Se describe un nuevo método de inyección intraperitoneal (IP) en pez cebra adulto. Cuando se manipulan compuestos tóxicos como la doxorrubicina, este procedimiento es más eficaz que los dos métodos IP descritos anteriormente. La técnica está diseñada para ser fácilmente adoptada por investigadores con experiencia limitada en el modelo de pez cebra.
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Artículo de método
Una técnica de inyección intraperitoneal en peces cebra adultos que minimiza el daño corporal y la mortalidad asociada
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Resumen
Resumen
El pez cebra adulto (Danio rerio), que es genéticamente accesible, se está empleando como un valioso modelo de vertebrado para estudiar trastornos humanos como la miocardiopatía. La inyección intraperitoneal (IP) es un método importante que suministra compuestos al cuerpo para probar efectos terapéuticos o generar modelos de enfermedades como la miocardiopatía inducida por doxorrubicina (CID). Actualmente, existen dos métodos de inyección de IP. Ambos métodos tienen limitaciones cuando se manejan compuestos tóxicos como la doxorrubicina, que resultan en efectos secundarios que se manifiestan como daño severo a la forma del cuerpo y muerte de los peces. Si bien estas deficiencias podrían superarse mediante una amplia formación de los investigadores, es deseable un nuevo método de inyección de IP que tenga efectos secundarios mínimos. Aquí, se informa de un método de inyección IP único que es capaz de manejar compuestos tóxicos. Se puede producir una reducción constante de la función cardíaca sin que se produzca una muerte significativa de los peces. La técnica puede ser fácilmente dominada por investigadores que tienen una experiencia mínima con el pez cebra adulto.
Introducción
El pez cebra (Danio rerio) ha ganado atención como un modelo experimental para el estudio de enfermedades humanas porque este animal abarca una alta homología de genes y órganos con los humanos, fertilización externa, facilidad de manipulación genética y transparencia corporal en la madurez temprana, lo que facilita una gran cantidadde aplicaciones de imagen. A diferencia del proceso sencillo de administrar medicamentos directamente al agua para embriones y larvas de pez cebra, la administración de medicamentos a un pez cebra adulto presenta un esfuerzo más complejo y desafiante.
En los peces adultos, los compuestos pueden administrarse a través de técnicas pasivas de administración de fármacos, como la administración directa en el agua, o mediante métodos de administración oral de fármacos, como la nasograma2. Otros enfoques incluyen el recubrimiento de los alimentos para peces con los compuestos y su posterior alimentación3, y la administración directa de medicamentos insolubles en agua a una concentración predeterminada, incluidas las inyecciones retroorbitales o intraperitoneales 4,5. La administración intraperitoneal es preferible para estudios in vivo de modelos de enfermedad debido a sus claras ventajas farmacocinéticas6. Este método proporciona una alta concentración de fármaco y una vida media prolongada dentro de la cavidad peritoneal, ofreciendo una vía eficaz para la administración de fármacos 7,8. El enfoque se utiliza comúnmente en entornos de investigación para garantizar una absorción y distribución óptimas del fármaco 9. Si bien los métodos basados en inyecciones resultan eficientes para la administración única, las inyecciones prolongadas y repetidas a menudo provocan daños corporales e infecciones crónicas2.
En la actualidad, existen dos métodos de inyección de IP en peces zerba adultos 4,10. Sin embargo, ambos métodos tienen limitaciones a la hora de administrar compuestos tóxicos como la doxorrubicina, lo que provoca graves daños en la forma del cuerpo y la mortalidad de los peces. Los efectos secundarios pueden complicar significativamente la interpretación de los datos. A pesar de que estos desafíos pueden abordarse con una amplia capacitación10, existe una clara necesidad de un nuevo método de inyección de IP que minimice los efectos secundarios.
Aquí, nuestro objetivo es desarrollar un nuevo método de inyección de IP optimizado para la administración efectiva de doxorrubicina en peces cebra adultos, facilitando la generación de modelos confiables de miocardiopatía inducida por doxorrubicina (CID) con daño corporal minimizado y mortalidad asociada.
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Protocolo
Todos los procedimientos realizados fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de Mayo Clinic, adhiriéndose a los estándares descritos en la "Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio" (National Academies Press, 2011). Todos los peces cebra del estudio pertenecen a la cepa Wild Indian Karyotype (WIK). Los detalles de los reactivos y el equipo utilizado para el estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.
1. Preparación y almacenamiento de la solución madre de doxorrubicina
- Obtenga el stock de doxorrubicina de una fuente comercial.
NOTA: La doxorrubicina es sensible a la luz, así que adquiérala en forma de polvo y guárdela en recipientes opacos para protegerla de la exposición a la luz. Realice todos los pasos para la preparación del polvo Dox dentro de una campana química. - Disuelva completamente el polvo de Dox en agua destilada y prepare una solución madre con una concentración final de 5 mg/mL.
- Alícuota el caldo dividiéndolo en tubos de 1,5 mL.
- Envuelva los tubos en papel de aluminio para protegerlos de la exposición a la luz.
- Almacene la solución alícuota Dox a 4 °C para el almacenamiento a corto plazo (<1 mes), o a -20 °C para el almacenamiento a largo plazo10.
2. Agrupar los peces según su peso corporal
- Agrupe los peces con una diferencia de peso corporal inferior al 10% para la inyección posterior.
NOTA: Para ahorrar esfuerzo en esta fase, los peces con una variación de peso corporal inferior al 10% se clasifican como del mismo tamaño. - Deje que los peces ayunen durante 24 horas antes de la inyección.
- Anestesiar a los peces con agua de embrión que contenga 0,16 mg/mL de tricaína durante 1 min.
- Saca el pez del agua con tricaína y frota ambos lados del cuerpo del pez con papel de filtro limpio para eliminar el exceso de agua.
- Mida y registre el peso corporal de cada pez, luego devuelva rápidamente el pez a un tanque de recuperación lleno de agua dulce del sistema.
NOTA: La inyección de dox se realizó en peces después de alcanzar los 3 meses de edad. En este estudio, los investigadores utilizaron peces de 3 a 10 meses de edad. Los BWs del pez cebra maduro de la cepa WIK pueden variar de 0,2 g a 0,5 g. La anestesia prolongada que duró más de 5 minutos, seguida de una inyección de Dox, provocó una alta mortalidad de peces.
3. Preparación de la aguja y estación de inyección
- Determine el volumen de inyección de solución madre de Dox (por ejemplo, 5 mg/mL) necesario para cada pez en función del peso corporal medio para alcanzar la dosis objetivo de 20 μg/g.
- Utilice la siguiente fórmula para calcular el volumen de inyección:
- Añadir 1x Solución salina equilibrada de Hank (HBSS) para diluir la solución de Dox calculada en el paso 1 para inyección, alcanzando un volumen total de 5 μL.
NOTA: Utilice una solución a granel para cada grupo de peces en función de su peso corporal e incluya 3 peces adicionales en cada grupo para asegurarse de que no haya escasez de solución para inyección durante el curso del experimento. - Golpee suavemente el tubo y luego microcentrifugue brevemente a máxima velocidad para recoger la solución a temperatura ambiente durante 10 s.
- Coloque la solución preparada sobre hielo y protéjala de la exposición a la luz.
- Coloque una placa de Petri limpia de 100 mm con una esponja debajo de un microscopio de disección, luego ajuste el enfoque.
NOTA: La esponja contiene una ranura de 4 cm de largo. La retracción elástica de la esponja proporcionará soporte al pez y mantendrá el cuerpo del pez en su posición. La esponja se puede reutilizar. - Equipe una microjeringa de 10 μL con una aguja biselada de 34 G.
- Enjuague la aguja con 1x tampón HBSS para eliminar las burbujas y eliminar las posibles obstrucciones de la jeringa.
- Mida 5 μL de la solución preparada en el paso 4 para la inyección.
4. Procedimiento de inyección de IP Dox
- Poner al pez adulto en agua con 0,16 mg/mL de tricaína durante 1 min para inducir un estado de inconsciencia.
- Coloque el pez en la ranura de la esponja incrustada con el abdomen hacia arriba (Figura 1A).
- Inserte la aguja con un ángulo cercano a 0°, comenzando desde el punto medio de la aleta pectoral hacia el lado posterior de la cavidad cardíaca (Figura 1B).
NOTA: Evite cualquier contacto con el corazón durante el procedimiento. - Dirige la aguja hacia la cola y pasa por debajo de la piel plateada.
NOTA: Coloque la aguja muy cerca de la piel plateada, teniendo cuidado de evitar cualquier rasguño o perforación. - Controle la punta de la aguja dentro de la cavidad abdominal durante toda la operación (Figura 1C).
NOTA: Evite dañar el hígado, los intestinos, la vejiga natatoria y otros órganos. Asegúrese de que la aguja llegue al final del intestino, cerca del agujero cloacal. - Dispense gradual y uniformemente la solución de 5 μL de Dox, luego retire lentamente la aguja a lo largo de la trayectoria original para evitar fugas (Figura 1D).
- Monitoree la cavidad abdominal para detectar la presencia de Dox observando una coloración roja de la solución de Dox (Figura 1E).
- Mueva rápidamente los peces inyectados a un tanque de cruce limpio lleno de agua dulce del sistema para ayudar a los peces a recuperarse.
NOTA: Entre inyecciones, enjuague la aguja una vez con 1x tampón HBSS.
5. Manejo de peces después de la inyección
- Regrese el pez al sistema con circulación después de la inyección.
- Ayunar todos los peces inyectados durante 24 h adicionales para facilitar su recuperación.
- Durante la primera semana, vigila de cerca a los peces. Retire los peces muertos lo antes posible para evitar infectar a los otros peces.
NOTA: Es probable que los peces mueran dentro de las primeras 24 horas debido a lesiones físicas causadas por la inyección o la anestesia prolongada. Registre el número de peces para generar una curva de supervivencia. - Realizar una ecocardiografía para fenotipar el pez inyectado con Dox a los 56 días después de la inyección11.
NOTA: Asegurar la uniformidad en las condiciones y procedimientos para el grupo de control correspondiente inyectado con solución de HBSS.
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Resultados
Anteriormente, se han empleado dos métodos intraperitoneales (IP) para la administración de doxorrubicina en pez cebra adulto 4,10. En el método I, también conocido como método clásico de inyección IP descrito por Kinkel et al.4, la aguja se insertó en un ángulo de 45° con respecto a la línea media entre las aletas pélvicas con el abdomen hacia arriba. En el método II, o el método de inyección IP alternativo descrito por Ma et
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Discusión
A diferencia de los dos métodos de inyección IP existentes 4,10, el nuevo método de inyección IP se caracteriza por las siguientes características distintivas. En primer lugar, se utiliza un ángulo de penetración de la aguja único (cercano a cero); en segundo lugar, la aguja penetra en el pez a través de un lugar único, es decir, un orificio natural en la superficie ventral de un pez, lo que facilitaría la inyección; y por último, el movimiento de la agu...
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Agradecimientos
Este estudio fue apoyado por los NIH (HL107304 y HL081753) y la Fundación Mayo (Centro para el Descubrimiento Biomédico y el Centro de Investigación Cardiovascular) para X.X. J.L. está financiado por los Fondos de Investigación Fundamental de las Universidades Centrales de la Universidad Central del Sur, No. 56021702. Un agradecimiento especial a Beninio Gore y Quentin Stevens por administrar las instalaciones de pez cebra.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 10 μ L NanoFil-jeringa | World Precision Instruments, Inc | Herramienta de inyección | NANOFIL |
| Aguja de 34 G | World Precision Instruments, Inc | NI34BV-2 herramienta de | inyección |
| 60 mm Placa de Petri | fisher scientific/fisherbrand | FB0875713A | colocar la esponja |
| Microscopio de disección | Nikon | SMZ800 | Inyección del medicamento Dox |
| Dox Doxorubicin clorhidrato Sigma | D1515-10MG | para crear el modelo DIC | |
| Ecocardiografía | VISUAL SONICS | Vevo 3100 | función cardíaca |
| Esponja de espuma | Jaece Industries | L800-D | colocación del pescado |
| Solución salina equilibrada de Hank (HBBS) | Thermo Fisher | 14025076 Vehículo para | |
| microcentrífuga Dox | southernlabware | MyFuge/C1012 | recoger la solución Dox |
| Báscula de equilibrio de precisión | Torbal | AD60 | Báscula digital |
| Tricaine | Argent | MS-222 | Anestesiante para peces |
| Tubo | Eppendorf | 1,5 mL | almacenamiento |
| vevo LAB software | FUJIFILM VISUAL SONICS | 5.6.0 | Cuantificación del corazón |
Referencias
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