değişebilir.
- Etüt için bir ad sağlamak üzere Plaka Haritası Oluştur'a tıklayarak her bir kuyucuktan gelen bilgileri (örneğin, hücre tipi ve bileşik) girin.
NOT: Plaka haritası, yazılımdaki plaka haritası düzenleyicisi kullanılarak önceden hazırlanabilir ve kaydedilebilir. Kaydedilen plaka haritası verileri bu adımda içe aktarılabilir. İstenirse plaka harita bilgilerinin girilmesi atlanarak daha sonra gerçekleştirilebilir. Plaka yerleşimi bilgisi girilmeden de veri elde edilebilir. Bununla birlikte, sonraki analizi kolaylaştırmak için plaka bilgilerinin girilmesi önerilir. - Sonraki ekranda, analiz türü olarak Temel Çözümleyici'yi seçin ve daha önce kullanılan analiz tanımlarını (tarama protokollerini değil) gösteren açılır listeden Analiz Protokolü'nü seçin. Hem yeşil hem de kırmızı için spektral karışım %0,0'da bırakılabilir.
NOT: İstenirse bu adım atlanabilir. - Taramayı zamanlayın. Buradaki deney için, 8 saat boyunca her 15-20 dakikada bir tarayın. Ekranın üst kısmındaki beyaz ve gri çubuğu sürükleyerek taramanın başlama zamanını ayarlayın.
NOT: Çok sık taramaktan kaçının, aksi takdirde makine aşırı ısınma nedeniyle düzgün çalışmayabilir. Tarama süresi 24 saatte 12 saati geçmemelidir. Tarama çok sıksa bir uyarı görebilirsiniz. - Bir sonraki ekranda tarama ayarını kontrol edin ve taramayı başlatmak için Programa Ekle'ye basın. Her şeyin yolunda gidip gitmediğini onaylamak için ilk görüntü seti taranana kadar bekleyin.
- Bazen hücreler düzgün bir şekilde odaklanmayabilir. Bu durumda, yoğuşma olup olmadığını kontrol edin (ve buna göre silin), plakanın tepsiye doğru yerleştirilip yerleştirilmediğini veya plakanın konumunun doğru şekilde belirtilip belirtilmediğini vb. kontrol edin. Hücreler hala yüzüyorsa ve kuyunun dibine yerleşmemişse, taramadan önce yaklaşık 5 dakika bekleyin.
3. NET'leri ölçmek için analiz tanımının ayarlanması
- Analiz edilecek çalışmayı (gemiyi) Görünüm sekmesinde açın. Ekranın solundaki Analizi Başlat'a basın. Yeni Analiz Tanımı Oluştur'u seçin.
- Daha önce bir analiz gerçekleştirilmişse, Varolan Analiz Tanımını Kopyala'yı seçerek küçük değişikliklerle aynı analiz tanımını kullanın. Bu durumda, adım 3.3'e gidin. Analizi herhangi bir değişiklik yapmadan kullanıyorsanız, Mevcut Analiz Tanımını Kullan'ı seçin; Bu önerilmez, çünkü floresan seviyesi farklı günlerdeki tahliller arasında değişebilir ve genellikle bazı küçük düzeltmeler gereklidir.
- Temel Çözümleyici'yi seçin. Tüm görüntü kanallarını kullanın: Faz, Yeşil, Kırmızı ve Örtüşme.
NOT: NET'leri saymak için genellikle yeşil ve kırmızı nesne maskeleri kullansak da, enkaz önemli olduğunda üst üste binen nesne maskesi kullanışlıdır. Bu gibi durumlarda, çakışan nesne sayısı sayısı yeşil nesne sayısı yerine pay olarak kullanılacaktır (bkz. adım 3.9). Yeşil nesne sayısı yerine örtüşen nesne sayısı kullanılırsa, tüm kırmızı sinyallerin doğru şekilde sayılması gerekir. Daha sonraki zaman noktalarında çekilen görüntülerde düşük kırmızı sinyale sahip tüm kırmızı nesneleri saymak için kırmızı sinyal ayarını yapın, ancak kalıntıları saymayın. - Eğitim için 6 - 8 temsili örnek görüntü seçin. Buradaki deney için aşağıdaki görüntüleri ekleyin:
NET oluşturmayan nötrofillerde üretilebilecek ince yeşil sinyalleri telafi etmek için yeşil sinyal ayarını optimize etmek için 0 ila 20 dakika arasında çekilen görüntüler
NET oluşturan nötrofilleri tanımlamak için yeşil sinyal ayarını optimize etmek için 3-6 saat arasında (kullanılan stimülasyona bağlı olarak değişir) alınan pozitif kontrollü maksimum NET'lerin görüntüleri
Nükleer kırmızı sinyal 1 saat zaman noktası civarında en güçlü olduğundan (tüm hücreler kuyunun dibine yerleştiğinde) toplam hücre sayısını (kırmızı boya ile boyanmış) saymak için 1 saat zaman noktasında çekilen görüntüler ve hücre ölümü nedeniyle kademeli olarak azalır.
Enkaz içeren görüntüler, sayılmalarını önlemek için. - Analiz tanımını ayarlayın. Kırmızı nesneler ve yeşil nesneler, sırasıyla tüm nötrofillerin ve NET'leri oluşturanların çekirdeklerine karşılık gelir. Aşağıdaki örnekle başlayın ve Geçerli Önizleme veya Tümünü Önizle'ye basın ve sonuçları optimize etmek için her parametreyi değiştirin:
Yeşil için: Segmentasyon- Arka plan çıkarma: Üst Şapka; Yarıçap: 100 μM; Eşik: 0,3 GCU; Kenar bölme: Açık; Kenar hassasiyeti: -20; Temizleme -Delik dolgusu: 100μm2; Boyutu 0 piksel olarak ayarlayın; Filtreler- Alan: min 20 μm2, max 500 μm2; Eksantriklik: maksimum 0.97; Ortalama Yoğunluk: min 1.00
Kırmızı için: Segmentasyon- Arka plan çıkarma: Üst Şapka; Yarıçap: 10 μM; Eşik: 1,0 GCU; Kenar bölme: AÇIK; Kenar hassasiyeti: -50; Temizleme Deliği dolgusu: 50 μm2; Boyutu 0 piksel olarak ayarlayın; Filtreler- Alan: min 20 μm2, max 400 μm2; Ortalama Yoğunluk: min 1.5.- NET oluşturmaması gereken nötrofillerde aşırı yeşil sinyal belirirse (örneğin, 0 dakikada lobülasyonlu çekirdeklere sahip uyarılmamış nötrofiller), bunun nedeni yeşil kanalda tespit edilen kırmızı sinyalin taşması olabilir. Böyle bir durumda, adım 3.1'e dönün, ekranın solundaki Görüntü Katmanları'nı açın ve Spektral Karıştırmayı kullanarak yeşil kanaldaki kırmızı sinyalleri kaldırın.
- Diğer bir seçenek de, kırmızı sinyalin ne kadarının yeşil kanaldan çıkarılması gerektiğini netleştirmek için nükleer kırmızı boya ile tek boyama için bir kuyu ayarlamaktır. Öte yandan, genellikle kırmızı kanala yeşil sinyal sızması analizleri etkilemez.
NOT: Kırmızı sinyale duyarlılığın düşük olması ve daha sonraki zaman noktalarında (örn. 6 saatlik zaman noktası) çekilen görüntülerde tüm kırmızı sinyallerin yakalanmaması önemli değildir. Her görüntüdeki maksimum kırmızı nesne sayısı, görüntüdeki toplam nötrofil sayısı olarak kabul edilir ve adım 3.9'da payda olarak kullanılacaktır. Genellikle, nükleer kırmızı sinyaller 1 saat zaman noktası civarında zirve yapar ve hücre ölümü nedeniyle yavaş yavaş azalır (Şekil 1B). Bu nedenle, maksimum kırmızı sinyale sahip görüntülerdeki kırmızı nesneleri doğru bir şekilde saymak için kırmızı sinyal ayarını yapın.
- Analiz edilecek tarama sürelerini ve kuyuları seçin. Genellikle, tüm zaman noktaları ve kuyular analiz edilmelidir. Analiz tanımına bir etiket sağlayın.
- Özeti kontrol edin ve analizi başlatın. Analizin tamamlanması birkaç saat sürer (süre, zaman noktalarının ve kuyuların sayısına bağlıdır). Başlatıldıktan sonra, analiz tanımının adı Görünüm sekmesinde çalışmanın adının altında gösterilecek ve tamamlandığında tam tarih gösterilecektir.
- Tamamlandıktan sonra, analiz tanımının adına çift tıklayarak analiz edilen etüdü açın. Ekranın solundaki Katmanlar'ı açın ve her hücrenin doğru şekilde işaretlenip işaretlenmediğini kontrol edin. Doğru şekilde işaretlenmemişse, adım 3.1'e dönün ve sonraki adımları tekrarlayın.
- Verileri dışa aktarmak için ekranın solundaki Grafik Metrikleri'ne tıklayın. Yeşil Sayım, Kırmızı Sayım veya Çakışma Sayısı (Görüntü Başına) öğesini seçin ve ardından dışa aktarılacak zaman noktalarını ve kuyuları seçin. Gruplandırmayı seçmek için, tarama yapıldığında tüm kuyucuklar doğru bir şekilde belirtilmişse Plaka Haritası Çoğaltır'ı seçin.
- Verileri dışa aktarın. Uygun bir yazılım kullanarak aşağıdaki denklemle her koşul/zaman noktası için NET oluşturan hücrelerin yüzdesini hesaplayın.
NOT: Paydanın maksimum kırmızı nesne sayısı olmasının nedeni, Kırmızı nesne sayısının yaklaşık 1 saatlik zaman noktasında zirve yapması ve hücre ölümü nedeniyle kademeli olarak azalmasıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu yöntem, her zaman noktasında alınan faz kontrastlı, kırmızı floresan (membran geçirgen boya) ve yeşil floresan (membran geçirimsiz boya) görüntüler sağlar. NET oluşturma işlemi ile birlikte, faz kontrastı ve kırmızı floresan görüntülerde morfolojik değişiklikler gözlenir ve membran bir kez ihlal edildiğinde yeşil floresan gözlemlenebilir (Şekil 1). Bu tahlilde, NET oluşturan nötrofiller ağ benzeri bir yapı oluşturmak yerine genellikle yuvarlaktır. Bunun nedeni, makinenin çözünürlüğünün ince ağ benzeri yapıyı yakalayacak kadar yüksek olmaması ve membran geçirimsiz yeşil boyanın, membran kırıldıktan sonra serbest bırakılmadan önce kromatini lekelemesidir. Daha önce7 4 saatlik inkübasyondan sonra elde edilen 96 oyuklu plaklarda NET'lerin konfokal görüntüleme kullanılarak görüntülenebileceğini göstermiştik.
Analiz tanımı uygun şekilde ayarlandığında, görüntüdeki tüm nötrofiller kırmızı nesne olarak işaretlenir ve NET oluşturan nötrofiller yeşil nesne olarak işaretlenir (Şekil 2). Makine, her zaman noktasındaki kırmızı ve yeşil nesnelerin sayısını sayar. NET oluşumunun zaman seyri, her bir zaman noktasında NET oluşturan nötrofillerin yüzdesi çizilerek görselleştirilir (Şekil 3). NET oluşumunu hedefleyen potansiyel moleküller (örneğin, AKT inhibitörü) bu metodoloji kullanılarak yüksek verimli bir şekilde test edilebilir.
Şekil 1: NET oluşumuna uğrayan nötrofillerdeki morfolojik değişiklikler. (A) 3 saat boyunca 2.5 μM kalsiyum iyonofor ile uyarılan insan periferik kan nötrofilleri. (B) Faz kontrast görüntüsünün, kırmızı kanalın (membran geçirgen nükleer boya), yeşil kanalın (membran geçirimsiz DNA boyası) ve birleştirilmiş görüntünün temsili tek hücreli görünümleri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Nötrofillerin ve NET'lerin yazılım tarafından tanınmasını gösteren temsili görüntüler. İnsan sağlıklı gönüllülerden alınan nötrofiller, 1 saat boyunca 2.5 μM kalsiyum iyonofor ile uyarıldı. Faz kontrast görüntülemenin üst üste bindirilmiş görüntüleri ve her bir sinyal veya maske gösterilir. Çekirdekler (A) membran geçirgen kırmızı boya ile boyandı ve yazılım (B) çekirdekleri mavi olarak tanıdı ve saydı, NET'ler (C) membran geçirimsiz yeşil boya ile boyandı ve yazılım onları (D) mor olarak işaretledi. (E) aşırı algılama veya (F) az algılama meydana gelirse, parametrenin değiştirilmesi gerekebilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: NET oluşturan nötrofillerin yüzdesinin zaman seyri. Nötrofiller, NET'leri indüklemek için 25 nM forbol 12-miristat 13-asetat (PMA) veya 2.5 μM kalsiyum iyonofor ile uyarıldı veya RPMI'de uyarılmadan bırakıldı. NET oluşumunu engellemek için 30 μM AKT inhibitörü ilavesi yapıldı. Görüntüler yazılım tarafından 6 saat boyunca her 20 dakikada bir elde edildi. NET oluşturan hücrelerin yüzdesi, yeşil nesne sayısının (= NET oluşturan hücrelerin sayısı) kırmızı nesne sayısına (= tüm nötrofillerin sayısı) bölünmesiyle hesaplandı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
NET'leri ex vivo ölçmek için mevcut yöntemlerin, nötrofilleri, NET'leri ve potansiyel terapötik hedefleri tarafsız ve yüksek verimli bir şekilde inceleme yeteneğimizi sınırlayan çeşitli dezavantajları vardır10,14. Örneğin, NET'lerin miktar tayini için altın standart olarak kabul edilen immünofloresan boyamadan sonra NET oluşturan hücrelerin doğrudan sayımı düşük verimlidir ve operatörün öznel görüşüne bağlıdır. Membran geçirimsiz DNA boyasının floresansını saptayan bir plaka testi, hücre dışı DNA'yı NET'lerin vekil belirteci olarak objektif ve yüksek verimli bir şekilde ölçer, ancak bu yöntemle morfolojik bilgi elde edilemediğinden, diğer hücre ölümü türleri tarafından DNA salınımı yanlış bir şekilde NET olarak kabul edilebilir. Öte yandan, yöntem NET'lerin yüksek verimli ve nesnel nicelleştirilmesini sağlar7. Nötrofillerin morfolojik değişimleri ve zaman seyri hakkında bilgi edinilebildiği göz önüne alındığında, NET'ler diğer hücre ölümü türlerinden doğru bir şekilde ayırt edilebilir. Son yıllarda yayınlanan makaleler NET'lerin çeşitli hastalıklardapatojenik rolünü öne sürmüştür 2,3,4,5 ve NET'lerin inhibisyonu şu anda potansiyel olarak umut verici bir tedavi hedefi olarak kabul edilmektedir6. Yöntem, çoklu NET hedefleme moleküllerini hızlı ve tarafsız bir şekilde keşfetmek için faydalı olacaktır.
Başarılı bir niceleme için birkaç kilit nokta vardır. Membran geçirgen DNA bağlayıcı boya seçimi doğru görüntüleme için çok önemli bir faktördür. Bazı boyalar sitotoksiktir ve diğer boyaların çekirdeğe nüfuz etmesi zaman alır. NET oluşumu nispeten hızlı olduğundan, boyanın çekirdeğe hızlı bir şekilde nüfuz etmesi gerekir. Bu faktörleri göz önünde bulundurarak nükleer bir kırmızı boya seçtik (Malzeme Tablosuna bakınız). Her kuyucuktaki hücre sayısı da doğru sayım için önemlidir. Çok kalabalıksa, her nötrofilin yeşil ve kırmızı sinyalleri birbiriyle örtüşür ve bu da her bir nötrofilin ayrı ayrı sayılmasını zorlaştırır.
Bu yöntemin birkaç sınırlaması vardır. Bu tahlilde tahlil içi değişkenlik mükemmel olsa da, tahliller arası değişkenlik belirsizdir. Bunun nedeni, nötrofillerin, tüm koşullar tutarlı tutularak aynı donörden izole edilse bile, farklı günlerde farklı davranması ve başka bir günde yapılan tahliller arasında bazı farklılıklar olabilmesidir. Bu nedenle, farklı günlere ait verilerin birleştirilmesi gerekiyorsa, tahlili dikkatli bir şekilde tasarlamak gerekir: örneğin, her gün hastalık ve kontrol gruplarından aynı sayıda numuneyi dahil etmek. Ek olarak, analiz tanımı tanımlandıktan sonra NET oluşumunun değerlendirilmesi objektif olsa da (3. adım), tanımın kendisinin ayarlanması bir şekilde her operatörün öznel görüşüne bağlıdır. Adım 3.3 ve 3.4, öznel yargıları dışlamak ve tahliller arası değişkenliği mümkün olduğunca küçük tutmak için kritik adımlardır. Ayrıca, tüm NET'leri saymak için uygun kesmeyi ayarlamak için her seferinde pozitif bir kontrol (örneğin, 500 nM PMA veya 2.5 μM kalsiyum iyonoforu tarafından uyarılan nötrofiller) dahil edilmelidir.
Öte yandan, diğer hücre ölümü türlerinin NET olarak sayılabileceğine dikkat edilmelidir. Hücre zarı ihlal edildiğinde veya DNA hücre dışı boşluğa salındığında, yeşil sinyaller gözlenecektir. Hücreler nekrotik hücre ölümüne uğradığında veya apoptotik hücreler ikincil nekroza uğradığında, DNA'ları yeşil boya7 ile boyanacaktır. Bu tür hücre ölümlerinin yanlış bir şekilde dahil edilmesini önlemek için, zaman seyri ve morfolojik değişiklikler dikkate alınmalıdır. Apoptotik hücrelerin sekonder nekroz gerçekleştirmesi genellikle 8 saatten fazla sürerken, NET oluşumu stimülasyondan sonra 3-6 saat arasında zirve yapar15. Faz kontrast görüntüleme ile belirgin morfolojik değişiklikler görülebilir, bu da hücre ölümütipinin farklılaşması için faydalıdır 7.
Genel olarak, yöntem NET'leri yüksek verimli ve objektif bir şekilde doğru bir şekilde ölçmemizi sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların rekabet eden finansal çıkarları yoktur.
Acknowledgments
Ulusal Artrit ve Ulusal Sağlık Enstitüleri Kas-İskelet ve Deri Hastalıkları Enstitüsü Bilim ve Teknoloji Ofisi'ndeki Işık Görüntüleme Bölümüne teşekkür ederiz. Bu araştırma, Ulusal Artrit ve Ulusal Sağlık Enstitüleri Kas-İskelet ve Deri Hastalıkları Enstitüsü'nün (ZIA AR041199) İntramural Araştırma Programı tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AKT inhibitor | Calbiochem | 124028 | |
| Clear 96-well plate | Corning | 3596 | |
| Live cell analysis system | Sartorius | N/A | Incucyte Software (v2019B) |
| Membrane-impermeable DNA green dye | Thermo Fisher Scientific | S7020 | |
| Nuclear red dye | Enzo | ENZ-52406 | Neutrophil pellet becomes bluish after staining. |
| RPMI | Thermo Fisher Scientific | 11835030 | Phenol red containig RPMI can be used. |
References
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Wigerblad, G., Kaplan, M. J. Neutrophil extracellular traps in systemic autoimmune and autoinflammatory diseases. Nat Rev Immunol. 23 (5), 274-288 (2022).
- Wagner, D. D., Heger, L. A. Thromboinflammation: From atherosclerosis to COVID-19. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 42 (9), 1103-1112 (2022).
- Njeim, R., et al. NETosis contributes to the pathogenesis of diabetes and its complications. J Mol Endocrinol. 65 (4), R65-R76 (2020).
- De Meo, M. L., Spicer, J. D. The role of neutrophil extracellular traps in cancer progression and metastasis. Semin Immunol. 57, 101595 (2021).
- Nakabo, S., Romo-Tena, J., Kaplan, M. J. Neutrophils as drivers of immune dysregulation in autoimmune diseases with skin manifestations. J Invest Dermatol. 142 (3 Pt B), 823-833 (2022).
- Gupta, S., Chan, D. W., Zaal, K. J., Kaplan, M. J. A high-throughput real-time imaging technique to quantify NETosis and distinguish mechanisms of cell death in human neutrophils. J Immunol. 200 (2), 869-879 (2018).
- Nakabo, S., Kaplan, M. J., Gupta, S. Quantification of neutrophils undergoing NET formation and distinguishing mechanisms of neutrophil cell death by use of a high-throughput method. Methods Mol Biol. 2543, 129-140 (2022).
- Singh, J., et al. Moonlighting chromatin: when DNA escapes nuclear control. Cell Death Differ. 30 (4), 861-875 (2023).
- Carmona-Rivera, C., Kaplan, M. J.
- Hsu, A. Y., Peng, Z., Luo, H., Loison, F. Isolation of human neutrophils from whole blood and buffy coats. J Vis Exp. (175), 62837 (2021).
- Neubert, E., et al. Serum and serum albumin inhibit in vitro formation of neutrophil extracellular traps (NETs). Front Immunol. 10, 12 (2019).
- von Kockritz-Blickwede, M., Chow, O. A., Nizet, V. Fetal calf serum contains heat-stable nucleases that degrade neutrophil extracellular traps. Blood. 114 (25), 5245-5246 (2009).
- Zhao, W., Fogg, D. K., Kaplan, M. J. A novel image-based quantitative method for the characterization of NETosis. J Immunol Methods. 423, 104-110 (2015).
- Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nat Rev Immunol. 18 (2), 134-147 (2018).
