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El establecimiento de defectos compuestos óseo y de sutura de calvario en ratas: un modelo estandarizado para la investigación de la terapia regenerativa de sutura

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DOI:

10.3791/66417

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10 de mayo de 2024

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1State Key Laboratory of Oral Diseases & National Center for Stomatology & National Clinical Research Center for Oral Diseases, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University, 2Department of Endodontics, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University

En este artículo

Resumen

Describimos los procedimientos quirúrgicos detallados de los defectos del compuesto óseo y sutura de calvario en ratas, junto con las investigaciones sobre los pronósticos a corto y largo plazo del modelo. Nuestro objetivo es construir un modelo estandarizado para el desarrollo de terapias regenerativas de sutura.

Resumen

Los defectos de la pantorrilla a gran escala a menudo coinciden con la ruptura de la sutura craneal, lo que lleva a deficiencias en la restauración del defecto de la pantorrilla y el desarrollo del cráneo (este último ocurre en el cráneo en desarrollo). Sin embargo, la falta de un modelo estandarizado dificulta el progreso en la investigación de las terapias regenerativas con sutura y plantea desafíos para realizar análisis comparativos entre distintos estudios. Para abordar este problema, el protocolo actual describe el proceso de modelado detallado de los defectos compuestos óseos de sutura de calvario en ratas.

El modelo se generó perforando agujeros rectangulares de espesor completo que miden 4,5 mm × 2 mm a través de las suturas coronales. Las ratas fueron sacrificadas y las muestras de cráneo se recolectaron postoperatoriamente en el día 0, semana 2, semana 6 y semana 12. Los resultados de la μCT de las muestras recogidas inmediatamente después de la cirugía confirmaron el establecimiento exitoso del defecto compuesto de sutura ósea, que implicó la extirpación de la sutura coronal y los tejidos óseos adyacentes.

Los datos de la6ª y12ª semanas postoperatorias demostraron una tendencia natural a la cicatrización del defecto. La tinción histológica validó aún más esta tendencia al mostrar un aumento de las fibras mineralizadas y hueso nuevo en el centro del defecto. Estos hallazgos indican una fusión progresiva de la sutura a lo largo del tiempo después de los defectos de la pantorrilla, lo que subraya la importancia de las intervenciones terapéuticas para la regeneración de la sutura. Anticipamos que este protocolo facilitará el desarrollo de terapias regenerativas de sutura, ofreciendo nuevos conocimientos sobre la restauración funcional de los defectos de la pantorrilla y reduciendo los resultados adversos asociados con la pérdida de sutura.

Introducción

Las suturas craneales son conexiones fibrosas densas entre los huesos craneales, que actúan como articulaciones para facilitar un ligero movimiento del cráneo y proporcionan un colchón protector para el cerebrobajo presión. En los últimos años, el aumento de la investigación ha puesto de manifiesto el papel fundamental de las suturas craneales en el desarrollo del cráneo, la homeostasis craneofacial y el potencial osteoreparador inherente 2,3,4,5,6,7,8. Durante los períodos de crecimiento y desarrollo, las suturas craneales actúan como los principales centros de crecimiento en el cráneo4. La formación de hueso nuevo ocurre en los frentes osteogénicos a ambos lados de las suturas, mientras que las células dentro de las suturas mantienen un estado mesenquimal indiferenciado, lo que garantiza una expansión equilibrada del cráneo junto con el crecimiento del cerebro1. La pérdida de suturas craneales en este momento resulta en una discrepancia entre el crecimiento del cráneo y el cerebro, lo que lleva a problemas graves como lesiones cerebrales, hidrocefalia, aumento de la presión intracraneal y disfunción cognitiva 3,9.

Además, las suturas craneales juegan un papel crucial en la determinación del pronóstico de los defectos de la pantorrilla 5,7,10. El potencial regenerativo a través de la superficie de la pantorrilla está distribuido de manera desigual, con suturas craneales que muestran capacidades notablemente superiores en comparación con las regiones sin sutura10,11. Un estudio indica que la velocidad de cicatrización del defecto de la pantorrilla se correlaciona inversamente con la distancia entre la sutura craneal y el sitio de la lesión10. Específicamente, la extirpación de las suturas coronales y sagitales conduce a la no cicatrización de los defectos del hueso parietal7, enfatizando la necesidad de la regeneración de la sutura en los defectos del pantorrilla. Sin embargo, los estudios actuales se centran principalmente en la restauración de la estructura ósea craneal, descuidando la regeneración del mesénquima de sutura.

En cuanto a los avances en la regeneración de suturas, se han observado resultados prometedores con el trasplante de colgajos óseos que contienen suturas, células madre mesenquimales (MSC) y biomateriales artificiales. Cuando los colgajos óseos con suturas se trasplantaron a defectos del pantorrilla, se integraron y cicatrizaron con éxito, en contraste con aquellos sin suturas que mostraron falta de artrosis e incapacidad para formar periostio, duramadre u osteocitos5. Del mismo modo, la implantación de MSCs derivadas de la médula ósea en defectos sagitales de sutura ósea facilitó la formación de espacios similares a suturas12. Cabe destacar que un estudio reciente destacó la realización de la regeneración de suturas con MSC Gli1+, lo que permite el control de la presión intracraneal, la corrección de la deformidad del cráneo y la mejora de la función neurocognitiva13. A medida que la medicina regenerativa y la ingeniería biomédica se desarrollan, los investigadores se centran cada vez más en los biomateriales de ingeniería de tejidos debido a sus características adaptables y personalizables14. En particular, las membranas de politetrafluoroetileno han demostrado ser efectivas en la reconstrucción del hueso craneal y el mesénquima de sutura simultáneamente15,16.

Sin embargo, la investigación craneofacial carece de modelos establecidos para explorar las terapias regenerativas mesenquimales de sutura, a diferencia de los modelos relativamente maduros en la reparación de otros tejidos como el hueso, la piel, el cartílago y los músculos17. La ausencia de un modelo estandarizado restringe el estudio de las terapias regenerativas con sutura y dificulta la realización de análisis comparativos entre diferentes estudios. Por lo tanto, nuestro estudio estableció un defecto compuesto óseo de sutura calvarial de rata practicable y reproducible. A través de este método, nuestro objetivo es desarrollar intervenciones clínicas adecuadas para la reconstrucción de la sutura craneal, ofreciendo perspectivas novedosas sobre la reparación funcional de los defectos de la pantorrilla y disminuyendo los resultados desfavorables resultantes de la pérdida de sutura.

Protocolo

Todos los procedimientos con animales de este estudio fueron revisados y aprobados por el Comité de Ética de la Escuela de Estomatología de China Occidental de la Universidad de Sichuan (WCHSIRB-D-2021-597). Un total de 12 ratas Sprague-Dawley (SD) (machos, 300 g, 8 semanas de edad) (3 ratas en cada uno de los cuatro puntos temporales) se obtuvieron de una fuente comercial (ver Tabla de Materiales).

1. Preparación prequirúrgica

  1. Artículos quirúrgicos
    1. Prepare los instrumentos quirúrgicos que se muestran en la Figura 1A, incluyendo pinzas curvas, un bisturí estéril desechable, un elevador perióstico, una aguja de irrigación, bolas de algodón, una pieza de mano de baja velocidad, un motor quirúrgico, fresas redondas dentales de baja velocidad (Figura 1B, 1,2 mm y 0,8 mm de diámetro, respectivamente), un soporte para agujas, suturas de monofilamento 3-0 y una tijera recta.
  2. Esterilización y desinfección
    1. Esterilice los instrumentos mediante esterilización por vapor (125-135 °C, 20-25 min) con anticipación.
    2. Use etanol para esterilizar equipos médicos sensibles al calor, como máquinas de afeitar eléctricas.
    3. Utilice telas médicas no tejidas estériles para cubrir la plataforma de operación y desinfecte el entorno circundante con etanol al 75%.
  3. Anestesia
    1. Prepare a los animales para la cirugía con un período de aclimatación de 1 semana.
    2. Inyecte a las ratas por vía intraperitoneal xilacina (10 mg/kg) y ketamina (100 mg/kg) 20 minutos antes de la cirugía para anestesia o utilice cualquier protocolo anestésico adecuado para lograr la anestesia general.
      NOTA: El cóctel anestésico de ketamina-xilacina administrado por vía intraperitoneal en ratas suele hacer efecto en 10-15 minutos, alcanzando el pico de anestesia alrededor de 35-40 minutos después de la inyección. Para prevenir la hipotermia durante la anestesia, es mejor colocar a las ratas sobre una almohadilla térmica.
    3. Administrar una inyección subcutánea preoperatoria de carprofeno a 5 mg/kg para proporcionar analgesia.
    4. Use el "método de pellizcar los dedos de los pies" para determinar si las ratas están conscientes y responden o no.

2. Proceso quirúrgico

  1. Preparación del sitio
    1. Coloque a la rata en posición prona con la cabeza extendida naturalmente verticalmente, sin necesidad de dispositivos especiales o restricciones para mantener esta postura (Figura 2A).
    2. Aplique ungüento veterinario, es decir, vaselina, en los ojos de la rata para prevenir la sequedad de la córnea.
    3. Retire el vello del cuero cabelludo entre el puente nasal y la articulación de la columna cervical con una afeitadora eléctrica (Figura 2B). Desinfecte el área quirúrgica con movimientos circulares irradiando desde el centro con una solución de yodóforo al 2% seguida de etanol al 75%. Emplea un paño quirúrgico para cubrir el dorso del animal y el pelaje que rodea la incisión.
  2. Apertura del centro quirúrgico
    1. Comenzando desde el punto medio del hueso nasal, haga una incisión cutánea longitudinal de 2 cm con un bisturí desechable siguiendo la línea media del cráneo (Figura 2C).
    2. Realice una incisión perióstica en la línea media reflejando el punto inicial y la extensión de la capa de piel con un bisturí (Figura 2D). Luego, levante suavemente el periostio a ambos lados de la incisión con un elevador perióstico (Figura 2E1) para exponer los huesos parietales, los huesos frontales y las suturas coronales (Figura 2E2).
      NOTA: Al incidir el periostio, tenga cuidado de no dañar las suturas craneales para evitar un sangrado excesivo al cortar. La exposición adecuada de la sutura coronal es de suma importancia para los siguientes procedimientos.
    3. Enjuague la herida con solución salina y seque el área quirúrgica con bolas de algodón.
  3. Establecimiento del modelo de defecto compuesto óseo y sutura
    1. Ajuste el motor quirúrgico a 35,000 rpm girando la perilla (Figura 1A, flecha amarilla), luego encienda el interruptor (Figura 1A, flecha blanca).
    2. Comenzando desde cualquier punto de la sutura coronal, aplique fuerza vertical con una fresa redonda de 1,2 mm de diámetro hasta que se sienta una sensación de avance.
      NOTA: Se recomienda el punto medio de la sutura coronal (indicado por flechas amarillas en la Figura 2E2) como punto de partida para la penetración. Al moler, los taladros dentales deben mantenerse perpendiculares a la superficie craneal. Tenga cuidado de no continuar perforando después de penetrar todo el grosor del cráneo para evitar cualquier daño adicional a las ratas, incluido el daño cerebral o la hemorragia cerebral.
    3. Desde el punto de penetración, mueva la fresa lateralmente a lo largo de la sutura coronal para crear una ranura de posicionamiento de aproximadamente 4 mm de largo (Figura 2F1). Retire el tejido óseo con la fresa a ambos lados de la ranura de posicionamiento para formar inicialmente un defecto rectangular de espesor completo (Figura 2F2).
    4. Emplee una fresa redonda de 0,8 mm de diámetro para refinar los detalles (Figura 2G1), lo que implica el rectificado de ángulos rectos y el suavizado de los márgenes de defectos, logrando finalmente un defecto rectangular estándar que mide 2 mm de ancho y 4,5 mm de largo (Figura 2G2).
      NOTA: Para lograr la extirpación completa de la sutura coronal mientras se preservan las suturas sagital y frontal en ratas SD de 300 g, la longitud máxima posible del defecto es de aproximadamente 4,5 mm. Considerando el ancho de la sutura coronal en la dirección antero-posterior (Figura Suplementaria S1), el ancho del defecto se estableció en 2 mm.
    5. Cree dos defectos en las mitades izquierda y derecha de la sutura coronal para la autocomparación.
    6. Mantenga la irrigación continua de la solución salina durante el procedimiento de perforación para protegerse contra lesiones térmicas en el cráneo y el cerebro. Mientras tanto, use bolas de algodón para secar el área de operación.
  4. Verificación de la dimensión de la muestra
    1. Verifique regularmente la longitud y el ancho de los defectos utilizando un calibrador vernier (Figura 2H1, H2) para garantizar la consistencia en todas las muestras.
  5. Cierre del sitio quirúrgico
    1. Cierre la piel con suturas de monofilamento 3-0 (Figura 2I).
  6. Postoperatorio inmediato microtomografía computarizada in vivo (μCT)
    1. Si es posible, se deben realizar tomografías computarizadas in vivo en todas las ratas inmediatamente después de la cirugía para confirmar el éxito del procedimiento quirúrgico y monitorear las tendencias de recuperación de defectos para cada individuo.

3. Cuidados postquirúrgicos

  1. De acuerdo con los protocolos de cuidado animal, administrar analgésicos establecidos según sea necesario después de la cirugía, por ejemplo, carprofeno (5 mg/kg, uso subcutáneo).
  2. Transfiera las ratas a una almohadilla térmica constante (37 °C) para la recuperación postoperatoria.
  3. Una vez que estén completamente conscientes, reubique a las ratas en su jaula de alojamiento que contenga ropa de cama limpia.
    NOTA: Monitoree continuamente a las ratas después de la cirugía. No los deje desatendidos hasta que puedan mantener la decúbito esternal. Mantenga a las ratas operadas aisladas de las demás hasta que se recuperen por completo.
  4. Realizar el manejo de la analgesia y el seguimiento postoperatorio durante 24 h, seguido de evaluaciones diarias durante la primera semana después de la cirugía. A partir de entonces, monitoree a las ratas al menos 1-2 veces por semana.

4. Recogida de muestras y análisis de datos

  1. Preparación de la muestra
    1. Recoja muestras de cráneo en el día postoperatorio 0, semana 2, semana 6 y semana 12. Sacrificar a las ratas mediante inhalación de CO2 .
    2. Fijar las muestras en paraformaldehído al 4% a 4 °C durante 24 h antes de continuar con el análisis.
  2. Evaluación de μCT
    1. Realizar tomografías computarizadas en huesos craneales del postoperatorio día 0, semana 6, semana 12 con los siguientes parámetros de exploración: potencial del tubo de rayos X, 70 kVp; intensidad de rayos X, 0,2 mA; filtro, AL 0,5 mm; tiempo de integración, 1 x 300 ms; y tamaño de vóxel, 10 μm.
    2. Obtenga imágenes de reconstrucción 3D y de corte transversal con software de procesamiento de imágenes (ver Tabla de Materiales).
    3. Mida el volumen de defectos residuales y realice análisis estadísticos con el software correspondiente (consulte la tabla de materiales).
  3. Tinción histológica
    1. Descalcificar los huesos craneales en una solución de ácido etilendiaminotetraacético al 12% (p/v) (pH = 7,2) a 4 °C durante 6 semanas.
      NOTA: Descalcifique las muestras con cambios de solución cada 3 días. Utilice una coctelera para acelerar el proceso. La finalización está indicada cuando una aguja de 25 G penetra fácilmente en la muestra.
    2. Proceda con la deshidratación, la inclusión en parafina y la preparación de secciones de 6 μm utilizando protocolos estándar18.
    3. Realizar análisis histológicos utilizando hematoxilina y eosina (H&E) y tinción tricrómica de Masson siguiendo el protocolo18 del kit.

Resultados

En este estudio, el defecto compuesto de sutura calvarial de rata y hueso se estableció mediante la perforación de un orificio rectangular de 4,5 mm x 2 mm a través de la sutura coronal. La ilustración esquemática quirúrgica y el diagrama de flujo de la investigación se muestran en la Figura 3. La imagen 3D y la vista transversal de las muestras postoperatorias de 0 días, es decir, las muestras recogidas inmediatamente después de la cirugía, confirmaron la creación exitosa de un defecto de la pantorrilla de espesor completo, que implicó la extirpación completa de la sutura coronal, así como de las estructuras óseas adyacentes en ambos extremos (Figura 4A). Las imágenes de μCT y los resultados del análisis estadístico correspondiente a las 6 semanas después de la operación revelaron una inclinación natural hacia el cierre del defecto acompañado de nódulos calcificados irregulares formados dentro del defecto (Figura 4). Esta tendencia se acentuó a las 12 semanas de la cirugía (Figura 4), lo que indica la posible fusión de la sutura a medida que avanzaba el tiempo. Se realizaron análisis histológicos adicionales utilizando H&E y tinción tricrómica de Masson. Dos semanas después de la operación, observamos una notable extensión y continuidad del periostio y la duramadre, que formaron un tejido fibroso denso y grueso y sellaron eficazmente el área defectuosa (Figura 5). Cabe destacar que, en este momento temprano, se detectó la aparición de fibras mineralizadas teñidas de azul, cuya presencia experimentó un aumento sustancial a las 6 semanas después de la cirugía (Figura 5). A las 12 semanas del postoperatorio, se observaron grandes trozos de hueso nuevo en el centro del defecto (Figura 5), lo que reconfirmó el pronóstico adverso de calcificación estromal y cierre de sutura. Los resultados naturales desfavorables de la cicatrización de los defectos del compuesto óseo de sutura enfatizan la necesidad de la regeneración de la sutura craneal a través de intervenciones terapéuticas, como la implantación de biomateriales 13,15,16.

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Figura 1: Instrumentos quirúrgicos. (A) Los artículos quirúrgicos se numeraron en orden de uso, incluyendo (1) pinzas curvas, (2) bisturí estéril desechable, (3) elevador perióstico, (4) aguja de irrigación, (5) bolas de algodón, (6) pieza de mano de baja velocidad, (7) motor quirúrgico (la flecha amarilla representa la perilla de RPM y la flecha blanca representa el interruptor), (8) fresas redondas dentales de baja velocidad, (9) portaagujas, (10) suturas de monofilamento 3-0 y (11) tijera recta. (B) Fresas redondas de baja velocidad de 1,2 mm y 0,8 mm de diámetro. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Procedimiento quirúrgico. (A) Coloque a la rata en posición prona. (B) Afeitar el vello del cuero cabelludo con una afeitadora eléctrica. (C) Incidir la piel con un bisturí desechable. (D) Incidir el periostio con un bisturí. (E1, E2) Eleve el periostio para exponer las suturas coronales con un elevador perióstico. Las flechas amarillas indican suturas coronales. (F1) Diámetro interior de una ranura de posicionamiento. (F2) Cree preliminarmente un defecto rectangular con una fresa redonda de 1,2 mm. (G1, G2) Recorte el defecto con una fresa redonda de 0,8 mm para obtener una forma rectangular estándar de 4,5 x 2 mm. (H1, H2) Calibre el ancho y el largo del defecto con un calibrador vernier. (I) Cerrar la piel con suturas de monofilamento 3-0. Esta representación utiliza un cadáver, que se deja deliberadamente sin cortinas para facilitar una mejor visualización anatómica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Ilustración esquemática del defecto compuesto de sutura ósea de la pantorrilla y estrategia de investigación de este estudio. Abreviaturas: H&E = hematoxilina y eosina; μCT = microtomografía computarizada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: Tendencia al cierre del defecto compuesto óseo de sutura de calvario. (A) Imágenes representativas de μCT y vistas transversales de defectos de composite óseo de sutura en el día postoperatorio 0, semana 6 y semana 12. Las secciones transversales representan las ubicaciones indicadas por las líneas discontinuas amarillas en las imágenes 3D. Barras de escala = 2 mm. (B) Análisis cuantitativo del volumen de defectos residuales postoperatorios a través de evaluaciones de μCT. n = 6 réplicas/grupo. Los datos se expresan como media ± DE. ANOVA de un factor seguido de la prueba de comparaciones múltiples de Dunnett. P<0,001. Abreviaturas: PO = postoperatorio; μCT = microtomografía computarizada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 5: Variaciones histológicas en defectos de composite óseo de sutura. (A) H&E y (B) tinción tricrómica de Masson de defectos de composite óseo de sutura en PO semana 2, semana 6 y semana 12. Los contornos discontinuos rojos indican el tejido fibroso que encapsula el área del defecto. Los pentagramas negros representan las fibras mineralizadas teñidas de azul. Los pentagramas amarillos resaltan el hueso nuevo formado en el centro del defecto. Barras de escala = 500 μm; 200 μm (recuadros). Abreviaturas: PO = postoperatorio; H&E = hematoxilina y eosina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura suplementaria S1: Anchura de la sutura coronal en dirección antero-posterior (imagen del calvario del plano sagital). Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

Los modelos convencionales de defectos de la pantorrilla, ya sea que involucren suturas craneales o no, se concentran principalmente en la reparación del tejido duro, a menudo descuidando la regeneración vital del mesénquima de sutura19,20. En la investigación de la regeneración de suturas, los modelos anteriores, como los de Mardas et al.15,16, que utilizaban una fresa de trépano para crear un defecto circular de 5 mm a través de la sutura sagital de ratas, resultaron en una pérdida sustancial de tejido duro, desviándose así del objetivo principal de la regeneración de suturas. Del mismo modo, la metodología de Wilk et al.7, que abarcó la extirpación de las suturas sagital y coronal derecha y la creación de un defecto óseo crítico en el hueso parietal derecho, aunque informativa, introdujo complejidades y posibles variables de confusión debido a la presencia de múltiples sitios de defectos. Por el contrario, nuestro protocolo crea defectos rectangulares bilaterales a lo largo de la sutura coronal, con el objetivo de un modelo de investigación más simplificado y específico. Las principales suturas craneales incluyen las suturas coronal, sagital, metópica y lambdoidea21. A diferencia de las suturas metópicas y sagitales, que se disponen longitudinalmente en el cráneo, las suturas coronales y lambdoideas están situadas transversalmente y pueden dividirse en dos mitades, lo que facilita la creación de dos defectos con condiciones idénticas. A diferencia de la sutura lambdoidea, el campo quirúrgico expuesto por la incisión del cuero cabelludo es más accesible para una serie de procedimientos en la sutura coronal. La creación de defectos en las mitades izquierda y derecha de la sutura coronal y la aplicación de diferentes intervenciones en cada sitio facilita una comparación más directa de distintas terapias a través del autocontrol. Además, este enfoque permite una comparación entre los lados tratados y no tratados, proporcionando información sobre las disparidades entre el proceso de curación intervenido y el proceso de curación natural. Por lo tanto, nuestro estudio sugiere que la creación de defectos de sutura-óseo compuesto en ambos lados de las suturas coronales en ratas es un modelo quirúrgico adecuado para el estudio de terapias sutura-regenerativas.

La selección de las dimensiones del defecto está meticulosamente guiada por consideraciones prácticas y anatómicas. Para este modelo animal específico, el principal desafío radica en eliminar completamente la sutura coronal mientras se conservan las suturas sagital y frontal, con una eliminación mínima del tejido óseo. La estrategia óptima, por lo tanto, implica la creación de un defecto rectangular preciso a lo largo de la sutura coronal. Esta decisión estratégica es indispensable, ya que cualquier mesénquima remanente en la sutura coronal o en las suturas adyacentes podría introducir imprecisiones en la evaluación del verdadero impacto regenerativo del tratamiento. En consecuencia, establecimos la mayor longitud de defecto factible para ratas SD macho de 300 g a aproximadamente 4,5 mm. Además, teniendo en cuenta la anchura de la sutura coronal en dirección anteroposterior (aproximadamente 1,5 mm en el plano sagital, como se muestra en la figura complementaria S1), fijamos la anchura del defecto en 2 mm para asegurar la retirada completa de la sutura desde la superficie craneal hasta su profundidad. Vale la pena señalar que las dimensiones específicas del defecto, tanto en longitud como en anchura, pueden requerir un ajuste basado en factores como el tipo y la edad del animal, así como los objetivos experimentales. Otro estudio creó un defecto rectangular delgado de 0,3-0,4 mm de ancho a lo largo de la sutura coronal, que se adapta al tamaño más pequeño de los ratones13.

Cabe destacar que la dificultad en la generación de este modelo quirúrgico radica en la construcción de defectos rectangulares estándar y uniformes. Es imperativo mantener la consistencia en la forma del defecto para garantizar una dosis uniforme de factores bioactivos en todas las muestras, minimizando así las variaciones entre grupos e intragrupos. En este sentido, durante el proceso de extirpación del complejo sutura-óseo, inicialmente empleamos una fresa redonda de 1,2 mm de diámetro para localizar la sutura coronal y crear un contorno aproximado del defecto rectangular de espesor completo (Figura 1B). Posteriormente, cambiamos a la fresa redonda más pequeña (0,8 mm de diámetro) para refinar los giros en ángulo recto y suavizar los bordes defectuosos (Figura 1B). Para garantizar la consistencia de la longitud y el ancho de cada defecto, se utilizó un calibrador vernier para evitar el esmerilado excesivo o insuficiente durante el proceso de perforación. A pesar de este enfoque, el escaneo μCT reveló que el defecto rectangular que generamos todavía tiene forma de arco (Figura 4), lo que sugiere la necesidad de una mayor optimización del método de modelado para obtener formas de molienda precisas.

Para evaluar el pronóstico, las μCT proporcionan los medios más directos, incluida la evaluación de la cicatrización del tejido óseo y el estado de las suturas craneales, ya sea que estén cerradas o sin obstrucciones. Además, la investigación a nivel histopatológico es esencial para el estudio de la regeneración de las suturas craneales. La tinción histopatológica ayuda a diferenciar la falta de cierre de los defectos debidos a la formación de tejido mesenquimatoso, la inhibición de la restauración ósea o la ocupación de espacio material. Solo los enfoques que facilitan la regeneración del tejido mesenquimal probablemente posean el potencial para la regeneración de la sutura craneal. Además, a pesar de la falta de experimentos relevantes durante la construcción del modelo, se recomienda encarecidamente detectar la expresión a nivel de proteína de los marcadores MSC de la sutura dentro del tejido regenerado después de las intervenciones terapéuticas. Este análisis, en el que se emplean técnicas como la inmunofluorescencia, la inmunohistoquímica o la citometría de flujo, contribuye a confirmar el éxito de la regeneración de las suturas. Los marcadores MSC específicos de sutura incluyen Cd51, Cd200, Gli1, Axin2, Prrx1, Ctsk y más 1,22.

En resumen, este estudio reportó el proceso de modelado detallado de los defectos del compuesto óseo de sutura de calvario en ratas para estudiar el pronóstico de los defectos de la sutura cruzada del calvario y desarrollar terapias apropiadas para la regeneración de las suturas craneales. Es pertinente señalar que el campo de la regeneración de suturas craneales es efectivamente de nicho, sin modelos o métodos estándar prevalentes en la literatura para la regeneración de suturas craneales. Por lo tanto, creemos que nuestro protocolo proporciona una base metodológica sólida para investigar los enfoques regenerativos de sutura e introduce perspectivas innovadoras sobre la restauración funcional de los defectos del pantorroidal, con el objetivo final de mejorar la calidad de vida de los pacientes.

Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

Agradecimientos

Este estudio contó con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China 82100982 (F.L.), 82101000 (H.W.), 82001019 (B.Y.), Departamento de Ciencia y Tecnología de la provincia de Sichuan 2022NSFSC0598 (B.Y.), 2023NSFSC1499 (H.W.) y Financiación de Investigación de la Escuela/Hospital de Estomatología de China Occidental de la Universidad de Sichuan (RCDWJS2021-5). La figura 3 se creó con Biorender.com.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Paraformaldehído al 4%BiosharpBL539A
Solución de yodóforo al 2%Chengdu Jinshan Chemical Reagent Co., Ltd.Ninguno
75% EtanolChengdu Jinshan Reactivo Químico Co., Ltd.Ninguno
Bolas de algodónHaishi Hainuo Group Co., Ltd. Ninguno
Hisopos de algodónLakong Medical Devices Co., Ninguno
Pinzas curvasChengdu Shifeng Co., Ltd.Ninguno
Dataviewer y software Ctan para la evaluación del volumen de defectos residualesBrukerNone
Fresas redondas dentales de baja velocidadDreybird Medical Equipment Co., Ltd.RA3-012
RA1-008
Bisturí estéril desechableHangzhou Huawei Medical Supplies Co., Ltd.Ninguna
Jeringas desechables (22 G)Chengdu Shifeng Co., Ltd.SB1-089(IX)
Afeitadora eléctricaJASEBM320210
Etileno Diamino Ácido tetraacético (EDTA)BioFroxx1340GR500
Kit de tinción de hematoxilina y eosinaBiosharpBL700B
Aguja de irrigación (23 G)Sichuan New Century Medical Polymer Products Co., Ltd.Ninguno
Pieza de mano de baja velocidadGuangzhou Dental Guard Technology Co., Ltd.Ninguno
Masson' s Kit de tinte tricrómicoSolarbioG1340
Telas no tejidas médicasHenan Yadu Industrial Co., Ltd. Ninguno
Microtomografía computarizada (µ TC) Scanco Medical AGµ CT45
Mimics 20.0 para imágenes transversalesMaterialiseNone
PortaagujasChengdu Shifeng Co., Ltd.Ninguno Ascensor
periósticoChengdu Shifeng Co., Ltd.Ninguno Solución
salinaSichuan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd.Ninguno
Software de visualización médica Scanco para la reconstrucción de imágenes en 3DScanco Medical AGNinguno
SPSS Statistics 20.0 para análisis estadísticoIBMNinguno
Ratas Sprague-Dawley Byrness Weil Biotech LtdNinguno
Tijeras rectasChengdu Shifeng Co., Ltd.Ninguno
Motor quirúrgicoMARATHONN3-140232
Suturas quirúrgicas (monofilamento 3-0)Hangzhou Huawei Medical Supplies Co., Ltd.ninguno

Referencias

  1. Li, B., et al. Cranial suture mesenchymal stem cells: insights and advances. Biomolecules. 11 (8), 1129(2021).
  2. Opperman, L. A. Cranial sutures as intramembranous bone growth sites. Dev Dyn. 219 (4), 472-485 (2000).
  3. Lenton, K. A., Nacamuli, R. P., Wan, D. C., Helms, J. A., Longaker, M. T. Cranial suture biology. Curr Top Dev Biol. 66 (4), 287-328 (2005).
  4. Slater, B. J., et al. Cranial sutures: A brief review. Plast Reconstr Surg. 121 (4), 170-178 (2008).
  5. Zhao, H., et al. The suture provides a niche for mesenchymal stem cells of craniofacial bones. Nat Cell Biol. 17 (4), 386-396 (2015).
  6. Maruyama, T., Jeong, J., Sheu, T. -J., Hsu, W. Stem cells of the suture mesenchyme in craniofacial bone development, repair and regeneration. Nat Commun. 7 (1), 10526(2016).
  7. Wilk, K., et al. Postnatal calvarial skeletal stem cells expressing PRX1 reside exclusively in the calvarial sutures and are required for bone regeneration. Stem Cell Reports. 8 (4), 933-946 (2017).
  8. Doro, D. H., Grigoriadis, A. E., Liu, K. J. Calvarial suture-derived stem cells and their contribution to cranial bone repair. Front Physiol. 8, 956(2017).
  9. Kajdic, N., Spazzapan, P., Velnar, T. Craniosynostosis-recognition, clinical characteristics, and treatment. Bosn J Basic Med Sci. 18 (2), 110-116 (2018).
  10. Park, S., Zhao, H., Urata, M., Chai, Y. Sutures possess strong regenerative capacity for calvarial bone injury. Stem Cells Dev. 25 (23), 1801-1807 (2016).
  11. Quarto, N., Behr, B., Longaker, M. T. Opposite spectrum of activity of canonical Wnt signaling in the osteogenic context of undifferentiated and differentiated mesenchymal cells: Implications for tissue engineering. Tissue Eng Part A. 16 (10), 3185-3197 (2010).
  12. Kaku, M., et al. Mesenchymal Stem Cell-Induced Cranial Suture-Like Gap in Rats. Plast Reconstr Surg. 127 (1), 69-77 (2011).
  13. Yu, M., et al. Cranial suture regeneration mitigates skull and neurocognitive defects in craniosynostosis. Cell. 184 (1), e18 243-256 (2021).
  14. Koons, G. L., Diba, M., Mikos, A. G. Materials design for bone-tissue engineering. Nat Rev Mater. 5 (8), 584-603 (2020).
  15. Mardas, N., Kostopoulos, L., Karring, T. Bone and suture regeneration in calvarial defects by e-PTFE-membranes and demineralized bone matrix and the impact on calvarial growth: an experimental study in the rat. J Craniofac Surg. 13 (3), 453-462 (2002).
  16. Kostopoulos, L., Karring, T. Regeneration of the sagittal suture by GTR and its impact on growth of the cranial vault. J Craniofac Surg. 11 (6), 553-561 (2000).
  17. Mosaddad, S. A., Hussain, A., Tebyaniyan, H. Exploring the use of animal models in craniofacial regenerative medicine: A narrative review. Tissue Eng Part B Rev. , (2023).
  18. Tan, X., et al. PgC3Mg metal-organic cages functionalized hydrogels with enhanced bioactive and ROS scavenging capabilities for accelerated bone regeneration. J Mater Chem B. 10 (28), 5375-5387 (2022).
  19. Yazdanian, M., et al. Fabrication and properties of βTCP/Zeolite/Gelatin scaffold as developed scaffold in bone regeneration: in vitro and in vivo studies. Biocybern Biomed Eng. 40 (4), 1626-1637 (2020).
  20. Soufdoost, R. S., et al. In vitro and in vivo evaluation of novel Tadalafil/β-TCP/Collagen scaffold for bone regeneration: A rabbit critical-size calvarial defect study. Biocybern Biomed Eng. 39 (3), 789-796 (2019).
  21. Russell, W. P., Russell, M. R. Anatomy, head and neck, coronal suture. StatPearls. , (2022).
  22. Menon, S., et al. Skeletal stem and progenitor cells maintain cranial suture patency and prevent craniosynostosis. Nat Commun. 12 (1), 4640(2021).

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