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Artículo de método

Un modelo de quemaduras porcinas para investigar el proceso de curación en heridas por quemaduras de múltiples profundidades

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DOI:

10.3791/66362

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23 de febrero de 2024

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1Vascularized Composite Allotransplantation Laboratory, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, 2Shriners Children’s Boston, 3Department of Plastic, Reconstructive and Aesthetic Surgery, Rennes University, 4SITI Laboratory, UMR, INSERM, Université de Rennes, 5Center for Engineering in Medicine and Surgery, Department of Surgery, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, 6Innovative Therapies in Haemostasis, INSERM UMR-S, University of Paris

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe un modelo reproducible de heridas por quemaduras de múltiples profundidades en un minicerdo de Yucatán.

Resumen

La cicatrización de heridas por quemaduras es un proceso complejo y largo. A pesar de la amplia experiencia, los cirujanos plásticos y los equipos especializados en los centros de quemados aún enfrentan desafíos significativos. Entre estos desafíos, la extensión del tejido blando quemado puede evolucionar en la fase temprana, creando un delicado equilibrio entre los tratamientos conservadores y la eliminación del tejido necrosante. Las quemaduras térmicas son el tipo más común y la profundidad de combustión varía en función de múltiples parámetros, como la temperatura y el tiempo de exposición. La profundidad de combustión también varía con el tiempo, y el agravamiento secundario de la "zona de sombra" sigue siendo un fenómeno poco comprendido. En respuesta a estos desafíos, se han estudiado varios tratamientos innovadores, y hay más en la fase inicial de desarrollo. Las nanopartículas en los apósitos modernos para heridas y la piel artificial son ejemplos de estas terapias modernas que aún se están evaluando. En conjunto, tanto el diagnóstico de quemaduras como los tratamientos de quemaduras necesitan avances sustanciales, y los equipos de investigación necesitan un modelo fiable y relevante para probar nuevas herramientas y terapias. Entre los modelos animales, los cerdos son los más relevantes debido a sus fuertes similitudes en la estructura de la piel con los humanos. Más específicamente, los minicerdos de Yucatán muestran características interesantes como la pigmentación de la melanina y el crecimiento lento, lo que permite estudiar fototipos altos y la curación a largo plazo. Este artículo tiene como objetivo describir un protocolo confiable y reproducible para estudiar las heridas por quemaduras multiprofundas en minicerdos de Yucatán, que permita el seguimiento a largo plazo y proporcione un modelo relevante para el diagnóstico y los estudios terapéuticos.

Introducción

Las quemaduras son un importante problema de salud pública y afectan a más de 480,000 pacientes en los EE. UU. cada año, según el Repositorio Nacional de Quemaduras 1,2. Esto lleva a más de 50.000 hospitalizaciones anuales por casos complejos no mortales que requieren atención en profundidad2. Además, las quemaduras son una causa fundamental de mortalidad y morbilidad militar y son responsables del 10% al 30% de las bajas militares 3,4. El tratamiento de las quemaduras se ha mantenido casi sin cambios durante mucho tiempo, a pesar de sus inmensos y diversos impactos en los pacientes, que van desde los físicos hasta los psicológicos y emocionales5.

El diagnóstico inicial y la evaluación de las lesiones por quemaduras conducen a una clasificación basal según el tipo de quemaduras (primera, segunda y tercera) o la profundidad del tejido afectado (quemaduras superficiales, de espesor parcial y profundas)6,7,8. Las quemaduras de espesor parcial (de primer y segundo grado) afectan a la epidermis y a diferentes profundidades de la dermis (dermis superficial o profunda, es decir, quemaduras superficiales y profundas de segundo grado)9. En particular, el daño a los apéndices en la dermis profunda excluye la posibilidad de reepitelización del epitelio anexial10. Por definición, las quemaduras de espesor total alcanzan la grasa subcutánea, la fascia y/o el músculo subyacente (quemaduras de tercer grado) y, a veces, el hueso (también conocidas como quemaduras de cuarto grado)11,12.

Después de la hospitalización, los pacientes quemados reciben cuidados especiales que involucran una estrategia que consiste en un delicado equilibrio entre el desbridamiento y la preservación del tejido. El tejido blando dañado y/o infectado secundariamente necesita ser extirpado progresivamente hasta quedar expuesto al tejido sano, permitiendo el uso de apósitos e injertos de piel específicos para mejorar el proceso de cicatrización 13,14,15,16. Sin embargo, se requiere precaución durante la cirugía para evitar la extirpación involuntaria del tejido en proceso de curación y reducir las complicaciones para una recuperación óptima. Biológicamente, las quemaduras exhiben un área necrótica central rodeada por una zona de "sombra" o "estasis", lo que indica una isquemia potencialmente reversible. Esta área puede deteriorarse, dando lugar a una zona de necrosis extendida, o curarse invirtiendo el proceso apoptótico17,18. Esta gravedad variable de las quemaduras presenta desafíos para que los cirujanos evalúen con precisión, lo que complica el equilibrio entre los tratamientos conservadores y la extirpación quirúrgica19. Hasta la fecha, no se dispone de ninguna herramienta eficaz para ayudar a caracterizar esta "zona de sombra" que precede a la conversión de la grabación. El desarrollo de este tipo de herramientas es crucial para optimizar este delicado equilibrio.

Se han probado varios tratamientos para ayudar a disminuir la conversión de quemaduras secundarias. Sin embargo, actualmente no hay ninguna terapia específica disponible en la clínica18. Otros ejemplos de avances en el tratamiento de quemaduras incluyen el desarrollo de apósitos modernos para heridas y nanomateriales20,21, la ingeniería tisular de la piel22,23 y nuevos enfoques de cultivo epidérmico24,25. Además, la cirugía reconstructiva moderna y los colgajos fasciocutáneos han mejorado el manejo de las secuelas a largo plazo, en particular las contracturas por quemaduras después de la cicatrización patológica de las áreas de pliegues26,27. Estos avances ofrecen perspectivas prometedoras para los pacientes quemados, mejorando sus estrategias de tratamiento y su calidad de vida, pero los resultados recientes muestran que el impacto funcional sigue siendo sustancial, tanto en la esfera física como en la psicológica28. En conjunto, la demanda de avances innovadores tanto en el diagnóstico como en el tratamiento de quemaduras es sustancial.

En general, muchos enfoques tienen como objetivo mejorar el diagnóstico, el manejo y el tratamiento de los casos complejos de quemaduras, y los investigadores necesitan un modelo reproducible y relevante para probar estos nuevos enfoques. Debido a su complejidad biológica, que involucra varios órganos y reacciones sistémicas, ningún modelo in vitro demostró ser relevante para estudiar el proceso de la herida por quemadura29. Los modelos de roedores han mostrado grandes discrepancias con los humanos debido a las grandes diferencias en la biología, la arquitectura de la piel, la elasticidad y la falta de adherencia a las estructuras subyacentes29. En contraste, el modelo porcino ha demostrado ser relevante debido a la similitud estructural de la piel porcina con la piel humana 30,31,32. Se presenta con una vascularización, composición de fibras elásticas y tiempo de renovación similares. Además, el folículo piloso y los anexos apocrinos permiten la reepitelización en isla, como se puede observar en las quemaduras clínicas superficiales 33,34. Más específicamente, los modelos de minicerdos de Yucatán proporcionan características interesantes, lo que los hace relevantes para el estudio de la piel pigmentada35 y los resultados a largo plazo con cambios físicos mínimos36.

El propósito de este artículo es describir un modelo confiable de quemaduras multigrado en cerdos de Yucatán, que permita el estudio de varias quemaduras de segundo y tercer grado sobre el mismo tema. Esto proporciona un modelo relevante y reproducible para estudiar las innovaciones diagnósticas y terapéuticas para el tratamiento de las quemaduras. Además, este modelo presenta diferentes tipos y gravedad de quemaduras, un seguimiento a largo plazo que permite el estudio de la contractura de las quemaduras y la cicatrización patológica, y el comportamiento diferencial de la piel pigmentada, que se sabe que tiene características específicas.

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Protocolo

Todo el trabajo con animales se realizó de acuerdo con la lista de verificación ARRIVE (Animal Research: Reporting In Vivo Experiments)37 y cumplió con el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) del Hospital General de Massachusetts bajo el protocolo #2021N000271. Se brindó un cuidado humanitario a los animales, siguiendo la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio38. Para estos experimentos se utilizaron cinco minicerdos hembra de Yucatán de 30 kg. Los animales se obtuvieron de una fuente comercial (ver Tabla de Materiales).

1. Cuidados preoperatorios y anestesia

  1. Ayuna a los animales durante 12 h antes de la anestesia general.
  2. Iniciar la anestesia mediante una inyección intramuscular de 2-4 mg/kg de clorhidrato de tiletamina y clorhidrato de zolazepam y 1-2 mg/kg de xilacina, seguida de inhalación de isoflurano (2-3% en oxígeno) (ver Tabla de Materiales) para mantener la anestesia durante el procedimiento.

2. Diseño y aleatorización de heridas por quemaduras

  1. Con el fin de estudiar las quemaduras de espesor parcial y total con controles negativos en el mismo animal (sin variación interindividual), se crean ocho heridas en el dorso de cada cerdo en la zona paravertebral. Realice tres heridas de espesor total, tres heridas de espesor parcial y dos heridas de control.
  2. Numere las heridas del 1 al 8 y realice la aleatorización para asignar diferentes grados de quemadura (espesor parcial, espesor completo, control) a diferentes ubicaciones anatómicas de la espalda.
    NOTA: Se realiza una aleatorización de cada herida (profundidad y localización) para mejorar la significación: Se sabe que la dermis de cerdo varía en términos de grosor y composición de colágeno39. Por lo tanto, se utiliza la aleatorización de cada animal para disminuir los posibles sesgos.

3. Delimitación de la herida del tatuaje

NOTA: El primer procedimiento consiste en crear tatuajes circulares en el dorso del cerdo con el fin de localizar y numerar las heridas aleatorias (Figura 1). Esto se realiza dos días antes del procedimiento de quema inicial para permitir una mejor aclimatación, pero se puede realizar el día del procedimiento de quema.

  1. Después de la anestesia (ver Paso 1) y de la intubación orotraqueal en decúbito supino40, coloque al cerdo en decúbito prono y coloque cuñas blandas (sábanas) debajo del animal para su comodidad y estabilización (debajo de las extremidades anteriores, el área umbilical y las extremidades posteriores)41. Coloque una manta térmica de aire forzado en la cabeza y el cuello del animal para mantener una temperatura corporal adecuada.
  2. Coloque una línea recta en el centro del lomo del cerdo para permitir la simetrización de los dibujos.
  3. Dibuje dos líneas verticales con un bolígrafo dermográfico (ver Tabla de Materiales) a ambos lados de la línea central, colocadas a 6,5 cm lateralmente de ella. Las dos líneas laterales se utilizarán para colocar el centro de los círculos.
  4. Dibuja cada par de círculos de 4,5 cm de diámetro simétricamente, manteniendo una distancia mínima de 4 cm entre dos círculos distintos (Figura 1A).
  5. Una vez realizados los dibujos, realice una preparación cutánea de un solo paso (povidona-yodo 7,5%) para disminuir la flora bacteriana de la piel.
  6. Realice el procedimiento de tatuaje42 de ocho círculos de 4,5 cm utilizando una máquina de tatuar con aguja, tinta negra estéril y una aguja esterilizada de 5 puntos (ver Tabla de Materiales). El resultado final se presenta en la Figura 1B.
  7. En caso de un procedimiento de creación de quemaduras tardías, aplique ungüento triple antibiótico sobre los tatuajes y cúbralo con apósitos adhesivos transparentes.

4. Creación de heridas por quemaduras y apósito avanzado para heridas

NOTA: Las quemaduras se crearán colocando el bloque de latón en contacto con la piel en el punto dedicado (aleatorización) durante 30 s (invariable). La temperatura determinará la profundidad de combustión.

  1. El día del procedimiento de quema, una vez que el animal esté anestesiado y colocado en posición prona como se discutió en el Paso 1, coloque bloques cilíndricos de latón en recipientes de acero inoxidable llenos de cuentas de aluminio (consulte la Tabla de materiales). Coloque los recipientes en una placa calefactora con temperatura controlada. Ajuste una placa calefactora a 65 °C (para las quemaduras de espesor parcial) y la segunda a 93 °C (para la combustión de espesor completo, Figura 2).
    NOTA: El recipiente puede mantenerse seco para evitar quemaduras por escaldaduras (se necesitan 2-3 h para alcanzar el equilibrio de temperatura) o medio lleno de agua (30 min para alcanzar el equilibrio de temperatura). Si se utiliza agua, los bloques de latón deben secarse completamente antes del paso 4.5 para evitar quemaduras posteriores debido a quemaduras.
  2. Inserte un termómetro en el cilindro de latón a través de su abertura central para controlar su temperatura central y confirme la temperatura de la superficie con una pistola de temperatura. Si es necesario, aumente la temperatura de la placa calefactora a 65 °C o 93 °C en el cilindro a pesar de una pequeña disipación de calor.
    NOTA: Se puede utilizar papel de aluminio para cubrir el recipiente y minimizar aún más la disipación de calor, alcanzando la temperatura deseada más rápido.
  3. Paralelamente, coloque al animal en posición prona para el procedimiento de quema, similar al procedimiento de tatuaje (paso 3.1).
  4. Una vez que el animal esté listo en posición prona, prepare la piel en tres pasos (povidona yodada 7,5%, solución salina 0,9%, secado).
  5. Agarra el bloque de latón con guantes resistentes al calor y colócalo en el lugar dedicado al tatuaje, dependiendo de la aleatorización. Inicie el temporizador tan pronto como el bloque de latón toque la piel. Tenga cuidado de no aplicar más presión sobre la piel que el propio peso del bloque de latón.
  6. Después de 30 s, retire el bloque de latón de la piel y vuelva a colocarlo en su recipiente de calentamiento dedicado. Controle la temperatura hasta que alcance el objetivo y repita el procedimiento para todas las heridas.
  7. Realice un apósito multicapa avanzado para garantizar la estabilidad del apósito después de que el animal se haya recuperado.
    1. Coloque una gasa impregnada de petróleo en cada lugar de la quemadura, incluidos los controles, y cúbrala con una gasa no tejida seca y un apósito adhesivo transparente grande.
    2. Rocíe una tintura de solución de benjuí sobre la piel circundante para una mejor adherencia de los apósitos transparentes a la piel.
    3. Envuelva al animal en un apósito adhesivo autoadhesivo mientras presta atención a no apretarlo demasiado (restricción de los volúmenes pulmonares).
    4. Completar el apósito añadiendo una última capa de jersey tubular (tamaño adaptado al animal) (ver Tabla de Materiales). Alternativamente, se pueden usar chaquetas porcinas personalizadas si el animal no puede mantener el apósito limpio durante la duración del estudio
    5. Asegurar una correcta analgesia colocando un parche transdérmico opioide (fentanilo) en el cuello del animal después de inyectar una dosis única de buprenorfina (0,05-0,1 mg/kg, IM) y una dosis única de carprofeno (2-4 mg/kg, IM).
    6. Después de cada anestesia, vigile de cerca a los animales hasta 2 horas después de la recuperación. Use una almohadilla tibia si es necesario y proporcione comida libremente después de alcanzar una posición de pie completa.

5. Escarotomía por quemadura de espesor completo

NOTA: Entre 1 y 3 días después de la operación, los animales recibirán una escisión quirúrgica de espesor completo de la escara después de las quemaduras de tercer grado.

  1. Después de una preparación similar del animal, incluida la anestesia, la intubación y la colocación del animal en posición supina, prepare la piel a través de la preparación de la piel en tres pasos, realice un drapeado estéril de la espalda del animal.
  2. Realizar biopsias con sacabocados de 4 mm (ver Tabla de Materiales) en la herida para confirmar el tipo de lesión.
  3. Realizar la escarotomía43,44 mediante una incisión circular de la escara con una hoja de bisturí estéril (n°15) hasta llegar a la dermis profunda.
  4. Sujete firmemente un lado de la escara con un par de pinzas de tejido Adson estériles (con 2/1 dientes) (consulte la Tabla de materiales) y engántela hacia arriba para revelar el límite profundo de la escara.
  5. Continúe la escarotomía con la hoja del bisturí mientras permanece en el mismo plano dentro de la dermis profunda/fascia subyacente. Una dermis sangrante se considera un signo de viabilidad de los tejidos.
    1. Si se corta una arteriola durante el proceso, realice una cauterización mínima con pinzas de coagulación bipolar (consulte la tabla de materiales). PRECAUCIÓN: La cauterización extensa del lecho de la herida creada puede resultar en una cicatrización tardía y debe evitarse estrictamente.
  6. Colocar una primera capa de guaze seco en el lecho de la herida durante 5 minutos para potenciar la hemostasia local antes de colocar el apósito definitivo.
  7. Venda las heridas de manera similar a como se hizo anteriormente (paso 4.7), con la adición de varias gasas secas para llenar la cavidad. Aplique las mismas capas que se mencionaron anteriormente: tintura en aerosol de benjuí, apósito adhesivo transparente, envoltura autoadhesiva, jersey tubular.
  8. Proporcionar analgesia cambiando el parche transdérmico opioïd e inyectando Caprofeno (2-4 mg/kg, IM).

6. Apósitos de seguimiento para heridas

NOTA: Los apósitos posteriores se realizan cada 2 a 7 días, dependiendo del diseño del tratamiento experimental y de la tolerancia del animal. Los apósitos para heridas se pueden suspender después de 21 días para permitir la reepitelización en un ambiente seco y mejorar la tolerancia del animal. Alternativamente, si el grupo de tratamiento requiere un ambiente húmedo o mojado, los apósitos pueden prolongarse hasta el final del estudio. El periodo de seguimiento se amplió hasta 10 semanas con el fin de estudiar tanto los procesos de curación agudos como los prolongados.

  1. Anestesiar al animal durante un breve periodo de tiempo y colocarlo en posición supina con un cono nasal (isoflurano 2-5 L/min).
  2. Retirar los apósitos anteriores y limpiar las heridas con suero fisiológico estéril al 0,9% y gasa estéril.
  3. Aplicar el tratamiento experimental si procede.
  4. Del mismo modo, realice biopsias posteriores durante este procedimiento si el estudio lo requiere. A continuación, el animal debe recibir analgésicos como el carprofeno (2-4 mg/kg, IM, efecto de 24 h).
  5. Cubra todas las ubicaciones de la herida, incluidas las heridas de control, con gasa impregnada de petróleo o equivalente, gasa seca no tejida y apósito transparente adhesivo.

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Resultados

La Figura 2A, B muestra los resultados de múltiples quemaduras en el dorso de un minicerdo de Yucatán. Las heridas (I) y (VII) son heridas de control (37 °C). Heridas de segundo grado (II; III y VIII) se presentan con enrojecimiento intenso y ampollas. Por el contrario, las heridas de tercer grado (IV; V; y VI) son pálidos e indurados a la palpación. Cabe señalar que la herida VIII parece intermedia entre el segundo y el tercer grado: para el propósito de un estudio en curso...

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Discusión

La cicatrización de heridas después de lesiones por quemaduras es un proceso largo que puede durar hasta varios meses, con varias opciones de tratamiento y consideraciones para el cuidado del paciente 2,13. Para poder estudiarlo se necesita un modelo fiable y reproducible. Se han descrito varios modelos animales, incluyendo principalmente roedores 29,45,46 y cerdos

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Divulgaciones

Los autores no tienen ningún conflicto de intereses que declarar.

Agradecimientos

Este trabajo contó con el generoso financiamiento de la Subvención de Investigación del Hospital Shriners para Niños S.N.T. Y.B. contó con el apoyo del Hospital Shriners para Niños. También agradecemos la financiación a S.N.T. del Instituto Nacional de Salud de EE. UU. (K99/R00 HL1431149; R01HL157803; R01DK134590, R24OD034189), la Asociación Americana del Corazón (18CDA34110049), la Beca Eleanor y Miles Shore de la Facultad de Medicina de Harvard, la Fundación de la Familia Polsky y el Premio Claflin Distinguished Scholar en nombre del Departamento de Cirugía de MGH y/o el Comité Ejecutivo de Investigación de MGH. Además, reconocemos el apoyo brindado por el Comité Ejecutivo de Investigación del Hospital General de Massachusetts para otorgar el premio del Fondo para el Descubrimiento Médico (FMD) a R.J. Por último, se agradece el apoyo de la "Fondation des Gueules Cassées" (Francia), la Universidad de Rennes (Francia), el CHU de Rennes (Francia) y la Sociedad Francesa de Cirugía Plástica a Y.B. Los autores agradecen al Laboratorio de Investigación de Cirugía Knight por su contribución y ayuda con la anestesia de los animales.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
pinza de tejido AdsonJarit130-234
Cuentas de aluminioLab Armor42370-002Lab Armor Beads 
Clorhidrato de buprenorfinaRanbaxy PharmaceuticalsNDC: 12469-0757-01Buprenex Carprofeno inyectable
PfizerNADA 141-199Rymadyl 50 mg / ml inyectable 
Bloque cilíndrico de latónHecho a manoN/ADibujo de ingeniería incluido en el manuscrito
Pluma dermográficaMcKessonMarcador de piel quirúrgico Estéril
Desechable #15 Bisturíes quirúrgicosMedlineMDS15315Hojas de bisturí Parche de
fentaniloMylanNDC:60505-7082Fentanilo Sistema transdérmico
Isoflurano PiramalNDC:66794-013-25Isoflurano, USP
McPherson Pinzas de coagulación bipolarBovieA842Punzones
de biopsia surtidos Miltex reutilizables y esterilizables en autoclave (3,4 y 5 mm)Integra33-38Punzones de biopsia: tamaño para adaptarse al estudio Gasa
no tejidaStarryshineGZNW222 x 2" no tejida de 4 capas almohadillas de gasa médica
Povidona YodadaBetadineNDC:0034-9200-88Exfoliante quirúrgico 7.5% 
Solución estéril isotónica de cloruro de sodio 0.9%Aqualite SystemRL-2095Solución salina estéril
Tinta para tatuajesSpaulding & RogersBlack - 2 oz - #9053
Rotulador de tatuajesSpaulding & RogersSpecial Electric Tattoo Marker
Aguja de tatuajeSpaulding & Rogers1310251Tattoo Aguja de 5 puntos
Tegaderm Apósito de película transparente3M1.628Apósito adhesivo transparente grande
Placa calefactora con controlde temperatura Cole-Parmer03407-11StableTemp agitador de placa calefactora
TermómetroAmerican ScientificU14295Termómetro de mercurio
de tubo Clorhidrato detiletamina y zolazepamZoetisNDC: 54771-9050telazol
de benjuí en aerosolSmith& Nephew407000Spray de capa adhesiva
Triple Pomada antibióticaFougeraNDC 0168-0012-31Pomada antibiótica
triple Stockinette tubularMedlineNONNET02Curad Medline Redes elásticas sin látex
Manta térmica3MBair Hugger 750 unidad
Xeroform Tira de gasa oclusivaCovidien8884433301Apósitos para heridas de vaselina Xeroform
XilacinaVetoneNDC:13985-704-10AnaSed LA
Yucatà n minicerdos (hembra, 30 kg)Sinclair Bio ResourcesN/A Pigmentacióncompleta 
Tintura de de calentamiento

Referencias

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