El presente protocolo describe un sistema de inducción neuronal de retina 3D optimizado que reduce la adhesión y fusión de organoides retinianos con alta repetibilidad y eficiencia.
Artículo de método
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El presente protocolo describe un sistema de inducción neuronal de retina 3D optimizado que reduce la adhesión y fusión de organoides retinianos con alta repetibilidad y eficiencia.
La retinopatía es una de las principales causas de ceguera en todo el mundo. Investigar su patogenia es fundamental para el diagnóstico precoz y el tratamiento oportuno de la retinopatía. Desafortunadamente, las barreras éticas dificultan la recopilación de evidencia de los seres humanos. Recientemente, numerosos estudios han demostrado que las células madre pluripotentes humanas (PSC) se pueden diferenciar en organoides de la retina (RO) utilizando diferentes protocolos de inducción, que tienen un enorme potencial en la retinopatía para el modelado de enfermedades, el cribado de fármacos y las terapias basadas en células madre. En este estudio se describe un protocolo de inducción optimizado para generar retina neural (NR) que reduce significativamente la probabilidad de vesiculación y fusión, aumentando la tasa de éxito de la producción hasta el día 60. Basado en la capacidad de las PSC para autoreorganizarse después de la disociación, combinado con ciertos factores complementarios, este nuevo método puede impulsar específicamente la diferenciación de NR. Además, el enfoque es sencillo, rentable, exhibe una notable repetibilidad y eficiencia, presenta perspectivas alentadoras para modelos personalizados de enfermedades de la retina y proporciona un abundante reservorio celular para aplicaciones como la terapia celular, la detección de fármacos y las pruebas de terapia génica.
El ojo sirve como la principal fuente de información entre los órganos sensoriales humanos, siendo la retina el principal tejido sensorial visualen los ojos de los mamíferos. La retinopatía se erige como una de las principales causas mundiales de enfermedades oculares, lo que conduce a la ceguera2. Aproximadamente 2,85 millones de personas en todo el mundo sufren diversos grados de discapacidad visual debido a la retinopatía3. En consecuencia, la investigación de su patogenia es crucial para el diagnóstico precoz y el tratamiento oportuno. La mayoría de los estudios sobre retinopatía humana se han....
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Este estudio se realizó de acuerdo con los Principios de la Declaración de Helsinki y fue aprobado por el Comité de Ética Institucional del Hospital General del EPL de China. La línea ESC WA09 (H9) se obtuvo del WiCell Research Institute.
1. Medios de cultivo y preparación de reactivos
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En la Figura 1 se muestra una descripción gráfica del protocolo modificado. Las H9-ESC se utilizaron para generar RO cuando las células crecieron a una densidad del 70%-80%. Las suspensiones de una sola célula de H9-ESC en 96 pozos cónicos con fondo en V se agregaron el día 1 y formaron EB redondos bien circunscritos en el día 6. A medida que aumentaba el tiempo de cultivo, el volumen de EB aumentaba gradualmente. En el día 30, las estructuras de tipo neuroepitelial se formaron claramente y .......
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Las OR humanas pueden recapitular espacial y temporalmente el desarrollo de la retina fetal, y las OR tempranas exhiben un alto grado de similitud con la retina fetal en etapas equivalentes de desarrollo15. En términos de morfología tisular y expresión molecular, la ósmosis inversa humana refleja de cerca el estado de crecimiento real del tejido de la retina, lo que brinda oportunidades enormes y sin precedentes en los campos del modelado de enfermedades, la detección de medicamentos y la medicina.......
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Todos los autores declaran que no tienen conflictos de intereses.
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 0.01 M TPBS | Servicebio | G0002 | Lonchas de lavado |
| 4% Paraformaldehído | Servicebio | G1101-500ML | Fix organoides de retina |
| 5 mL Pipeta | Pasteur NEST Biotechnology | 318516 | Pipeta organoides de retina 96 |
| pocillos cónicos con fondo en V | Sumitomo Bakelit | MS-9096VZ | |
| Portaobjetos de microscopio de adherencia | CITOTEST | 188105 | Fix rebanadas |
| AggreWell medio | STEMCELL Technologies | 5893 | Medio |
| Etanol anhidro | SINOPHARM | 10009218 | Deshidratado |
| Anti-CHX10 | Santa Cruz | sc-365519 | Anticuerpo primario |
| Solución Antidesvanecimiento | ZSGB-BIO | ZLI-9556 | |
| Anti-KI67 | Abcam | ab16667 | Anticuerpo primario |
| Anti-NESTIN | Sigma | N5413 | Anticuerpo primario |
| Anti-Neuronal Clase III β-Tubulina (TUJ1) | Beyotime | AT809 | Anticuerpo primario |
| Anti-PAX6 | Abcam | ab195045 | Anticuerpo primario |
| Solución de disociación celular (CDS) | STEMCELL Technologies | 7922 | Disociación celular |
| CHIR99021 | Selleckchem | S2924 | GSK-3α/β inhibidor |
| Colesterol Concentrado de lípidos | Gibco | 12531018 | 250× |
| Servicio | de solución de recuperación de antígenos de citratobio | G1202-250ML | 20×, pH 6.0 |
| CS10 | STEMCELL Technologies | 1001061 | medio de congelación celular |
| DAPI | Roche | 10236276001 | Contratinción nuclear |
| Dimethyl sulfóxido (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11330032 | Medio |
| DMEM/F12-GlutaMAX | Gibco | 10565018 | Burro Medio |
| anti-Ratón Alexa Fluor Plus 488 | Invitrogen | A32766 | Anticuerpo Secundario |
| Burro anti-Conejo Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10042 | Anticuerpo Secundario |
| Etileno Diamino Ácido Tetracacético (EDTA) | Biosharp | BL518A | 0,5 M, pH 8,0, disociación celular |
| Matriz extracelular (ECM) | Corning | 354277 | Placas de recubrimiento |
| F12-Glutamax | Gibco | 31765035 | Medium |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | A5669701 | |
| Analizador cuantitativo de células tisulares Flow-like | TissueGnostics | TissueFAXS Plus | Secciones de escaneo |
| IMDM-GlutaMAX | Gibco | 31980030 | Medio |
| IWR1-endo | Selleckchem | S7086 | Inhibidor de Wnt |
| KnockOut Serum de reemplazo | Gibco | 10828028 | |
| LDN-193189 2HCl | Selleckchem | S7507 | Inhibidor de BMP |
| Placas de 24 pocillos de baja adherencia | Corning | 3473 | |
| Placas de 6 pocillos de baja adherencia | Corning | 3471 | |
| Medio de mantenimiento (MM) | STEMCELL Technologies | 85850 | |
| Suplemento medio N2 | Gibco | 17502048 | |
| Normal Donkey Serum | Solarbio | SL050 | Tampón bloqueante |
| Paraplast | Leica | 39601006 | Incrustación de tejido |
| PBS pH 7.4 básico (1x) | Gibco | C10010500BT | Sin Ca+,Mg+ |
| Reconbinante proteína morfogenética ósea humana-4(rhBMP4) | R& D | 314-BP | Factor proteico clave |
| Ácido retinoico | Sigma | R2625 | Polvo, mantener alejado de la luz |
| SB431542 | Selleckchem | S1067 | Inhibidor de ALK5 |
| SU5402 | Selleckchem | S7667 | Inhibidor de la tirosina quinasa |
| Super PAP Pluma | ZSGB-BIO | ZLI-9305 | |
| Taurina | Sigma | T0625-10G | |
| Tioglicerol | Sigma | M1753 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | Permeabilización |
| Línea de células madre embrionarias WA09 | WiCell Research Institute | Línea celular | |
| Xileno | SINOPHARM | 10023418 | Desparafinado |
| Y-27632 2HCL | Selleckchem | S1049 | ROCK-inhibidor |
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