Describimos un protocolo general que integra el análisis de espectrometría de masas de alta resolución y el acoplamiento molecular en la investigación de la medicina tradicional china.
Artículo de método
Espectrometría de masas en tándem de alta resolución para el estudio de los constituyentes químicos de Gynura bicolor DC
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En este artículo
Resumen
Resumen
La separación y el análisis de los componentes químicos deseados son temas importantes para la investigación fundamental de la medicina tradicional china (MTC). La cromatografía líquida de ultra alta resolución, espectrometría de masas en tándem con tiempo de vuelo cuadrupolar (UPLC-Q-TOF-MS/MS) se ha convertido gradualmente en una tecnología líder para la identificación de ingredientes de la MTC. Gynura bicolor DC. (BFH), una hierba perenne sin tallo utilizada para la medicina y la comida en China, tiene efectos medicinales como eliminar el calor, humedecer el pulmón, aliviar la tos, dispersar la estasis y aliviar la hinchazón. Los polifenoles y flavonoides contienen numerosos isómeros, que dificultan la identificación de los compuestos complejos en BFH. Este artículo presenta un protocolo sistemático para el estudio de los constituyentes químicos de BFH basado en la extracción con solventes y datos integrados a través de UPLC-Q-TOF-MS.
El método descrito aquí incluye protocolos sistemáticos para el pretratamiento de muestras, la calibración de MS, la adquisición de MS, el procesamiento de datos y el análisis de resultados. El pretratamiento de muestras incluye la recolección, la limpieza, el secado, la trituración y la extracción. La calibración MS consiste en corrección multipunto y de un solo punto. El procesamiento de datos incluye la importación de datos, el establecimiento de métodos, el procesamiento de análisis y la presentación de resultados. En este artículo se presentan resultados representativos del patrón de fragmentación típico de ácidos fenólicos, ésteres y glucósidos en Gynura bicolor DC (BFH). Además, se analizan en detalle la selección de disolventes orgánicos, la extracción, la integración de datos, la selección de energía de colisión y la mejora del método. Este protocolo universal puede ser ampliamente utilizado para identificar compuestos complejos en la medicina tradicional china.
Introducción
La medicina tradicional china (MTC) se ha practicado clínicamente en China durante miles de años y desempeña un papel vital en el mantenimiento de la salud del pueblo chino. La composición de la MTC es diversa y compleja, y la MTC ha sido ampliamente reportada en muchos estudios cualitativos centrados en la composición química2. Los componentes químicos de la medicina tradicional china se pueden dividir aproximadamente en las siguientes categorías, como alcaloides, ácidos orgánicos, fenilpropanoides, cumarinas, lignanos, quinonas, flavonoides, terpenoides, saponinas triterpenoides, saponinas esteroides, glucósidos cardíacos y taninos3. Dado el gran número de componentes desconocidos e isómeros indistinguibles en la MTC, la separación y el análisis de los componentes químicos deseados son temas importantes para la investigación fundamental de la MTC4.
La cromatografía líquida de ultra alta resolución, espectrometría de masas de tiempo de vuelo cuadrupolar (UPLC-Q-TOF-MS) se ha aplicado para analizar sustancias en la medicina tradicional china (MTC), que pueden separarse mediante cromatografía líquida de ultra alta resolución 5,6. La alta resolución de MS puede proporcionar una amplia información de iones, que se utiliza para el análisis de bases de datos con un error inferior a 5 ppm7. Después de activar la energía de colisión, el modo MS secundario puede obtener iones de fragmento secundarios, cuya intensidad y número se ven afectados por la magnitud de la energía8.
Gynura bicolor DC. (BFH), una hierba perenne sin tallo ampliamente utilizada para medicina y alimentos (Figura 1A), es una planta rara y en peligro de extinción exclusiva de China9. BFH tiene abundantes antocianinas, polifenoles, flavonoides y una fuerte capacidad antioxidante10. BFH tiene efectos medicinales que incluyen eliminar el calor, enfriar la sangre, humedecer el pulmón, aliviar la tos, dispersar la estasis, aliviar la hinchazón, aliviar el calor del verano y eliminar el calor. Pocos estudios se han centrado en la composición química de BFH11. Los polifenoles y flavonoides contienen numerosos isómeros, lo que dificulta la identificación de los compuestos complejos en BFH. Se debe desarrollar un método universal para la identificación de componentes químicos, que pueda aplicarse a todo tipo de MTC. Este estudio tuvo como objetivo informar sobre un protocolo sistemático para el estudio de los constituyentes químicos de BFH basado en la extracción con solventes y datos integrados a través de UPLC-Q-TOF-MS.
Protocolo
1. Pretratamiento de la muestra
- Lave toda la hierba de BFH en agua pura hasta que no haya depósitos ni impurezas visibles. Coloque el BFH limpio en un plato y luego colóquelo en el horno (Figura 1B). Pon el horno a 50 °C durante 24 h.
NOTA: Toda la planta de BFH se recolectó en la provincia de Sichuan, China. - Triture BFH seco en una trituradora multifuncional de alta velocidad. Transfiera el polvo grueso a un colador de malla 50 (Figura 1C). Recoja el polvo fino en una bolsa hermética y guárdelo en una torre de secado.
- Pese con precisión seis muestras de BFH de 0,25 g cada una y colóquelas en seis matraces cónicos. Agregue 30 mL de solvente orgánico (50% de etanol-agua, 70% de etanol-agua, cloroformo, éter de petróleo, acetato de etilo y alcohol n-butílico) a cada botella cónica (Figura 1D).
- Transfiera la mezcla a un sonicador de baño de ultrasonidos durante 30 minutos de extracción a 25 °C. Centrifugar la muestra a 14.000 x g durante 5 min. Prepare una jeringa inyectable y un filtro de membrana microporosa orgánica de 0,22 μm. Filtre todos los sobrenadantes en frascos de muestra de 2 ml.
2. Calibración MS
- Utilizando una pipeta de 1.000 μL, transfiera 500 μL de solución de hidróxido de sodio de 0,1 M a un matraz aforado de 100 mL y, a continuación, transfiera 450 μL de agua desionizada o ultrapura al matraz aforado de 100 mL (Figura 2).
- Con una pipeta de 200 μL, añada 50 μL de ácido fórmico al matraz aforado de 100 mL. Prepare un volumen total de 100 ml con 2-propanol:agua 90:10 y sonique la solución durante 5 minutos. Etiquete el matraz como una solución de formiato de sodio de 0,5 mM en 2-propanol:agua 90:10 y guárdelo en el refrigerador.
NOTA: La solución de formiato de sodio caduca en 1 semana a temperatura ambiente. - Inicie el software de control UPLC-Q-TOF-MS y, a continuación, abra la ventana MS tune . En el panel Control de flujo de muestra , establezca 25 μL/min en la opción Caudal de infusión y seleccione C en la opción Depósito . Espere aproximadamente 1 minuto para que la purga automática llegue al final.
- Haga clic en el botón Flujo para comenzar a administrar la solución de formiato de sodio. Haga clic en el botón Positivo para cambiar al modo de iones positivos y haga clic en el botón Sensibilidad para cambiar al modo de sensibilidad.
NOTA: Continúe con el siguiente paso hasta que aparezcan los picos característicos de formiato de sodio en la ventana del espectro en tiempo real. - En el software de control UPLC-Q-TOF-MS, abra la ventana de MS Console . En la posición izquierda, seleccione las opciones SYNAPT XS e Intellistart en secuencia.
- Marque Crear calibración y haga clic en el botón Inicio . Haga clic en el botón Siguiente y seleccione Perfil de calibración en el menú desplegable. Haga clic en el botón Siguiente y seleccione el modo de sensibilidad en Polaridad positiva . Haga clic en los botones Siguiente, Ajustar página, Siguiente e Iniciar a su vez.
- Cambie a la ventana de sintonía de MS y haga clic en el botón Negativo para cambiar al modo de iones negativos. Vuelva a la ventana de MS Console .
- Marque Crear calibración y haga clic en el botón Inicio . Haga clic en el botón Siguiente y seleccione Perfil de calibración en el menú desplegable. Haga clic en el botón Siguiente y seleccione el modo de sensibilidad en Polaridad negativa . Haga clic en los botones Siguiente, Ajustar página, Siguiente e Iniciar a su vez.
- En el panel de control de flujo de LockSpray , establezca un caudal de 50 μL/min y haga clic en el botón Flujo para permitir que la solución LE ingrese al espectrómetro de masas. Cambie a la ventana de MS tune , marque la configuración de la fuente LockSpray y haga clic en el botón Inicio para comenzar la calibración.
3. Adquisición de MS
- Cambie a la interfaz principal y haga clic con el botón derecho en la columna Archivo de entrada para abrir el método de cromatografía líquida.
- Haga clic en el botón Entrada y luego establezca los parámetros, incluido el tiempo de ejecución y el degradado. Haga clic en el botón Autosampler y, a continuación, establezca los parámetros, incluidos el tiempo de ejecución, la columna y la muestra. Haga clic en el botón Guardar .
- Haga clic con el botón derecho en la columna Método MS para abrir el método de espectrometría de masas.
- Haga clic en el botón Información y luego configure los parámetros, incluida la hora de finalización, la polaridad, el modo del analizador, la masa baja, la masa alta y la energía de colisión de transferencia en rampa. Haga clic en el botón Aceptar y, a continuación, en el botón Guardar .
- Rellene la tabla de secuencia incluyendo el nombre del archivo, el vial y el volumen. Haga clic en el botón Guardar .
- Seleccione la fila de la tabla de secuencia del ejemplo que desea ejecutar. Haga clic en el botón Ejecutar y haga clic en el botón Aceptar en la ventana que acaba de aparecer.
4. Tratamiento de datos
- Inicie el software de análisis de datos. En la columna Mi trabajo , haga clic en el botón Importar datos de MassLynx para abrir una nueva ventana.
- Haga clic en el botón del signo más y verifique los cinco archivos sin procesar desde el modo positivo. Introduzca un nombre de grupo y haga clic en el botón Crear conjunto de muestras UNIFI para iniciar la importación de datos (Figura 3A).
- Haga doble clic en el archivo Método de análisis en el modo positivo. Haga clic en la etiqueta Procesamiento y haga clic en el botón Objetivo por masa . Introduzca el número de 5 ppm en el cuadro de entrada después de Tolerancia de coincidencia de objetivo y Tolerancia de coincidencia de fragmento.
- Haga clic en el botón Inicio y haga clic en el botón Aductos . Seleccione las filas de +H y +Na, y haga clic en el botón en forma de flecha derecha . Haga clic en el botón Guardar (Figura 3B).
- Haga doble clic en el archivo Método de análisis en el modo negativo. Haga clic en la etiqueta Procesamiento y haga clic en el botón Objetivo por masa . Introduzca el número de 5 ppm en el cuadro de entrada después de Tolerancia de coincidencia de destino y Tolerancia de coincidencia de fragmento.
- Haga clic en el botón Inicio y luego haga clic en el botón Aductos . Seleccione las filas de -H y +HCOO y haga clic en el botón en forma de flecha derecha . Haga clic en el botón Guardar .
- En la columna Mi trabajo, haga clic en el botón Análisis para abrir una nueva ventana. Elija los datos que se acaban de importar y el método que se acaba de crear y luego haga clic en el botón Siguiente. Introduzca el nombre del archivo. Seleccione la carpeta donde se almacenan los datos de análisis y luego haga clic en el botón Finalizar
- Haga clic en el botón Procesar y espere unos minutos hasta que aparezcan los resultados (Figura 3C).
- Copie la tabla de resultados en un formulario en blanco (Figura 3D).
5. Análisis de resultados
- Seleccione un compuesto en la tabla de resultados. El espectro de masas secundario correspondiente se mostrará en la esquina inferior derecha (Figura 4A).
- Haga clic en el botón con forma de tabla y seleccione la opción Fragmentos de alta energía para mostrar la tabla de iones de fragmentos secundarios (Figura 4B).
- Seleccione un fragmento secundario en la tabla. Mueva el ratón sobre el pico de iones correspondiente al espectro de masas secundario y la fractura estructural correspondiente se mostrará en la pantalla (Figura 4C).
NOTA: Evalúe manualmente la razonabilidad del agrietamiento proporcionado por el software y distinga los isómeros en función de los iones de fragmento secundarios. - Dibuje manualmente el patrón de fragmentación en el software de dibujo.
NOTA: Los ejemplos de patrones de fragmentación se describen en detalle en la sección de resultados representativos.
Resultados
La identificación de la composición química de BFH se utilizó como modelo para mostrar los resultados representativos. Cromatogramas de picos de base de Gynura bicolor DC extraído con disolvente. se muestran en el Archivo Suplementario 1-Figura Suplementaria S1-S6, y el tiempo de retención observado (RT), el nombre del componente, la fórmula, la relación masa-carga (m/z) y el error de masa se enumeran en las Tablas S1-S6. En el ZBTK, se identificaron los 35 tipos de compuestos a partir de picos separados en UPLC-TOF-MS. Como se muestra en el Archivo Suplementario 1-Tabla Suplementaria S1, los principales productos químicos contenían ácido (ácido quínico, ácido DL-málico, ácido cítrico, ácido o-cumárico y ácido 3-O-trans-cumaroilquínico), glucósidos (gentiopicrina, picrósido II, sufruticósido J, copolina y borneol-2-O-β-D-apiofuranosil-(1→6)-β-D-glucósido) y ésteres (bilobalida, trimetilcitrato y trans-O-glucosil-metil-trans-cinamato). En el ZBTK-CT, se detectaron 25 tipos de compuestos adicionales (Archivo Suplementario 1-Tabla Suplementaria S2), y se observaron 45 tipos de compuestos totales.
Cuando se utilizó cloroformo como extractante, se encontraron los 50 compuestos. Entre ellos, los 28 tipos de compuestos adicionales incluían ácido coronario, ácido sanleng, agrimol A y artemisato de metilo (Archivo Suplementario 1-Tabla Suplementaria S3). Cuando se utilizó éter de petróleo como extractante, se observaron 44 tipos de compuestos totales. Encontramos 17 tipos de compuestos adicionales, incluyendo notopterol, onjisaponina y cnideol B (Archivo Suplementario 1-Tabla Suplementaria S4). Se obtuvieron un total de 65 compuestos en disolvente utilizando acetato de etilo como extractante. En comparación con los cuatro extractivos anteriores, se observaron 37 compuestos adicionales, como dafnetina, acetovainillona B y estigmasterol-3-O-β-D-glucósido (Archivo Suplementario 1-Tabla Suplementaria S5). En el extracto de alcohol butílico, encontramos 67 tipos de compuestos totales, que contenían 26 tipos de compuestos adicionales, incluidos el rengiósido C, las cromonas, la aturamelina F y la deacetilmatricarina-8-O-β-D-glucopiranósido (Archivo suplementario 1-Tabla suplementaria S6). En resumen, encontramos 168 compuestos basados en todos los resultados de compuestos de seis extractantes.
Para comprender en profundidad la vía de escisión de los tipos de compuestos en UPLC-TOF-MS, seleccionamos tres compuestos como ejemplos. En el caso de los ácidos, el ácido 3-O-trans-cumaroilquínico con m/z = 337,09222 podría perder un grupo C7H10O5 o C9H8O2 a través de la reacción de hidrólisis para formar intermedios con m/z = 163,04116 o 199,05557, respectivamente (Figura 4D). En el caso de los ésteres, el trans-O-glucosil-metil-transcinamato con m/z = 385,11308 podría convertirse en intermedio con m/z = 153,07485 o 135,04679 a través de la escisión C-C en diferentes sitios (Figura 4E). Para los glucósidos, la citrusina C con m/z = 385.11308 se transformó en intermedia con m/z = 272.09174 a través de la escisión del enlace C-C en la cadena alifática, mientras que la pérdida del grupo C7H6O2 resultó en intermedio con m/z = 113.02534 (Figura 4F). En otra vía, la rotura del enlace C-O-C en el anillo de benceno condujo a la formación de un intermediario con m/z = 163.11245, mientras que la unidad de hexosa desapareció.
Los resultados representativos del acoplamiento molecular revelaron estructuras 2D y 3D en la Figura 4G,H, respectivamente. El análisis de enriquecimiento de ontología génica mostró los resultados de la función génica en términos de proceso biológico (BP), componente celular (CC) y función molecular (MF; Figura 4I). El análisis de anotaciones de la vía de la Enciclopedia de Genes y Genomas de Kioto mostró los resultados de la vía de los genes expresados diferencialmente, que podrían usarse para comprender mejor la función de los genes (Figura 4J). Los resultados detallados del acoplamiento molecular se muestran en el Archivo Suplementario 1-Tabla Suplementaria S7 y en el Archivo Suplementario 1-Figura Suplementaria S7-S9.
Figura 1: Método de pretratamiento de la medicina tradicional china. (A) Gynura bicolor DC. (B) Limpieza y secado. c) Pulverización. (D) Adición de solventes orgánicos. (E) Extracción por ultrasonido. (F) Centrifugación de la mezcla. (G) Filtración de sobrenadante. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Procedimiento de operación de UPLC-Q-TOF-MS/MS. (A) Preparación de formiato de sodio. (B) Calibración del eje de masa. (C) Sintonía MS. (D) Colocación de muestras. E) Adquisición de espectro de masas. (F) Visualización del espectro de masas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Procesamiento e integración de datos. (A) Conversión de datos. (B) Modificación del método. (C) Procesamiento de datos. D) Análisis estadístico de los resultados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Análisis profundo de los resultados. (A) Espectro de masas secundario. (B) Visualización de iones de fragmentos secundarios. (C) Visualización del sitio de la fractura. (D) patrón de fragmentación 1. E) Patrón de fragmentación 2. F) Patrón de fragmentación 3. (G) Demostración del objetivo de acción del ingrediente activo. (H) Estructura 3D del objetivo de acción del ingrediente activo. (I) Análisis de enriquecimiento de GO. (J) Análisis de anotación de la vía KEGG. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Archivo complementario 1: Identificación de compuestos, resultados de acoplamiento molecular, cromatogramas de pico base y análisis de redes. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Discusión
Además de la decocción en agua12, la extracción con solventes orgánicos es otro método común de pretratamiento de la MTC13. De acuerdo con el principio de disolución en fase similar, se han extraído numerosos componentes mediante la combinación de varios solventes orgánicos14. La extracción asistida por ultrasonidos es uno de los principales métodos utilizados para obtener componentes en TCM15. La extracción de dióxido de carbono supercrítico es buena para extraer ciertos tipos de sustancias como los lignanos16. Además, se investigó la extracción asistida por microondas en líquidos iónicos (IL) como alternativa a las extracciones convencionales con solventes orgánicos17. Sin embargo, el control preciso de la energía de microondas es difícil de lograr, lo que puede causar reacciones secundarias como la deshidratación por eterificación y la deshidratación por esterificación.
Los ajustes óptimos de la energía de colisión pueden proporcionar información adicional de fragmentos de MS de segundo orden. La información de la MS en tándem, es decir, el modoMS E , se proporcionó mediante dos exploraciones alternas paralelas que utilizaron baja energía para obtener información de iones moleculares o alta energía para obtener iones de fragmentos de masa precisos de barrido completo18. Durante el ajuste de los parámetros de alta energía, el rango de 10-35 V se usa generalmente en la energía de colisión de transferencia de rampa para mejorar la eficiencia de fragmentación del precursor19.
La gran cantidad de datos brutos de la EM se generó a partir de la EM de alta resolución. Los datos brutos de la EM, que incluían picos de iones moleculares en el espectro de la EM y picos de iones de fragmentos en el espectro de la EM/EM, deben procesarse e integrarse a fondo. Software de análisis de datos MS destinado a analizar todos los metabolitos de una muestra biológica de forma exhaustiva20. El cribado de metabolitos sulfatados se basó en la adquisición dependiente de los datos de exploraciones completas de EM y datos de metabolitos multidimensionales21. Sobre la base de la evolución de la tecnología, la predicción de la inteligencia artificial será una dirección de desarrollo factible para el análisis de datos de EM.
La mayoría de los compuestos se pueden identificar por este método. Sin embargo, los fragmentos secundarios limitados no pueden identificar completamente todos los isómeros, incluidos los flavonoides y los taninos. Para lograr la identificación de estructuras, los investigadores pueden emplear la espectrometría de masas en tándem para proporcionar más información sobre los iones fragmentados, lo que ayuda en la identificaciónde estructuras compuestas. Dada la limitación del ion de ionización por electrospray o la fuente de ionización química a presión atmosférica, la MS de alta resolución no es adecuada para el análisis de macromoléculas. La ionización por desorción láser asistida por matriz puede promover la ionización de grandes compuestos moleculares, como las proteínas22. En resumen, UPLC-Q-TOF-MS/MS es una de las técnicas más ampliamente aplicables para la identificación de compuestos de MTC. Tiene el potencial de aplicarse a otros campos, como la medicina clínica y la química energética.
Divulgaciones
Los autores declaran no tener intereses financieros contrapuestos.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (82104881), Equipo de Herencia e Innovación del Tratamiento de Enfermedades Inmunológicas de la MTC, Proyecto de Investigación Científica Médica de Chongqing (Proyecto conjunto de la Comisión de Salud de Chongqing y la Oficina de Ciencia y Tecnología) (2022DBXM007), Un proyecto especial para incentivo y orientación del rendimiento del Instituto de Investigación Científica de Chongqing (cstc2022jxjl120005), Un proyecto especial para la Fundación de Ciencias Postdoctorales de Chongqing (2022CQBSHTB3035), Programa de Talentos Médicos Superiores de Chongqing para Yong y de mediana edad, el Programa para Instituciones Científicas de Chongqing (proyecto de investigación independiente No.2022GDRC015).
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| cloroformo | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | CAS 67-66-3 | |
| etanol | ChuandongChemical | CAS 64-17-5 | |
| acetato de etilo | ChuandongChemical | CAS 141-78-6 | |
| cromatógrafo de líquidos | Waters | ACQUITY Class 1 plus | |
| MassLynx | Waters | V4.2 | MS software |
| de controlalcohol n-butílico | ChuandongChemical | CAS 71-36-3 | |
| éter de petróleo | ChuandongChemical | CAS 8032-32-4 | |
| Espectrometría de masas de tiempo de vuelo cuadrupolar | Waters | SYNAPT XS | |
| UNIFI | Waters | Software de análisis de datos |
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