Method Article

Uso de un sistema de perfusión tisular in vitro para detectar las actividades funcionales de tubos intestinales aislados en tiempo real

DOI:

10.3791/66243

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July 26th, 2024

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1Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2School of Basic Medical College, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 3School of Medical and Life Sciences, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 4Chengdu Integrated TCM and Western Medicine Hospital

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Presentamos un método para aislar los tubos intestinales de ratas y evaluar el impacto de los fármacos sobre su tensión, frecuencia y amplitud in vitro. Este método ofrece un enfoque valioso para los investigadores que investigan los tubos intestinales.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las enfermedades gastrointestinales, que tienen una alta incidencia, plantean desafíos considerables para los seres humanos. El intestino delgado es parte integral de la digestión y absorción de alimentos y medicamentos y desempeña un papel crucial en el tratamiento de estas enfermedades. El experimento del movimiento del tubo intestinal, un método in vitro común y esencial, se utiliza para estudiar la dinámica gastrointestinal. Esto incluye la preparación del tubo intestinal aislado, así como la suspensión del tubo intestinal preparado en el baño y su conexión a un detector de señales. A continuación, se registran y analizan una serie de parámetros, como la tensión, que pueden utilizarse para evaluar la función motora intestinal, así como consideraciones para mantener el tubo intestinal activo in vitro. El programa estandarizado desde el muestreo hasta la recolección de datos mejora en gran medida la repetibilidad de los datos experimentales y garantiza la autenticidad del registro de la tensión intestinal después de la intervención fisiológica, patológica y farmacológica. Aquí presentamos los problemas clave en la operación experimental y un valioso protocolo experimental de referencia para el estudio de fármacos que regulan la motilidad gastrointestinal.

Introduction

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Las enfermedades gastrointestinales, una afección prevalente, afectan gravemente la vida y la salud humanas1. El trastorno de la motilidad gastrointestinal es una parte importante de las enfermedades gastrointestinales funcionales, que se manifiesta principalmente en síntomas debilitantes, retraso en el vaciamiento gástrico y problemas gástricos graves2. Puede alterar la coordinación gastrointestinal, dificultar el vaciado gástrico, afectar la intolerancia alimentaria intestinal e incluso causar obstrucción funcional en el intestino delgado o grueso3. Para los pacientes que se someten a una cirugía gastrointestinal, este trastorno puede conducir directamente a la insuficiencia intestinal. Además, el trastorno intestinal no solo está relacionado con enfermedades gastrointestinales, sino también con los factores patogénicos de otras enfermedades, como la hepatitis y las enfermedades del sistema nervioso central. Las comunidades microbianas intestinales desempeñan un papel regulador crucial en la fisiología intestinal, incluida la motilidad, que posteriormente influye en la colonización dentro del ecosistema microbiano4. A medida que la infección por el virus de la hepatitis B progresa a hepatitis B crónica, hay diversos grados de cambios en la flora intestinal. La modulación de la flora intestinal ha demostrado beneficios en el tratamiento del virus de la hepatitisB 5. Además, el sistema nervioso central puede influir en el intestino y alterar su composición microbiana. Los avances recientes en la tecnología de secuenciación de la microflora han descubierto interacciones bidireccionales entre la microflora intestinal y la función del sistema nervioso central, estrechamente asociadas con la aparición y progresión de enfermedades del sistema nervioso central 6,7.

Con el envejecimiento de la sociedad, la incidencia del trastorno de la motilidad gastrointestinal está aumentando, vinculado a la disminución o pérdida de la función neuronal en el sistema nervioso entérico y la inervación intrínseca del intestino8. A medida que se amplía nuestra comprensión de las enfermedades gastrointestinales, surgen numerosas ideas y enfoques novedosos, que podrían conducir al desarrollo de nuevos fármacos. Sin embargo, muchas de estas ideas aún son hipotéticas o están a la espera de resultados positivos en ensayos clínicos para materializarse 9,10. Los métodos de investigación eficaces son cruciales para superar las enfermedades gastrointestinales. En los últimos años, una amplia investigación se ha centrado en los fármacos gastrointestinales y la regulación de la motilidad. Los fármacos gastrointestinales y la dinámica gastrointestinal son inseparables, y muchos otros fármacos sistémicos tienen efectos variables sobre la dinámica gastrointestinal. Por ejemplo, los medicamentos antiinflamatorios no esteroideos (AINE) se utilizan para el dolor y la inflamación y el movimiento gastrointestinal lento, lo que aumenta el riesgo de úlcera péptica11. Por otro lado, algunos antidepresivos pueden afectar la motilidad gastrointestinal12. En la actualidad, el principal experimento farmacológico in vitro que estudia los efectos de los fármacos gastrointestinales y otros fármacos sistémicos sobre la motilidad gastrointestinal es el ensayo de movimiento intestinal in vitro 13. Mediante la simulación de condiciones fisiológicas, observan el impacto directo de los fármacos en la contracción y relajación del músculo liso intestinal, evaluando sus efectos gastrointestinales. Sin embargo, la causa precisa de los trastornos de la motilidad gastrointestinal sigue sin estar clara, probablemente una interacción compleja de factores genéticos, ambientales, dietéticos y neuroendocrinos. En consecuencia, el tratamiento de los trastornos de la motilidad gastrointestinal sigue planteando importantes desafíos.

El intestino delgado, al ser un sitio crucial para la digestión, la absorción y el metabolismo de los medicamentos, tiene importancia en la función gastrointestinal. Como resultado, la prueba de movimiento del tubo intestinal aislado es una herramienta esencial para el estudio de las enfermedades gastrointestinales. Esto implica preparar y colocar el tubo intestinal aislado del animal en un baño, conectarlo a un intercambiador de energía, utilizar un transductor para convertir los movimientos mecánicos en señales eléctricas para su amplificación y registrarlo mediante un registrador fisiológico. Se pueden medir varios parámetros, como la frecuencia, la amplitud promedio de la vibración, la tensión y el área debajo de la curva para evaluar la función motora del tubo intestinal. Este método ofrece ventajas como simplicidad, viabilidad económica, fácil control de las condiciones experimentales, factores de influencia mínimos, alta reproducibilidad y resultados precisos y confiables. Además, es particularmente útil para investigar el mecanismo de acción de los medicamentos. Sin embargo, existen desafíos notables en el funcionamiento del experimento del tubo intestinal aislado, por ejemplo, la actividad intestinal es difícil de mantener durante mucho tiempo. Para abordar estos problemas y aprovechar las experiencias en experimentos in vitro , este artículo proporcionará una introducción detallada a los problemas clave en la operación experimental y presentará un valioso protocolo experimental de referencia para el estudio de fármacos que regulan la motilidad gastrointestinal.

Protocol

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Este protocolo se deriva de la literatura previamente publicada 14,15,16,17. Para el presente estudio se utilizaron ratas macho Sprague Dawley (SD) (260-300 g, 8-10 semanas de edad). El protocolo animal fue revisado y aprobado por el Comité de Gestión de la Universidad de Medicina Tradicional China de Chengdu (Registro Nº 2023017). Antes del experimento, se instruyó a las ratas para que ayunaran durante 24 horas. Durante el experimento, las ratas se mantuvieron en una cámara de animales y tuvieron libre acceso a comida y agua.

1. Preparación de la solución

  1. Prepare una solución salina fisiológica (PSS) que contenga 118 mM de NaCl, 4,7 mM de KCl, 2,5 mM de CaCl2, 1,2 mM de KH2PO4, 1,2 mM de MgCl2∙6H2O, 25 mM de NaHCO3, 11 mM de D-glucosa y 5 mM de HEPES (véase la Tabla de Materiales).
  2. Sature las soluciones y burbujee con un gas mezclado de 95%O2 y 5% de CO2. Mientras tanto, mantenga los valores de pH de la solución entre 7,38 y 7,42 con 2 mM de NaOH.
  3. Preenfriar 1/3 del PSS a 4 °C y precalentar el resto a 37 °C para experimentos posteriores.
    NOTA: el PSS se preparó originalmente a temperatura ambiente en los pasos 1.1-1.2

2. Disección del canal intestinal de la rata

  1. Reúna placas de Petri llenas de PSS a 4 °C, pinzas quirúrgicas y tijeras. Administrar isoflurano al 2% para anestesiar a la rata por inhalación durante aproximadamente 5 min. Verifica que la rata esté profundamente anestesiada realizando una prueba de pellizco en los dedos de los pies. Si es necesario, administre anestésicos adicionales. A continuación, exponga el canal intestinal abriendo la cavidad abdominal sobre una mesa de operaciones.
  2. Coloque rápidamente los tubos del estómago y del intestino en una placa de Petri llena de PSS a 4 °C (pH 7,40) con un 95% deO2 y un 5% de CO2 saturado. Localiza el duodeno, que es el comienzo del intestino delgado, en el píloro del estómago. Con unas pinzas, levante delicadamente el pañuelo adyacente y recórtelo cuidadosamente lejos del borde del intestino con unas tijeras. Posteriormente, divida el intestino en segmentos de 1-2 cm; todo este proceso se ilustra en la Figura 1.

3. Suspensión y fijación del canal intestinal (Figura 2)

  1. Encienda el sistema de perfusión de tejidos in vitro y ajuste la temperatura del baño en el instrumento a 37 °C. Coloque el PSS (37 °C) en la bañera.
  2. Preparar una sutura quirúrgica de 15 cm (ver Tabla de Materiales) y sumergirla en PSS a 4 °C saturado con 95% deO2 + 5% de CO2. Con la sutura, asegure un extremo del canal intestinal y use un gancho de aguja de acero para asegurar el otro extremo.
  3. Instala el tubo intestinal. Monte el segmento con el gancho de aguja de acero en la parte inferior del baño y conecte el otro extremo de la línea quirúrgica al transductor. Encienda el interruptor de gas para permitir que emerjan burbujas en el baño.
  4. Abra el software de adquisición de datos (consulte la Tabla de materiales) y haga clic en Iniciar para asegurarse de que se está registrando la señal de ruta correspondiente.

4. Normalización

  1. Gire el eje en espiral del baño en sentido contrario a las agujas del reloj para relajar los tubos intestinales a su estado natural. Haga clic en Configuración-Cero todas las entradas para asegurarse de que la tensión inicial del tubo intestinal esté configurada en 0 g en el software.
  2. Gire el eje en espiral del baño en sentido contrario a las agujas del reloj para llevar el valor de tensión a 1 g y estabilizarlo en el pH = 7,40, 95% O2 + 5% CO2 saturado 37 °C PSS durante 30 min.
    NOTA: La normalización del tubo intestinal consiste en ajustar su precarga a un estado óptimo. Para las muestras de cavidad, era necesaria una precarga óptima para mantener una actividad excepcional in vitro. La precarga óptima del tubo intestinal de rata fue de 1 g18.

5. Detección de reactividad

  1. Observe las ondas de contracción rítmicas espontáneas en el software y proceda al siguiente experimento, ya que esto indica una respuesta suficiente.

6. Observación experimental

  1. Agregue el fármaco de prueba (por ejemplo, acetilcolina, etc.) al baño para estudiar el efecto del fármaco sobre la función del tubo intestinal.
    NOTA: El efecto del fármaco se evaluó comparando los cambios antes y después de la administración en la curva de constricción intestinal. Cuando se agrega el medicamento, es apropiado aumentar la burbuja para mezclar el medicamento y luego ajustar la burbuja a la normalidad después de mezclar.

7. Análisis de datos

NOTA: El sistema de perfusión tisular in vitro tiene cuatro canales que pueden realizar pruebas simultáneamente sobre los efectos de cuatro medicamentos idénticos o diferentes en cuatro tubos intestinales. Dado que los parámetros experimentales y los métodos de análisis son los mismos para todos los canales, se selecciona un canal como ejemplo para el análisis de datos.

  1. Detenga el software de adquisición de datos y realice el análisis de datos en este software de adquisición de datos. Edite la tarjeta de datos y seleccione los parámetros de análisis de la siguiente manera: Haga clic en Window-Data Pad y elija la tensión media para el canal.
  2. Seleccione la curva de contracción antes de la administración y haga clic en Agregar al panel de datos; seleccione la curva de contracción después de la administración y haga clic en Agregar al panel de datos. El valor de tensión promedio antes y después de la administración aparecerá a su vez en el panel de datos.
  3. Haga clic en Window-Data Pad para copiar los datos a otro software de análisis estadístico (consulte la Tabla de materiales) para el análisis estadístico.
  4. Analice otros parámetros, como la amplitud promedio, la frecuencia promedio y la integral (área bajo la curva), simplemente reemplace la tensión promedio con el parámetro respectivo y la operación es la misma que los pasos 6.1-6.3.
  5. Guardar curva de contracción: Seleccione la curva de contracción, haga clic en Editar-Copiar datos de Labchart para copiar los datos al software de dibujo (consulte la Tabla de materiales) para dibujar la curva de contracción.

8. Tratamiento postquirúrgico

  1. Después de la cirugía, eutanasiar a los animales siguiendo los protocolos aprobados por la institución.
    NOTA: Para el presente estudio, los animales fueron sacrificados inhalando el exceso de isoflurano.

Results

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La primera parte del estudio se centra en el proceso de separar tubos intestinales aislados del cuerpo y convertirlos en tubos de 2 cm in vitro. Este proceso se ilustra en detalle en la Figura 1. La segunda parte consiste en la suspensión y estandarización del anillo de tubo intestinal aislado. El éxito de este proceso se demuestra en la Figura 2, que muestra la contracción rítmica automática de un tubo normal. Por último, el estudio examina los efectos de los agentes contráctiles representativos y relajantes sobre el anillo del tubo intestinal aislado. Se encontró que la acetilcolina (0,3 μmol/L) y el cloruro de bario (1,2 mmol/L) aumentaron la tensión en estos tubos, mientras que la atropina (300 μmol/L), la epinefrina (1 μmol/L) y el nifedipino (10 μmol/L) inhibieron su tensión, como se ilustra en la Figura 3.

Este método introduce principalmente la determinación de la función motora del tubo intestinal aislado. Los movimientos intestinales se ven afectados por una serie de factores, y la mayoría de los efectos se ejercen a través de los receptores en el intestino. En el tracto gastrointestinal, hay varios receptores, incluidos los receptores M colinérgicos, los receptores adrenérgicos α y β, los receptores 5-HT, los receptores de histamina y los receptores de hormonas gastrointestinales19. El espasmo en el intestino aislado puede ser causado por la acción de la acetilcolina sobre los receptores M. Este efecto puede ser bloqueado por la atropina, que actúa como agente bloqueante de los receptores M (Figura 3A). Sin embargo, el espasmo en el músculo liso del segmento intestinal, causado por la entrada de iones de bario en el cloruro de bario y su unión con la calmodulina, no puede ser bloqueado por la atropina (Figura 3B). La epinefrina funciona como un agonista para los receptores α y β (Figura 3C). Excita el receptor α y el receptorβ 2 del intestino delgado, lo que provoca la relajación del músculo liso y una contracción debilitada del intestino delgado. Como resultado, el peristaltismo se ralentiza y la tasa de absorción se reduce. Por el contrario, el nifedipino impide el flujo interno de Ca2+ y favorece la relajación intestinal (Figura 3D). Esto ayuda a aliviar los espasmos intestinales, disminuir la presión intestinal y facilitar la absorción de agua en el intestino.

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Figura 1: Aislamiento de las trompas intestinales. (A) sondas intestinales en ratas; (B) Se extrajeron los tubos intestinales del cuerpo y se colocaron en una placa de Petri que contenía una solución salina fisiológica de 4 °C; (C) tubo intestinal después de la extracción del tejido circundante; (D) Tubo intestinal de 2 cm de largo utilizado en el experimento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Proceso de suspensión y estandarización de anillos de tubo intestinal aislados. (A) Sistema de perfusión de tejidos in vitro (ver la Tabla de Materiales); (B) fijar ambos extremos del tubo intestinal con un gancho de hierro y una línea quirúrgica en una placa de Petri que contenga una solución salina fisiológica de 4 °C; C) la fijación del tubo intestinal en uno de los baños que contengan una solución salina fisiológica a 37 °C; (D) dando precarga y registrando la forma de onda normal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Efectos de los fármacos sobre los tubos intestinales aislados. Efectos de (A) acetilcolina (0,3 μmol/L) y atropina (300 μmol/L), (B) cloruro de bario (1,2 mmol/L), (C) epinefrina (1 μmol/L) y (D) nifedipino (10 μmol/L) en tubos intestinales aislados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

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La motilidad gastrointestinal se logra mediante una serie de contracciones y relajaciones del músculo liso coordinadas con precisión. Este proceso implica la contracción rítmica de un grupo de grupos musculares, la contracción coordinada de múltiples grupos y una contracción propulsiva especial20,21. La aparición de trastornos de la motilidad gastrointestinal puede estar asociada a disfunciones a diferentes niveles, como el sistema nervioso central, el sistema nervioso autónomo, el sistema nervioso entérico y el músculo liso gastrointestinal. Estas estructuras tisulares funcionan juntas a través de la liberación de varios neurotransmisores y factores humorales, que se unen a los receptores correspondientes para llevar a cabo diferentes funciones fisiológicas22. Por lo tanto, el estudio del mecanismo local de acción de los fármacos es esencial, y la realización de experimentos in vitro con el intestino delgado puede proporcionar información más precisa al excluir la interferencia de sustancias extrañas y la regulación del sistema nervioso central.

Las muestras aisladas de tubo intestinal de íleon de conejillo de india, yeyuno de conejo y duodeno se usan comúnmente en animales de experimentación. Además, el íleon, el duodeno y el yeyuno de ratas y gatos también se pueden utilizar para experimentos in vitro . Este método es adecuado para tejidos aislados. El músculo liso intestinal tiene las características de contracción rítmica automática y se ve afectado por el plexo nervioso en la pared intestinal. Los tubos intestinales aislados de muchos animales pueden mantener su función motora espontánea en un entorno de supervivencia adecuado. El experimento de tubo intestinal in vitro tiene las ventajas de una operación simple, fácil control de las condiciones experimentales, pocos factores influyentes, buena reproducibilidad, resultados precisos y confiables, y es más propicio para la discusión del mecanismo de acción del medicamento. Además, este método se considera económico y factible.

El experimento del tubo intestinal in vitro también tiene sus limitaciones, como el uso de preparaciones crudas de medicina china sin purificar que contienen impurezas, iones inorgánicos, saponinas y taninos, lo que puede afectar la confiabilidad del experimento. Por lo tanto, es necesario evaluar completamente la influencia de las impurezas y los factores fisicoquímicos en los resultados experimentales, incluido el pH del líquido y varias partículas electrolíticas y de impurezas. Además, es necesario mejorar la estabilidad del instrumento experimental in vitro y la técnica de conservación del tubo intestinal in vitro. Al diseñar experimentos in vitro, es esencial considerar si los medicamentos o preparaciones utilizados cumplen con los requisitos de estos experimentos (por ejemplo, niveles de impurezas).

En este método, hay varias precauciones que deben observarse. Para empezar, se debe extraer el tubo intestinal de la cavidad abdominal de la rata y sumergirlo en un PSS frío antes del experimento. Además, es importante cortar todo el tubo en varios pedazos y guardarlos en el refrigerador, minimizando cualquier estimulación a los intestinos. Durante el proceso de dosificación, es crucial asegurarse de que el tubo de dosificación no entre en contacto con la línea en la que está suspendido el tubo intestinal. Además, la cantidad de medicamento agregada al baño debe ser precisa y el medicamento no debe agregarse a la pared del baño o directamente al tubo intestinal para evitar influir en los resultados. Al enjuagar el tubo intestinal, se debe usar un enfoque suave y se debe evitar el enjuague a alta presión para prevenir la contractura del tejido. Se recomienda manipular el tubo intestinal con pinzas y evitar exponerlo al aire durante períodos prolongados para evitar cualquier pérdida de actividad.

En este artículo se presenta una demostración de la metodología experimental para experimentos con tubos intestinales aislados, utilizando los efectos de diversos fármacos tradicionales que actúan sobre los receptores intestinales para ilustrar su impacto en el movimiento del tubo intestinal, lo que proporciona un enfoque eficaz para investigar el mecanismo de acción de los fármacos que regulan la motilidad gastrointestinal en el tracto gastrointestinal.

Disclosures

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Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Acknowledgements

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Este trabajo fue apoyado por el Programa Especial de Talentos de la Universidad de Medicina Tradicional China de Chengdu para el "Plan de Promoción de la Investigación de Talentos Xinglin Scholars and Discipline" (33002324).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Acetilcolina Sigma, EE. UU.A6625
atropinaSangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, ChinaIA06501
Cloruro de barioMacklin Biochemical Co., Ltd., Shanghai, ChinaB861682
CaCl2Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, ChinaA501330
D-glucosaSangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, ChinaA610219
software de dibujoGraphPad Software, San Diego, California, EE. UU.—
EpinefrinaSigma, EE. UU.E4642
HEPESXiya Reactivo Co., Ltd., Shandong, ChinaS3872
Sistema de perfusión de tejidos in vitroPowerLab, ADInstruments, AustraliaML0146
KClSangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, ChinaA100395
KH2PO4Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghái, ChinaA100781
LabChart Professional versión 8.3 ADInstrumentos, Australia—
MgCl2· 6H2OSangon Biotech Co., Ltd., Shanghái, ChinaA100288
NaClSangon Biotech Co., Ltd., Shanghái, ChinaA100241
NaHCO3Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghái, ChinaA100865
nifedipinoMacklin Biochemical Co., Ltd.,Shanghái, ChinaN5087
análisis estadístico softwareGraphPad Software, San Diego, California, EE. UU.—
Suturas quirúrgicasJohnson, USA—

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