Se describe un nuevo método de inyección intraperitoneal (IP) en pez cebra adulto. Cuando se manipulan compuestos tóxicos como la doxorrubicina, este procedimiento es más eficaz que los dos métodos IP descritos anteriormente. La técnica está diseñada para ser fácilmente adoptada por investigadores con experiencia limitada en el modelo de pez cebra.
Artículo de método
Una técnica de inyección intraperitoneal en peces cebra adultos que minimiza el daño corporal y la mortalidad asociada
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En este artículo
Resumen
Resumen
El pez cebra adulto (Danio rerio), que es genéticamente accesible, se está empleando como un valioso modelo de vertebrado para estudiar trastornos humanos como la miocardiopatía. La inyección intraperitoneal (IP) es un método importante que suministra compuestos al cuerpo para probar efectos terapéuticos o generar modelos de enfermedades como la miocardiopatía inducida por doxorrubicina (CID). Actualmente, existen dos métodos de inyección de IP. Ambos métodos tienen limitaciones cuando se manejan compuestos tóxicos como la doxorrubicina, que resultan en efectos secundarios que se manifiestan como daño severo a la forma del cuerpo y muerte de los peces. Si bien estas deficiencias podrían superarse mediante una amplia formación de los investigadores, es deseable un nuevo método de inyección de IP que tenga efectos secundarios mínimos. Aquí, se informa de un método de inyección IP único que es capaz de manejar compuestos tóxicos. Se puede producir una reducción constante de la función cardíaca sin que se produzca una muerte significativa de los peces. La técnica puede ser fácilmente dominada por investigadores que tienen una experiencia mínima con el pez cebra adulto.
Introducción
El pez cebra (Danio rerio) ha ganado atención como un modelo experimental para el estudio de enfermedades humanas porque este animal abarca una alta homología de genes y órganos con los humanos, fertilización externa, facilidad de manipulación genética y transparencia corporal en la madurez temprana, lo que facilita una gran cantidadde aplicaciones de imagen. A diferencia del proceso sencillo de administrar medicamentos directamente al agua para embriones y larvas de pez cebra, la administración de medicamentos a un pez cebra adulto presenta un esfuerzo más complejo y desafiante.
En los peces adultos, los compuestos pueden administrarse a través de técnicas pasivas de administración de fármacos, como la administración directa en el agua, o mediante métodos de administración oral de fármacos, como la nasograma2. Otros enfoques incluyen el recubrimiento de los alimentos para peces con los compuestos y su posterior alimentación3, y la administración directa de medicamentos insolubles en agua a una concentración predeterminada, incluidas las inyecciones retroorbitales o intraperitoneales 4,5. La administración intraperitoneal es preferible para estudios in vivo de modelos de enfermedad debido a sus claras ventajas farmacocinéticas6. Este método proporciona una alta concentración de fármaco y una vida media prolongada dentro de la cavidad peritoneal, ofreciendo una vía eficaz para la administración de fármacos 7,8. El enfoque se utiliza comúnmente en entornos de investigación para garantizar una absorción y distribución óptimas del fármaco 9. Si bien los métodos basados en inyecciones resultan eficientes para la administración única, las inyecciones prolongadas y repetidas a menudo provocan daños corporales e infecciones crónicas2.
En la actualidad, existen dos métodos de inyección de IP en peces zerba adultos 4,10. Sin embargo, ambos métodos tienen limitaciones a la hora de administrar compuestos tóxicos como la doxorrubicina, lo que provoca graves daños en la forma del cuerpo y la mortalidad de los peces. Los efectos secundarios pueden complicar significativamente la interpretación de los datos. A pesar de que estos desafíos pueden abordarse con una amplia capacitación10, existe una clara necesidad de un nuevo método de inyección de IP que minimice los efectos secundarios.
Aquí, nuestro objetivo es desarrollar un nuevo método de inyección de IP optimizado para la administración efectiva de doxorrubicina en peces cebra adultos, facilitando la generación de modelos confiables de miocardiopatía inducida por doxorrubicina (CID) con daño corporal minimizado y mortalidad asociada.
Protocolo
Todos los procedimientos realizados fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de Mayo Clinic, adhiriéndose a los estándares descritos en la "Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio" (National Academies Press, 2011). Todos los peces cebra del estudio pertenecen a la cepa Wild Indian Karyotype (WIK). Los detalles de los reactivos y el equipo utilizado para el estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.
1. Preparación y almacenamiento de la solución madre de doxorrubicina
- Obtenga el stock de doxorrubicina de una fuente comercial.
NOTA: La doxorrubicina es sensible a la luz, así que adquiérala en forma de polvo y guárdela en recipientes opacos para protegerla de la exposición a la luz. Realice todos los pasos para la preparación del polvo Dox dentro de una campana química. - Disuelva completamente el polvo de Dox en agua destilada y prepare una solución madre con una concentración final de 5 mg/mL.
- Alícuota el caldo dividiéndolo en tubos de 1,5 mL.
- Envuelva los tubos en papel de aluminio para protegerlos de la exposición a la luz.
- Almacene la solución alícuota Dox a 4 °C para el almacenamiento a corto plazo (<1 mes), o a -20 °C para el almacenamiento a largo plazo10.
2. Agrupar los peces según su peso corporal
- Agrupe los peces con una diferencia de peso corporal inferior al 10% para la inyección posterior.
NOTA: Para ahorrar esfuerzo en esta fase, los peces con una variación de peso corporal inferior al 10% se clasifican como del mismo tamaño. - Deje que los peces ayunen durante 24 horas antes de la inyección.
- Anestesiar a los peces con agua de embrión que contenga 0,16 mg/mL de tricaína durante 1 min.
- Saca el pez del agua con tricaína y frota ambos lados del cuerpo del pez con papel de filtro limpio para eliminar el exceso de agua.
- Mida y registre el peso corporal de cada pez, luego devuelva rápidamente el pez a un tanque de recuperación lleno de agua dulce del sistema.
NOTA: La inyección de dox se realizó en peces después de alcanzar los 3 meses de edad. En este estudio, los investigadores utilizaron peces de 3 a 10 meses de edad. Los BWs del pez cebra maduro de la cepa WIK pueden variar de 0,2 g a 0,5 g. La anestesia prolongada que duró más de 5 minutos, seguida de una inyección de Dox, provocó una alta mortalidad de peces.
3. Preparación de la aguja y estación de inyección
- Determine el volumen de inyección de solución madre de Dox (por ejemplo, 5 mg/mL) necesario para cada pez en función del peso corporal medio para alcanzar la dosis objetivo de 20 μg/g.
- Utilice la siguiente fórmula para calcular el volumen de inyección:
- Añadir 1x Solución salina equilibrada de Hank (HBSS) para diluir la solución de Dox calculada en el paso 1 para inyección, alcanzando un volumen total de 5 μL.
NOTA: Utilice una solución a granel para cada grupo de peces en función de su peso corporal e incluya 3 peces adicionales en cada grupo para asegurarse de que no haya escasez de solución para inyección durante el curso del experimento. - Golpee suavemente el tubo y luego microcentrifugue brevemente a máxima velocidad para recoger la solución a temperatura ambiente durante 10 s.
- Coloque la solución preparada sobre hielo y protéjala de la exposición a la luz.
- Coloque una placa de Petri limpia de 100 mm con una esponja debajo de un microscopio de disección, luego ajuste el enfoque.
NOTA: La esponja contiene una ranura de 4 cm de largo. La retracción elástica de la esponja proporcionará soporte al pez y mantendrá el cuerpo del pez en su posición. La esponja se puede reutilizar. - Equipe una microjeringa de 10 μL con una aguja biselada de 34 G.
- Enjuague la aguja con 1x tampón HBSS para eliminar las burbujas y eliminar las posibles obstrucciones de la jeringa.
- Mida 5 μL de la solución preparada en el paso 4 para la inyección.
4. Procedimiento de inyección de IP Dox
- Poner al pez adulto en agua con 0,16 mg/mL de tricaína durante 1 min para inducir un estado de inconsciencia.
- Coloque el pez en la ranura de la esponja incrustada con el abdomen hacia arriba (Figura 1A).
- Inserte la aguja con un ángulo cercano a 0°, comenzando desde el punto medio de la aleta pectoral hacia el lado posterior de la cavidad cardíaca (Figura 1B).
NOTA: Evite cualquier contacto con el corazón durante el procedimiento. - Dirige la aguja hacia la cola y pasa por debajo de la piel plateada.
NOTA: Coloque la aguja muy cerca de la piel plateada, teniendo cuidado de evitar cualquier rasguño o perforación. - Controle la punta de la aguja dentro de la cavidad abdominal durante toda la operación (Figura 1C).
NOTA: Evite dañar el hígado, los intestinos, la vejiga natatoria y otros órganos. Asegúrese de que la aguja llegue al final del intestino, cerca del agujero cloacal. - Dispense gradual y uniformemente la solución de 5 μL de Dox, luego retire lentamente la aguja a lo largo de la trayectoria original para evitar fugas (Figura 1D).
- Monitoree la cavidad abdominal para detectar la presencia de Dox observando una coloración roja de la solución de Dox (Figura 1E).
- Mueva rápidamente los peces inyectados a un tanque de cruce limpio lleno de agua dulce del sistema para ayudar a los peces a recuperarse.
NOTA: Entre inyecciones, enjuague la aguja una vez con 1x tampón HBSS.
5. Manejo de peces después de la inyección
- Regrese el pez al sistema con circulación después de la inyección.
- Ayunar todos los peces inyectados durante 24 h adicionales para facilitar su recuperación.
- Durante la primera semana, vigila de cerca a los peces. Retire los peces muertos lo antes posible para evitar infectar a los otros peces.
NOTA: Es probable que los peces mueran dentro de las primeras 24 horas debido a lesiones físicas causadas por la inyección o la anestesia prolongada. Registre el número de peces para generar una curva de supervivencia. - Realizar una ecocardiografía para fenotipar el pez inyectado con Dox a los 56 días después de la inyección11.
NOTA: Asegurar la uniformidad en las condiciones y procedimientos para el grupo de control correspondiente inyectado con solución de HBSS.
Resultados
Anteriormente, se han empleado dos métodos intraperitoneales (IP) para la administración de doxorrubicina en pez cebra adulto 4,10. En el método I, también conocido como método clásico de inyección IP descrito por Kinkel et al.4, la aguja se insertó en un ángulo de 45° con respecto a la línea media entre las aletas pélvicas con el abdomen hacia arriba. En el método II, o el método de inyección IP alternativo descrito por Ma et al.10, la aguja se insertó a través de la cara dorsal del pez (Figura 2A (i,ii)). Por el contrario, nuestro método III tiene dos cambios importantes. En primer lugar, se altera la posición de la inyección, con el abdomen hacia arriba y la aguja dirigida desde el punto medio de la aleta pectoral hacia el abdomen. El sitio de penetración está guiado por un agujero natural en esta área. En segundo lugar, se reduce el ángulo de la aguja, que debe estar cerca de 0° (Figura 2A (iii), Figura 1).
Comparación entre tres métodos de inyección intraperitoneal
Para comparar los tres métodos de inyección de IP, se presentan los datos obtenidos del Investigador I, quien no tenía experiencia previa con el pez cebra. Cuando se utilizaron los métodos I y II para la inyección de IP, se observó una mortalidad significativa de los peces en las dos primeras semanas después de la inyección de IP. En el método I, la muerte se observó tres días después de la inyección, mientras que en el método II, ocurrió después de dos días después de la inyección. El 70% de los peces inyectados mostraron daños corporales visibles, especialmente alrededor del lugar de la inyección, que se manifestaron como una reducción drástica del tamaño corporal y una forma corporal curvada uno o dos meses después de la inyección de IP (Figura 2A (iv, v)). Se razonó que la mortalidad y el daño observado podrían atribuirse a la toxicidad de la doxorrubicina12, que podría filtrarse por el extremo de apertura de la aguja de inyección durante el proceso de inyección, dañando el órgano interno a lo largo de la ruta de la inyección. En el método I, la punta de la aguja de inyección podía tocar el intestino (Figura 2A (i)), mientras que en el método II, podía tocar la vejiga natatoria (Figura 2A (ii)). Se postuló que se podía evitar que la punta de la aguja tocara cualquier órgano interno mediante el uso del método III (Figura 2A (iii)). De hecho, se observó una tasa de supervivencia significativamente mejorada, con un 80% de los peces que sobrevivieron 1 mes después de la inyección (Figura 2B). Esto significa una mejora notable en comparación con las tasas de supervivencia de los métodos I y II, que fueron del 53,33% y 33,33%, respectivamente. Es importante destacar que el 80% de los peces supervivientes exhibían una forma corporal normal, en contraste con los generados por los métodos I y II (Figura 2A (vi)). Para validar la generación exitosa del modelo de CID, se evaluó la función cardíaca midiendo el porcentaje de fracción de eyección (FE%). De hecho, se observó una reducción significativa en el FE% a los 56 días después de la inyección en el grupo que utilizó el método III (Figura 2C).
Reproducibilidad del método III por diferentes investigadores
Para demostrar que el método III puede ser fácilmente dominado por diferentes investigadores, se reclutó a 3 investigadores que nunca antes habían trabajado con pez cebra. En sus primeros intentos con el método III, todos los investigadores pudieron lograr tasas de supervivencia del 85,71%, 95% y 83,33% 56 días después de la inyección y una FE marcadamente disminuida (Figura 3A,B). Cabe destacar que tres investigadores repitieron su experimento 3 veces, 3 veces y 2 veces, respectivamente, y obtuvieron resultados exitosos de manera consistente. Estos datos confirmaron la repetibilidad del método III, lo que permitió a los investigadores sin experiencia previa en el trabajo con peces generar modelos DIC fiables.
En uno de los intentos iniciales utilizando el método III, el investigador II probó una desviación del método III: en lugar de 0°, se utilizó un ángulo de 45° mientras se penetraba la aguja a través de la piel (Figura 2A (iii), flecha discontinua). Solo el 15% de los peces sobrevivieron dos meses después de la inyección (Figura 3A), y el 80% de los peces sobrevivientes mostraron daños corporales considerables. Los datos indicaron que el ángulo de penetración es un paso crítico para el éxito del método III.
El método III permite establecer un modelo de CID crónica
Se postuló que una reducción significativa del daño corporal podría permitir múltiples inyecciones de IP en el mismo pez, imitando el modelo de DIC crónico en ratones13,14. Por lo tanto, se utilizó el método III para realizar una serie de inyecciones durante 4 semanas consecutivas, con 5 μg/g de Dox por semana (Figura 4A). En este experimento, el 100% de los peces inyectados sobrevivieron, y el 80% de ellos no mostraron signos de daño corporal. Es importante destacar que se observó una fracción de eyección significativamente reducida a 56 ppp, lo que indica la generación exitosa de un modelo de DIC crónico en pez cebra adulto (Figura 4B).
Figura 1: Ubicación y ángulo de inserción de la aguja para el nuevo método de inyección IP. (A) La ubicación de la inserción de la aguja. El pez está boca abajo, exponiendo el lado abdominal. La cabeza está a la derecha. Entre las aletas pectorales se encuentra un orificio natural que facilita la penetración de la piel. (B) El ángulo de inserción de la aguja. Está cerca de cero grados con respecto a la superficie del pez. (C) El rastro de la aguja debajo de la piel. La punta de la aguja se controla continuamente una vez dentro de la cavidad abdominal. El punto de entrada parece diferente de la Figura 1A debido a la distorsión de la piel durante el proceso de penetración. (D) Un pez después de que Dox es liberado. La cavidad abdominal se enrojece después de liberar el Dox. (E) Un pez después de la inyección de IP. No hay signos de fugas después de retirar la aguja. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Comparación de tres métodos de inyección de IP en pez cebra adulto. (A) Esquemas de tres métodos de inyección de IP. (I-III) Se muestran esquemas de la inyección IP clásica (método I), la inyección IP alternativa (método II) y el nuevo método (método III). Las flechas indican los sitios de penetración y el ángulo de la aguja para tres métodos de inyección. Flecha discontinua, un ángulo fallido de penetración de la aguja. Barra de escala: 5 mm. (iv-vi) Tamaño corporal reducido y forma de cuerpo curvada en los modelos DIC. Se muestran peces representativos de peces DIC a 56 ppp. (B) Comparación de las curvas de supervivencia entre tres métodos de inyección de IP. El número de peces supervivientes se registró semanalmente. (El experimento comenzó con un total de n = 15). (C) Evaluación de la función cardíaca de los peces a 56 dpi después del estrés Dox. n = 6 peces en el grupo de control 1x HBSS, y el experimento comenzó con un total de n = 15 peces en cada 3 lotes inyectados con Dox. Los valores se muestran como la media ± error estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: El Método III permite establecer el modelo de DIC del pez cebra de manera consistente en manos de 3 investigadores diferentes. (A) Curvas de supervivencia de peces DIC utilizando el Método III por tres investigadores diferentes. Se observó una alta tasa de supervivencia en los tres investigadores. El número de peces vivos se registra semanalmente. Se observó una baja tasa de supervivencia para el investigador II cuando se utilizó un método III que no tuvo éxito (ángulo de penetración de la aguja de 45°, como se muestra en una flecha discontinua en la Figura 2A). (B) Evaluación de la función cardíaca de peces DIC utilizando el Método III por tres investigadores diferentes. En total, el Investigador II, para un ángulo de penetración de la aguja de 45°, utilizó 3 lotes (9, 12, 14) de peces para la inyección de Dox. Para un ángulo de penetración de la aguja de 0° n = 6, se emplearon peces en el HBSS 1x como grupo de control compartido. El experimento comenzó con un total de n = 85 peces con RII (9, 12, 14), RIII (8, 6, 6) y RIV (12, 18) empleados en cada uno de los 8 lotes inyectados con Dox por tres investigadores (II, III, IV), respectivamente. Los valores se muestran como la media ± error estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: El Método III permite múltiples inyecciones de Dox en un pez cebra adulto, recapitulando modelos de DIC crónicos en roedores. (A) Esquemas del modelo de inyección múltiple. Se inyectaron 5 μg/g de Dox (5 μL) en cuatro semanas consecutivas. (B) El modelo de DIC crónico manifiesta un EF% reducido a 56 dpi. Los valores se muestran como la media ± error estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discusión
A diferencia de los dos métodos de inyección IP existentes 4,10, el nuevo método de inyección IP se caracteriza por las siguientes características distintivas. En primer lugar, se utiliza un ángulo de penetración de la aguja único (cercano a cero); en segundo lugar, la aguja penetra en el pez a través de un lugar único, es decir, un orificio natural en la superficie ventral de un pez, lo que facilitaría la inyección; y por último, el movimiento de la aguja es de anterior a posterior. Estos ajustes reducen eficazmente las lesiones orgánicas, que resultan de la minimización de la fuga de Dox durante el proceso de penetración. La trayectoria de la aguja está justo debajo de la piel plateada, que puede ser monitoreada continuamente por el investigador. En consecuencia, se puede evitar eficazmente el contacto directo entre la punta de la aguja y los órganos internos. Después de la inyección, todo el Dox inyectado permanece en la cavidad abdominal, y la única salida (punto de punción) puede cerrarse cuando el pez está despierto y comienza a nadar hacia adelante.
En comparación con los dos métodos de inyección de IP existentes 4,10, el nuevo método de inyección de IP resulta consistentemente en un daño corporal minimizado y mayores tasas de supervivencia. Esta afirmación fue subrayada aún más por la viabilidad de múltiples inyecciones en el mismo pez para generar un modelo de DIC crónica de pez cebra. Es importante destacar que, en comparación con losdos métodos de inyección de IP anteriores4,10, el nuevo método puede ser dominado rápidamente por investigadores que no tienen experiencia previa en el manejo de peces cebra adultos. Los modelos DIC confiables parecen obtenidos con éxito en su primer o segundo intento en manos de al menos 4 investigadores diferentes. El éxito de la inyección se puede concluir fácilmente dentro de la primera semana después de la inyección: >80%, preferiblemente 100%, los peces deberían poder sobrevivir después de la inyección. Todos los peces sobrevivirán hasta los 56 ppp, cuando la mayoría de los peces (>80%) deberían estar libres de daños corporales evidentes. Esta es una mejora significativa, porque un modelo DIC confiable que utiliza los dos primeros métodos de IP solo se puede estabilizar en la mano de un investigador después de más de 3 rondas de práctica con al menos 10 peces en cada ronda. Este proceso puede llevar mucho tiempo, ya que cada práctica requiere alrededor de 2 meses para concluir el éxito de su inyección. Reducir el trauma tisular no solo mejora el bienestar de los peces, sino que también minimiza los factores de confusión que podrían afectar los resultados del estudio.
Un paso crítico para garantizar el éxito del nuevo método es el ángulo de penetración. Como se muestra en la Figura 2, cuando el ángulo de penetración cambió de 0° a 45°, se observó una muerte significativa de peces, presumiblemente debido a un mayor riesgo de contacto entre la punta de la aguja y los órganos internos.
La principal limitación del método es que no se puede utilizar para administrar medicamentos a peces menores de 3 meses. Debido a su pequeño tamaño corporal, los peces jóvenes no pueden sobrevivir después del daño físico asociado con la penetración de una aguja. Sin embargo, el método puede utilizarse en peces adultos cuando su peso corporal es superior a 0,15 g, incluidos los de 3 meses a 4 años.
Este nuevo método sería ampliamente utilizado para la administración de fármacos en peces cebra adultos, especialmente cuando se trata de compuestos potencialmente tóxicos como Dox15,16. Cuando se trata de compuestos no tóxicos, los tres métodos deben ser aplicables.
Agradecimientos
Este estudio fue apoyado por los NIH (HL107304 y HL081753) y la Fundación Mayo (Centro para el Descubrimiento Biomédico y el Centro de Investigación Cardiovascular) para X.X. J.L. está financiado por los Fondos de Investigación Fundamental de las Universidades Centrales de la Universidad Central del Sur, No. 56021702. Un agradecimiento especial a Beninio Gore y Quentin Stevens por administrar las instalaciones de pez cebra.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 10 μ L NanoFil-jeringa | World Precision Instruments, Inc | Herramienta de inyección | NANOFIL |
| Aguja de 34 G | World Precision Instruments, Inc | NI34BV-2 herramienta de | inyección |
| 60 mm Placa de Petri | fisher scientific/fisherbrand | FB0875713A | colocar la esponja |
| Microscopio de disección | Nikon | SMZ800 | Inyección del medicamento Dox |
| Dox Doxorubicin clorhidrato Sigma | D1515-10MG | para crear el modelo DIC | |
| Ecocardiografía | VISUAL SONICS | Vevo 3100 | función cardíaca |
| Esponja de espuma | Jaece Industries | L800-D | colocación del pescado |
| Solución salina equilibrada de Hank (HBBS) | Thermo Fisher | 14025076 Vehículo para | |
| microcentrífuga Dox | southernlabware | MyFuge/C1012 | recoger la solución Dox |
| Báscula de equilibrio de precisión | Torbal | AD60 | Báscula digital |
| Tricaine | Argent | MS-222 | Anestesiante para peces |
| Tubo | Eppendorf | 1,5 mL | almacenamiento |
| vevo LAB software | FUJIFILM VISUAL SONICS | 5.6.0 | Cuantificación del corazón |
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