Un modelo de quemaduras porcinas para investigar el proceso de curación en heridas por quemaduras de múltiples profundidades

Resumen

Este protocolo describe un modelo reproducible de heridas por quemaduras de múltiples profundidades en un minicerdo de Yucatán.

Resumen

La cicatrización de heridas por quemaduras es un proceso complejo y largo. A pesar de la amplia experiencia, los cirujanos plásticos y los equipos especializados en los centros de quemados aún enfrentan desafíos significativos. Entre estos desafíos, la extensión del tejido blando quemado puede evolucionar en la fase temprana, creando un delicado equilibrio entre los tratamientos conservadores y la eliminación del tejido necrosante. Las quemaduras térmicas son el tipo más común y la profundidad de combustión varía en función de múltiples parámetros, como la temperatura y el tiempo de exposición. La profundidad de combustión también varía con el tiempo, y el agravamiento secundario de la "zona de sombra" sigue siendo un fenómeno poco comprendido. En respuesta a estos desafíos, se han estudiado varios tratamientos innovadores, y hay más en la fase inicial de desarrollo. Las nanopartículas en los apósitos modernos para heridas y la piel artificial son ejemplos de estas terapias modernas que aún se están evaluando. En conjunto, tanto el diagnóstico de quemaduras como los tratamientos de quemaduras necesitan avances sustanciales, y los equipos de investigación necesitan un modelo fiable y relevante para probar nuevas herramientas y terapias. Entre los modelos animales, los cerdos son los más relevantes debido a sus fuertes similitudes en la estructura de la piel con los humanos. Más específicamente, los minicerdos de Yucatán muestran características interesantes como la pigmentación de la melanina y el crecimiento lento, lo que permite estudiar fototipos altos y la curación a largo plazo. Este artículo tiene como objetivo describir un protocolo confiable y reproducible para estudiar las heridas por quemaduras multiprofundas en minicerdos de Yucatán, que permita el seguimiento a largo plazo y proporcione un modelo relevante para el diagnóstico y los estudios terapéuticos.

Introducción

Las quemaduras son un importante problema de salud pública y afectan a más de 480,000 pacientes en los EE. UU. cada año, según el Repositorio Nacional de Quemaduras ^1,2. Esto lleva a más de 50.000 hospitalizaciones anuales por casos complejos no mortales que requieren atención en profundidad². Además, las quemaduras son una causa fundamental de mortalidad y morbilidad militar y son responsables del 10% al 30% de las bajas militares ^3,4. El tratamiento de las quemaduras se ha mantenido casi sin cambios durante mucho tiempo, a pesar de sus inmensos y diversos impactos en los pacientes, que van desde los físicos hasta los psicológicos y emocionales⁵.

El diagnóstico inicial y la evaluación de las lesiones por quemaduras conducen a una clasificación basal según el tipo de quemaduras (primera, segunda y tercera) o la profundidad del tejido afectado (quemaduras superficiales, de espesor parcial y profundas)^6,7,8. Las quemaduras de espesor parcial (de primer y segundo grado) afectan a la epidermis y a diferentes profundidades de la dermis (dermis superficial o profunda, es decir, quemaduras superficiales y profundas de segundo grado)⁹. En particular, el daño a los apéndices en la dermis profunda excluye la posibilidad de reepitelización del epitelio anexial¹⁰. Por definición, las quemaduras de espesor total alcanzan la grasa subcutánea, la fascia y/o el músculo subyacente (quemaduras de tercer grado) y, a veces, el hueso (también conocidas como quemaduras de cuarto grado)^11,12.

Después de la hospitalización, los pacientes quemados reciben cuidados especiales que involucran una estrategia que consiste en un delicado equilibrio entre el desbridamiento y la preservación del tejido. El tejido blando dañado y/o infectado secundariamente necesita ser extirpado progresivamente hasta quedar expuesto al tejido sano, permitiendo el uso de apósitos e injertos de piel específicos para mejorar el proceso de cicatrización 13,14,15,16. Sin embargo, se requiere precaución durante la cirugía para evitar la extirpación involuntaria del tejido en proceso de curación y reducir las complicaciones para una recuperación óptima. Biológicamente, las quemaduras exhiben un área necrótica central rodeada por una zona de "sombra" o "estasis", lo que indica una isquemia potencialmente reversible. Esta área puede deteriorarse, dando lugar a una zona de necrosis extendida, o curarse invirtiendo el proceso apoptótico^17,18. Esta gravedad variable de las quemaduras presenta desafíos para que los cirujanos evalúen con precisión, lo que complica el equilibrio entre los tratamientos conservadores y la extirpación quirúrgica¹⁹. Hasta la fecha, no se dispone de ninguna herramienta eficaz para ayudar a caracterizar esta "zona de sombra" que precede a la conversión de la grabación. El desarrollo de este tipo de herramientas es crucial para optimizar este delicado equilibrio.

Se han probado varios tratamientos para ayudar a disminuir la conversión de quemaduras secundarias. Sin embargo, actualmente no hay ninguna terapia específica disponible en la clínica¹⁸. Otros ejemplos de avances en el tratamiento de quemaduras incluyen el desarrollo de apósitos modernos para heridas y nanomateriales^20,21, la ingeniería tisular de la piel^22,23 y nuevos enfoques de cultivo epidérmico^24,25. Además, la cirugía reconstructiva moderna y los colgajos fasciocutáneos han mejorado el manejo de las secuelas a largo plazo, en particular las contracturas por quemaduras después de la cicatrización patológica de las áreas de pliegues^26,27. Estos avances ofrecen perspectivas prometedoras para los pacientes quemados, mejorando sus estrategias de tratamiento y su calidad de vida, pero los resultados recientes muestran que el impacto funcional sigue siendo sustancial, tanto en la esfera física como en la psicológica²⁸. En conjunto, la demanda de avances innovadores tanto en el diagnóstico como en el tratamiento de quemaduras es sustancial.

En general, muchos enfoques tienen como objetivo mejorar el diagnóstico, el manejo y el tratamiento de los casos complejos de quemaduras, y los investigadores necesitan un modelo reproducible y relevante para probar estos nuevos enfoques. Debido a su complejidad biológica, que involucra varios órganos y reacciones sistémicas, ningún modelo in vitro demostró ser relevante para estudiar el proceso de la herida por quemadura²⁹. Los modelos de roedores han mostrado grandes discrepancias con los humanos debido a las grandes diferencias en la biología, la arquitectura de la piel, la elasticidad y la falta de adherencia a las estructuras subyacentes²⁹. En contraste, el modelo porcino ha demostrado ser relevante debido a la similitud estructural de la piel porcina con la piel humana 30,31,32. Se presenta con una vascularización, composición de fibras elásticas y tiempo de renovación similares. Además, el folículo piloso y los anexos apocrinos permiten la reepitelización en isla, como se puede observar en las quemaduras clínicas superficiales ^33,34. Más específicamente, los modelos de minicerdos de Yucatán proporcionan características interesantes, lo que los hace relevantes para el estudio de la piel pigmentada³⁵ y los resultados a largo plazo con cambios físicos mínimos³⁶.

El propósito de este artículo es describir un modelo confiable de quemaduras multigrado en cerdos de Yucatán, que permita el estudio de varias quemaduras de segundo y tercer grado sobre el mismo tema. Esto proporciona un modelo relevante y reproducible para estudiar las innovaciones diagnósticas y terapéuticas para el tratamiento de las quemaduras. Además, este modelo presenta diferentes tipos y gravedad de quemaduras, un seguimiento a largo plazo que permite el estudio de la contractura de las quemaduras y la cicatrización patológica, y el comportamiento diferencial de la piel pigmentada, que se sabe que tiene características específicas.

Protocolo

Todo el trabajo con animales se realizó de acuerdo con la lista de verificación ARRIVE (Animal Research: Reporting In Vivo Experiments)³⁷ y cumplió con el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) del Hospital General de Massachusetts bajo el protocolo #2021N000271. Se brindó un cuidado humanitario a los animales, siguiendo la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio³⁸. Para estos experimentos se utilizaron cinco minicerdos hembra de Yucatán de 30 kg. Los animales se obtuvieron de una fuente comercial (ver Tabla de Materiales).

1. Cuidados preoperatorios y anestesia

1. Ayuna a los animales durante 12 h antes de la anestesia general.
2. Iniciar la anestesia mediante una inyección intramuscular de 2-4 mg/kg de clorhidrato de tiletamina y clorhidrato de zolazepam y 1-2 mg/kg de xilacina, seguida de inhalación de isoflurano (2-3% en oxígeno) (ver Tabla de Materiales) para mantener la anestesia durante el procedimiento.

2. Diseño y aleatorización de heridas por quemaduras

1. Con el fin de estudiar las quemaduras de espesor parcial y total con controles negativos en el mismo animal (sin variación interindividual), se crean ocho heridas en el dorso de cada cerdo en la zona paravertebral. Realice tres heridas de espesor total, tres heridas de espesor parcial y dos heridas de control.
2. Numere las heridas del 1 al 8 y realice la aleatorización para asignar diferentes grados de quemadura (espesor parcial, espesor completo, control) a diferentes ubicaciones anatómicas de la espalda.
   NOTA: Se realiza una aleatorización de cada herida (profundidad y localización) para mejorar la significación: Se sabe que la dermis de cerdo varía en términos de grosor y composición de colágeno³⁹. Por lo tanto, se utiliza la aleatorización de cada animal para disminuir los posibles sesgos.

3. Delimitación de la herida del tatuaje

NOTA: El primer procedimiento consiste en crear tatuajes circulares en el dorso del cerdo con el fin de localizar y numerar las heridas aleatorias (Figura 1). Esto se realiza dos días antes del procedimiento de quema inicial para permitir una mejor aclimatación, pero se puede realizar el día del procedimiento de quema.

1. Después de la anestesia (ver Paso 1) y de la intubación orotraqueal en decúbito supino⁴⁰, coloque al cerdo en decúbito prono y coloque cuñas blandas (sábanas) debajo del animal para su comodidad y estabilización (debajo de las extremidades anteriores, el área umbilical y las extremidades posteriores)⁴¹. Coloque una manta térmica de aire forzado en la cabeza y el cuello del animal para mantener una temperatura corporal adecuada.
2. Coloque una línea recta en el centro del lomo del cerdo para permitir la simetrización de los dibujos.
3. Dibuje dos líneas verticales con un bolígrafo dermográfico (ver Tabla de Materiales) a ambos lados de la línea central, colocadas a 6,5 cm lateralmente de ella. Las dos líneas laterales se utilizarán para colocar el centro de los círculos.
4. Dibuja cada par de círculos de 4,5 cm de diámetro simétricamente, manteniendo una distancia mínima de 4 cm entre dos círculos distintos (Figura 1A).
5. Una vez realizados los dibujos, realice una preparación cutánea de un solo paso (povidona-yodo 7,5%) para disminuir la flora bacteriana de la piel.
6. Realice el procedimiento de tatuaje⁴² de ocho círculos de 4,5 cm utilizando una máquina de tatuar con aguja, tinta negra estéril y una aguja esterilizada de 5 puntos (ver Tabla de Materiales). El resultado final se presenta en la Figura 1B.
7. En caso de un procedimiento de creación de quemaduras tardías, aplique ungüento triple antibiótico sobre los tatuajes y cúbralo con apósitos adhesivos transparentes.

4. Creación de heridas por quemaduras y apósito avanzado para heridas

NOTA: Las quemaduras se crearán colocando el bloque de latón en contacto con la piel en el punto dedicado (aleatorización) durante 30 s (invariable). La temperatura determinará la profundidad de combustión.

1. El día del procedimiento de quema, una vez que el animal esté anestesiado y colocado en posición prona como se discutió en el Paso 1, coloque bloques cilíndricos de latón en recipientes de acero inoxidable llenos de cuentas de aluminio (consulte la Tabla de materiales). Coloque los recipientes en una placa calefactora con temperatura controlada. Ajuste una placa calefactora a 65 °C (para las quemaduras de espesor parcial) y la segunda a 93 °C (para la combustión de espesor completo, Figura 2).
   NOTA: El recipiente puede mantenerse seco para evitar quemaduras por escaldaduras (se necesitan 2-3 h para alcanzar el equilibrio de temperatura) o medio lleno de agua (30 min para alcanzar el equilibrio de temperatura). Si se utiliza agua, los bloques de latón deben secarse completamente antes del paso 4.5 para evitar quemaduras posteriores debido a quemaduras.
2. Inserte un termómetro en el cilindro de latón a través de su abertura central para controlar su temperatura central y confirme la temperatura de la superficie con una pistola de temperatura. Si es necesario, aumente la temperatura de la placa calefactora a 65 °C o 93 °C en el cilindro a pesar de una pequeña disipación de calor.
   NOTA: Se puede utilizar papel de aluminio para cubrir el recipiente y minimizar aún más la disipación de calor, alcanzando la temperatura deseada más rápido.
3. Paralelamente, coloque al animal en posición prona para el procedimiento de quema, similar al procedimiento de tatuaje (paso 3.1).
4. Una vez que el animal esté listo en posición prona, prepare la piel en tres pasos (povidona yodada 7,5%, solución salina 0,9%, secado).
5. Agarra el bloque de latón con guantes resistentes al calor y colócalo en el lugar dedicado al tatuaje, dependiendo de la aleatorización. Inicie el temporizador tan pronto como el bloque de latón toque la piel. Tenga cuidado de no aplicar más presión sobre la piel que el propio peso del bloque de latón.
6. Después de 30 s, retire el bloque de latón de la piel y vuelva a colocarlo en su recipiente de calentamiento dedicado. Controle la temperatura hasta que alcance el objetivo y repita el procedimiento para todas las heridas.
7. Realice un apósito multicapa avanzado para garantizar la estabilidad del apósito después de que el animal se haya recuperado.
   1. Coloque una gasa impregnada de petróleo en cada lugar de la quemadura, incluidos los controles, y cúbrala con una gasa no tejida seca y un apósito adhesivo transparente grande.
   2. Rocíe una tintura de solución de benjuí sobre la piel circundante para una mejor adherencia de los apósitos transparentes a la piel.
   3. Envuelva al animal en un apósito adhesivo autoadhesivo mientras presta atención a no apretarlo demasiado (restricción de los volúmenes pulmonares).
   4. Completar el apósito añadiendo una última capa de jersey tubular (tamaño adaptado al animal) (ver Tabla de Materiales). Alternativamente, se pueden usar chaquetas porcinas personalizadas si el animal no puede mantener el apósito limpio durante la duración del estudio
   5. Asegurar una correcta analgesia colocando un parche transdérmico opioide (fentanilo) en el cuello del animal después de inyectar una dosis única de buprenorfina (0,05-0,1 mg/kg, IM) y una dosis única de carprofeno (2-4 mg/kg, IM).
   6. Después de cada anestesia, vigile de cerca a los animales hasta 2 horas después de la recuperación. Use una almohadilla tibia si es necesario y proporcione comida libremente después de alcanzar una posición de pie completa.

5. Escarotomía por quemadura de espesor completo

NOTA: Entre 1 y 3 días después de la operación, los animales recibirán una escisión quirúrgica de espesor completo de la escara después de las quemaduras de tercer grado.

1. Después de una preparación similar del animal, incluida la anestesia, la intubación y la colocación del animal en posición supina, prepare la piel a través de la preparación de la piel en tres pasos, realice un drapeado estéril de la espalda del animal.
2. Realizar biopsias con sacabocados de 4 mm (ver Tabla de Materiales) en la herida para confirmar el tipo de lesión.
3. Realizar la escarotomía^43,44 mediante una incisión circular de la escara con una hoja de bisturí estéril (n°15) hasta llegar a la dermis profunda.
4. Sujete firmemente un lado de la escara con un par de pinzas de tejido Adson estériles (con 2/1 dientes) (consulte la Tabla de materiales) y engántela hacia arriba para revelar el límite profundo de la escara.
5. Continúe la escarotomía con la hoja del bisturí mientras permanece en el mismo plano dentro de la dermis profunda/fascia subyacente. Una dermis sangrante se considera un signo de viabilidad de los tejidos.
   1. Si se corta una arteriola durante el proceso, realice una cauterización mínima con pinzas de coagulación bipolar (consulte la tabla de materiales). PRECAUCIÓN: La cauterización extensa del lecho de la herida creada puede resultar en una cicatrización tardía y debe evitarse estrictamente.
6. Colocar una primera capa de guaze seco en el lecho de la herida durante 5 minutos para potenciar la hemostasia local antes de colocar el apósito definitivo.
7. Venda las heridas de manera similar a como se hizo anteriormente (paso 4.7), con la adición de varias gasas secas para llenar la cavidad. Aplique las mismas capas que se mencionaron anteriormente: tintura en aerosol de benjuí, apósito adhesivo transparente, envoltura autoadhesiva, jersey tubular.
8. Proporcionar analgesia cambiando el parche transdérmico opioïd e inyectando Caprofeno (2-4 mg/kg, IM).

6. Apósitos de seguimiento para heridas

NOTA: Los apósitos posteriores se realizan cada 2 a 7 días, dependiendo del diseño del tratamiento experimental y de la tolerancia del animal. Los apósitos para heridas se pueden suspender después de 21 días para permitir la reepitelización en un ambiente seco y mejorar la tolerancia del animal. Alternativamente, si el grupo de tratamiento requiere un ambiente húmedo o mojado, los apósitos pueden prolongarse hasta el final del estudio. El periodo de seguimiento se amplió hasta 10 semanas con el fin de estudiar tanto los procesos de curación agudos como los prolongados.

1. Anestesiar al animal durante un breve periodo de tiempo y colocarlo en posición supina con un cono nasal (isoflurano 2-5 L/min).
2. Retirar los apósitos anteriores y limpiar las heridas con suero fisiológico estéril al 0,9% y gasa estéril.
3. Aplicar el tratamiento experimental si procede.
4. Del mismo modo, realice biopsias posteriores durante este procedimiento si el estudio lo requiere. A continuación, el animal debe recibir analgésicos como el carprofeno (2-4 mg/kg, IM, efecto de 24 h).
5. Cubra todas las ubicaciones de la herida, incluidas las heridas de control, con gasa impregnada de petróleo o equivalente, gasa seca no tejida y apósito transparente adhesivo.

Resultados

La Figura 2A, B muestra los resultados de múltiples quemaduras en el dorso de un minicerdo de Yucatán. Las heridas (I) y (VII) son heridas de control (37 °C). Heridas de segundo grado (II; III y VIII) se presentan con enrojecimiento intenso y ampollas. Por el contrario, las heridas de tercer grado (IV; V; y VI) son pálidos e indurados a la palpación. Cabe señalar que la herida VIII parece intermedia entre el segundo y el tercer grado: para el propósito de un estudio en curso, aumentamos el tiempo de contacto a 45 s a 65 grados. En la figura 2C se muestra el aspecto de las heridas tras la escarotomía en el día 3 del postoperatorio. Se realizó una ampolla en las heridas de segundo grado, y se realizó una escisión "en bloque" del tejido quemado indurado en las heridas de tercer grado, con el fin de crear un lecho de herida viable para la cicatrización secundaria. Se realizó una cauterización mínima del plexo dérmico si el sangrado no se detuvo espontáneamente. Las figuras 2D-F muestran el aspecto de las heridas en los momentos posteriores (semana 2, semana 3 y semana 7, respectivamente).

Los resultados histológicos se muestran en la Figura 3 (H&E, 5,5x y 20x). La piel de control (Figura 3A,B) muestra una epidermis intacta (bracket azul), incluyendo un estrato córneo (flecha azul) adherido al resto del tejido cutáneo. La dermis muestra eosinofilia homogénea de color rosa pálido (colágeno y fibras elásticas - asterisco rojo). Las quemaduras de segundo grado (Figura 3D,E) revelan pérdida del estrato córneo en comparación con los controles (plano de escisión, correspondiente a las ampollas). La dermis superficial muestra eosinofilia más fuerte y fisuras/fracturas dentro de las estructuras dérmicas (flechas azules). Se conservan los vasos sanguíneos profundos (flecha roja). Las quemaduras de tercer grado (Figura 3G,H) muestran lesiones extensas con eosinofilia aumentada de la dermis así como fracturas dérmicas severas (flechas azules), llegando desde la dermis profunda hasta la hipodermis (vacuidad de los adipocitos, asterisco verde). Por último, la tinción tricrómica (Figura 3C, F, I) permite una mejor evaluación del tejido conectivo. Utiliza las diferencias en la tinción del colágeno desnaturalizado por calor para mostrar la profundidad de la quemadura. La figura 3C muestra claramente las características azules en la dermis intacta de la biopsia de la herida de control con la capa epidérmica superior. Esto contrasta con la quemadura de segundo grado (Figura 3F), donde la pérdida de epitelio se acompaña de desnaturalización del colágeno en la capa superior de la dermis (asterisco blanco). Por último, la herida de tercer grado (Figura 3I) muestra la pérdida de la capa epidérmica con una extensa mancha roja (flecha amarilla) de la capa dérmica, lo que indica una desnaturalización completa del colágeno en esta capa de la piel.

Figura 1: Posicionamiento de la sala de operaciones, configuración del dispositivo de quemado y diseño del estudio. El animal es anestesiado, intubado, ventilado y colocado en decúbito supino. El bloque de latón se coloca en el recipiente precalentado lleno de perlas de aluminio +/- agua. Un termómetro se coloca en el centro del bloque de latón para permitir el control de la temperatura central. La temperatura deseada depende de la profundidad de combustión deseada de acuerdo con el diseño del estudio. Para provocar quemaduras de espesor parcial, se recomienda un contacto de 30 s a 65 °C sin presión añadida. Para quemaduras de tercer grado, se recomienda un contacto de 30 s a 93 °C sin presión añadida. Las quemaduras de segundo y tercer grado deben ser aleatorias para evitar sesgos debidos al grosor diferencial de la piel. La ubicación de la herida pretatuada permite un fácil seguimiento de cada herida aleatorizada durante el seguimiento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Resultados representativos de los aspectos de la herida después de quemaduras aleatorias de múltiples profundidades en un Minipig de Yucatán. (A) El procedimiento de tatuaje se realiza colocándolo en la ubicación de los 8 puntos de la herida. Cada ubicación está numerada para facilitar el monitoreo. (B) Aspecto de las heridas después de la creación de la quemadura. Las heridas I y VII son controles, y las heridas II, III y VIII son heridas de espesor parcial. Las heridas IV, V y VI son heridas de tercer grado. (C) Aspecto de las heridas después de la escarotomía de las heridas de tercer grado en POD3. También se realizó una ampolla en las heridas de espesor parcial. (D) Aspecto de la cicatrización de la herida en POD14 que muestra un lecho limpio de las heridas de tercer grado (II y V), e islas de reepitelización de los apéndices de la piel en las heridas de espesor parcial (III, IV, VI, VII, VIII). (E) Aspecto del proceso de cicatrización de la herida en POD21 que muestra contractura de los lechos de la herida de tercer grado y reepitelización adicional en las heridas de segundo grado. (F) Aspecto de las heridas en POD49 que muestra contractura avanzada en las heridas de tercer grado y epitelización subtotal de las heridas de espesor parcial con hiperpigmentación postinflamatoria importante. Tenga en cuenta que las heridas mostradas pueden presentar cicatrices en el sitio de la biopsia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Resultados histológicos. Resultados representativos del aspecto histológico de las heridas [Microscopía óptica 10x (A,C,D,F,G,I) y 20x (B,E,H); hematoxilina y eosina (A,B,D,E,G,H); Tricrómico de Masson (C,F,I)]. La piel control (A,B) muestra una epidermis intacta (bracket negro), incluyendo un estrato córneo (flecha negra) adherido al resto del tejido cutáneo. La dermis muestra eosinofilia homogénea de color rosa pálido (colágeno y fibras elásticas - asterisco rojo). La tinción tricrómica (C) revela el aspecto normal de la capa epidérmica y del tejido conectivo y de las fibras de colágeno dérmico. Las quemaduras de segundo grado (D,E) revelan pérdida del estrato córneo en comparación con los controles (plano de escisión, extirpado durante la blisterectomía). La dermis superficial muestra eosinofilia más fuerte y fisuras/fracturas dentro de las estructuras dérmicas (flechas azules). Se conservan los vasos sanguíneos profundos (flecha roja). El tricrómico (F) revela pérdida del epitelio, acompañada de desnaturalización del colágeno en la capa superior de la dermis (flecha amarilla). Las quemaduras de tercer grado (E,F) muestran lesiones extensas con aumento de eosinofilia de la dermis tan largas como fracturas dérmicas severas (flechas azules), llegando desde la dermis profunda hasta la hipodermis (vacuidad de los adipocitos, asterisco verde) y extensa tinción roja (I, flecha amarilla) de la capa dérmica con tricrómico, lo que indica una desnaturalización completa del colágeno. Barras de escala: A, D, G, 500 μm; B, E, H, 100 μm; C,F,I, 200 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Dibujo de ingeniería del bloque de latón utilizado para la creación de heridas por quemaduras. (A) Ilustración que muestra las dimensiones del bloque de latón que se utilizó para construir el bloque. Un diámetro de 40 mm permite heridas de tamaño óptimo mientras que permite diseñar 8 heridas en un minicerdo Yucatán de 20-30 kg. (B) Diagrama que muestra el aspecto final del bloque de latón con un túnel central que permite que el termómetro mida la temperatura central del bloque. (C) Imagen que destaca el bloque de latón calentado a 65 °C, según lo mostrado por el termómetro de mercurio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

La cicatrización de heridas después de lesiones por quemaduras es un proceso largo que puede durar hasta varios meses, con varias opciones de tratamiento y consideraciones para el cuidado del paciente ^2,13. Para poder estudiarlo se necesita un modelo fiable y reproducible. Se han descrito varios modelos animales, incluyendo principalmente roedores 29,45,46 y cerdos ^29,47. El modelo porcino es más relevante debido a sus similitudes con la estructura de la piel humana^34,48. El tamaño de un cerdo adulto significa que se pueden realizar varias heridas en el mismo animal, lo que aumenta la significación estadística y elimina la variabilidad interindividual entre los tratamientos experimentales y sus controles⁷. Recomendamos elegir los sujetos por peso y no necesariamente por edad. El modelo actual permite realizar hasta 8 heridas manteniéndose por debajo del 10% de la superficie corporal total. Esto permite mantenerse alejado de las consecuencias hemodinámicas, así como del dolor manejable.

Un punto crítico está relacionado con la raza. Si bien la mayoría de los protocolos porcinos existentes utilizan cerdos Yorkshire 29,31,47,48, desarrollamos el modelo Yucatán Minipig por varias razones. En primer lugar, esta raza de minicerdo muestra poco crecimiento durante los meses de seguimiento^36,49. Esto permite minimizar la variación del tamaño de la herida relacionada con el crecimiento y, por lo tanto, una mejor comparación intraindividual. La menor variación de peso en comparación con los cerdos Yorkshire también garantiza una mejor optimización y dosificación de los fármacos anestésicos. En segundo lugar, la alta cantidad de melanina es relevante para estudiar las reacciones de la piel pigmentada a las lesiones por quemaduras y la curación, lo que sugiere una mejor aplicabilidad a los fototipos humanos 3 a 6 35,50,51. Rice et al. encontraron diferencias curativas sustanciales entre los cerdos blancos de Yucatán y los domésticos después de las dermoabrasiones como tratamiento para las quemaduras químicas⁵². Además, los fototipos más altos mostraron clínicamente tasas más altas de cicatrices patológicas, como hipertróficas y queloides ^53,54,55, aunque la raza Duroc Rojo parece seguir siendo la más precisa para la evaluación de cicatrices hipertróficas ^34,56. Además, la epidermis cicatrizante pigmentada también facilita la medición del proceso de reepitelización desde los márgenes externos, así como desde los anexos. Por último, este modelo muestra signos claros de hiperpigmentación postinflamatoria (Figura 2D-F), que también es de interés para futuras investigaciones. Otros autores utilizaron este modelo de minicerdo para estudiar la toxicidad dérmica farmacológica y la fototoxicidad y encontraron impresionantes valores predictivos de seguridad y eficacia para los resultados humanos del 89% y el 100%, respectivamente⁵⁷. Si bien estas características enfatizan la relevancia del modelo del minicerdo de Yucatán para el estudio de la cicatrización de heridas, la literatura en el campo específico de las quemaduras sigue siendo pobre. Por lo tanto, se consideró necesario describir un modelo reproducible que permitiera el estudio de la cicatrización de las heridas por quemaduras y las diversas intervenciones diagnósticas y terapéuticas.

Se han descrito protocolos previos para estudiar las quemas en el modelo porcino. Branski et ^al.58 publicaron un modelo en 2008 para quemaduras por contacto térmico de espesor completo utilizando una barra de aluminio calentada a 200 °C. Su técnica, inspirada en varias publicaciones anteriores, implementó una presión controlada mediante el uso de una jeringa de 50 mL unida a la barra de aluminio. Aunque esta característica parece relevante, ya que la presión influye en el alcance de las lesiones por quemaduras, la precisión de su dispositivo podría carecer de exactitud (no se considera la presión del operador sobre la jeringa en sí, y el nivel de presión se basa en cambios en la posición del pistón). Más recientemente, Kim et ^al.59 y Seswandhana et ^al.60 demostraron heridas por quemaduras reproducibles utilizando un dispositivo personalizado con un dispositivo calentado eléctricamente y control de temperatura. Ambos dispositivos incluían monitoreo de presión que medía las fuerzas descendentes. El bucle de retroalimentación, según lo descrito por Kim, permite mantener las temperaturas del núcleo y de la superficie durante el contacto. Ambos autores mostraron una buena correlación entre la profundidad de combustión y la presión, enfatizando la importancia del control de la presión. Elegimos no aplicar ninguna presión adicional al bloque de latón que no sea su peso, y la acción del operador es simplemente estabilizadora. El objetivo era simplificar el modelo y minimizar el número de variables. Fan et ^al.61 describieron un modelo similar utilizando un soldador modificado relleno de glicerina, que tiene la desventaja de crear una resistencia térmica interfacial suplementaria. Los bloques estaban hechos de latón con una capacidad calorífica específica (c) de 395 W/m*K y una conductividad térmica (k) de 134 J/kg*K¹. En comparación con otros metales comunes como el hierro (c = 490 W/m*K, k = 66 J/kg*K) y el aluminio (c = 949 W/m*K, k = 240 J/kg*K), estas propiedades permiten alcanzar la temperatura deseada más rápido y también permiten transferir el máximo calor a la piel rápidamente para producir las quemaduras. Para mejorar la reproducibilidad, la Figura 4 muestra las características del bloque de latón que se utilizó para la fabricación de quemados. La figura 4A muestra el dibujo de ingeniería del bloque de latón con todas las dimensiones en mm. Como se muestra, el diámetro exterior del bloque es de 40 mm x 151 mm de altura. La línea punteada muestra un orificio coaxial a través del bloque para insertar un termómetro, con un diámetro de orificio de 9 mm y una profundidad de 128 mm. La figura 4B, C muestra el termómetro insertado en el bloque de latón para la medición de la temperatura central.

Un límite del modelo actual es la persistencia de zonas no quemadas debido a los relieves de las costillas, lo que es principalmente problemático en las quemaduras de espesor parcial (Figura 2). Esto podría influir en el proceso de reepitelización al proporcionar una fuente central de migración de queratinocitos. Sin embargo, parece difícil evitar este problema cuando se utilizan materiales duros para crear las quemaduras. Además, la superficie total de las áreas no quemadas es menor, y el diámetro de 4 cm de los bloques de latón proporciona suficiente superficie de herida para realizar estudios con seguimientos prolongados a pesar de las repetidas biopsias con sacabocados.

Otra variable importante es el momento de la escarotomía en las quemaduras de espesor completo, planificada en POD3 en este protocolo. Se eligió este punto de tiempo diferido con el fin de dirigirse a la zona de sombra con lesiones tisulares tardías, también conocida como conversión de heridas por quemaduras en la práctica clínica^62,63. El objetivo era extirpar todo el tejido lesionado, lo que se vio facilitado por la cohesión de la escara en este momento. Este calendario también permite estudiar intervenciones tempranas destinadas a disminuir las lesiones tardías de la "zona de sombra", como los agentes antiinflamatorios ^64,65,66, la terapia con células madre^18,67,68, la terapia de frío⁶⁹ o la anticoagulación 65,70,71 durante un máximo de 3 días. Además, mientras que la mayoría de los autores describieron períodos cortos de seguimiento de 2 a 4 semanas^29,47, aquí se adoptó un período de seguimiento extendido de 8 a 10 semanas, lo que permite estudiar no solo la fase aguda sino también los pasos de curación secundarios.

Durante este seguimiento prolongado, los cuidados postoperatorios y el vendaje de la herida son fundamentales: el equipo debe estar capacitado para brindar un cuidado adecuado al animal. La raza Yucatán suele presentar piel seca y necesita recibir loción humectante varias veces por semana con el fin de disminuir el prurito, que es un signo de malestar y puede llevar a posteriores autolesiones de las heridas. El apósito multicapa que se presenta en este manuscrito es el resultado de varios años de experiencia en modelos similares dentro de nuestro centro ^7,72. Los animales no muestran signos de malestar o dolor. No se encontró ninguna infección en el estudio, pero aún se necesita un seguimiento diario durante las primeras dos semanas para detectar estas posibles complicaciones a tiempo. Esto hace hincapié en el cumplimiento de la seguridad y el bienestar animal, que son de suma importancia en la investigación moderna. Se optó por suspender los apósitos después de 3 semanas para permitir la exposición al aire y la reepitelización en seco^73,74. Sin embargo, en la era moderna de los geles basados en nanopartículas²⁰ y reticulados³⁵ para mejorar la cicatrización de heridas por quemaduras, se pueden implementar apósitos oclusivos continuos en este protocolo.

Por último, una de las principales características de este modelo es que permite estudiar diferentes profundidades de herida en un mismo sujeto. Los resultados histológicos confirman la relevancia del protocolo en este sentido. Esta característica es de interés para fines diagnósticos, como las nuevas tecnologías para ayudar a medir la profundidad de la quemadura, el deterioro durante la fase inicial o la mejora durante el proceso de curación, pero también para evaluar nuevas terapias y su acción diferencial en quemaduras de primer, segundo y tercer grado. Dado que el proceso de cicatrización es sustancialmente diferente en función de la profundidad inicial de la quemadura, este modelo permite medir los efectos diferenciales de las posibles terapias evitando las variaciones interindividuales. Sin embargo, una limitación es que la mezcla de varios tipos de quemaduras en el mismo animal hace imposible evaluar biomarcadores sistémicos como metaloproteinasas, citocinas proinflamatorias y antiinflamatorias, que se sabe que varían con la profundidad de la herida y la superficie total quemada⁷⁵.

En conclusión, el modelo actual de quemados de Yucatán Minipig se destaca por su capacidad de proporcionar una plataforma confiable para estudiar la cicatrización de heridas después de lesiones por quemaduras. Aprovechando la proximidad fisiológica entre la piel porcina y la humana, este modelo de cerdo ofrece claras ventajas, incluidas comparaciones intraindividuales controladas y la capacidad de acomodar múltiples tipos de heridas en un solo animal. Las técnicas reproducibles de inducción de quemaduras, el momento de las intervenciones y la duración prolongada del seguimiento son puntos críticos que mejoran la relevancia clínica y la fiabilidad de este modelo. La piel de Yucatán permite estudiar fenómenos específicos de la piel pigmentada, como la cicatrización hipertrófica y la hiperpigmentación postinflamatoria. Las nuevas herramientas diagnósticas destinadas a orientar al clínico con la conversión de quemaduras en "zona de sombra" y los tratamientos modernos, como las nanopartículas o los injertos de piel impresos en 3D, son ejemplos que ilustran la necesidad de un modelo preclínico tan valioso para estudiar las fases de quemaduras agudas, retrasadas y a largo plazo.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
pinza de tejido Adson	Jarit	130-234
Cuentas de aluminio	Lab Armor	42370-002	Lab Armor Beads
Clorhidrato de buprenorfina	Ranbaxy Pharmaceuticals	NDC: 12469-0757-01	Buprenex Carprofeno inyectable
	Pfizer	NADA 141-199	Rymadyl 50 mg / ml inyectable
Bloque cilíndrico de latón	Hecho a mano	N/A	Dibujo de ingeniería incluido en el manuscrito
Pluma dermográfica	McKesson	Marcador de piel quirúrgico Estéril
Desechable #15 Bisturíes quirúrgicos	Medline	MDS15315	Hojas de bisturí Parche de
fentanilo	Mylan	NDC:60505-7082	Fentanilo Sistema transdérmico
Isoflurano	Piramal	NDC:66794-013-25	Isoflurano, USP
McPherson Pinzas de coagulación bipolar	Bovie	A842	Punzones
de biopsia surtidos Miltex reutilizables y esterilizables en autoclave (3,4 y 5 mm)	Integra	33-38	Punzones de biopsia: tamaño para adaptarse al estudio Gasa
no tejida	Starryshine	GZNW22	2 x 2" no tejida de 4 capas almohadillas de gasa médica
Povidona Yodada	Betadine	NDC:0034-9200-88	Exfoliante quirúrgico 7.5%
Solución estéril isotónica de cloruro de sodio 0.9%	Aqualite System	RL-2095	Solución salina estéril
Tinta para tatuajes	Spaulding & Rogers	Black - 2 oz - #9053
Rotulador de tatuajes	Spaulding & Rogers	Special Electric Tattoo Marker
Aguja de tatuaje	Spaulding & Rogers	1310251	Tattoo Aguja de 5 puntos
Tegaderm Apósito de película transparente	3M	1.628	Apósito adhesivo transparente grande
Placa calefactora con control	de temperatura Cole-Parmer	03407-11	StableTemp agitador de placa calefactora
Termómetro	American Scientific	U14295	Termómetro de mercurio
de tubo Clorhidrato de	tiletamina y zolazepamZoetis	NDC: 54771-9050	telazol
de benjuí en aerosol	Smith& Nephew	407000	Spray de capa adhesiva
Triple Pomada antibiótica	Fougera	NDC 0168-0012-31	Pomada antibiótica
triple Stockinette tubular	Medline	NONNET02	Curad Medline Redes elásticas sin látex
Manta térmica	3M	Bair Hugger 750 unidad
Xeroform Tira de gasa oclusiva	Covidien	8884433301	Apósitos para heridas de vaselina Xeroform
Xilacina	Vetone	NDC:13985-704-10	AnaSed LA
Yucatà n minicerdos (hembra, 30 kg)	Sinclair Bio Resources	N/A Pigmentación	completa