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Paradigmas para la evaluación conductual en el modelo de Drosophila del trastorno del espectro autista

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DOI:

10.3791/66649

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6 de septiembre de 2024

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1Department of Bioscience and Biotechnology, Indian Institute of Technology Kharagpur

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

El Trastorno del Espectro Autista (TEA) se asocia con un deterioro del comportamiento social y comunicativo y la aparición de comportamientos repetitivos. Para estudiar la interrelación entre los genes del TEA y los déficits conductuales en el modelo de Drosophila , en este artículo se describen cinco paradigmas conductuales para analizar el espaciamiento social, la agresión, el cortejo, el acicalamiento y el comportamiento de habituación.

Resumen

El Trastorno del Espectro Autista (TEA) abarca un grupo heterogéneo de trastornos del neurodesarrollo con síntomas conductuales comunes que incluyen déficits en la interacción social y la capacidad de comunicación, comportamientos restringidos o repetitivos mejorados y también, en algunos casos, discapacidad de aprendizaje y déficit motor. Drosophila ha servido como un organismo modelo sin precedentes para modelar un gran número de enfermedades humanas. Dado que muchos genes han sido implicados en el TEA, las moscas de la fruta han surgido como una forma poderosa y eficiente de probar los genes supuestamente involucrados con el trastorno. Dado que cientos de genes, con diversas funciones funcionales, están implicados en el TEA, no es factible un único modelo genético de mosca del TEA; en cambio, los mutantes genéticos individuales, las eliminaciones de genes o los estudios basados en la sobreexpresión de los homólogos de moscas de los genes asociados al TEA son los medios comunes para obtener información sobre las vías moleculares subyacentes a estos productos genéticos. Una gran cantidad de técnicas conductuales están disponibles en Drosophila que proporcionan una lectura fácil de los déficits en componentes conductuales específicos. Se ha demostrado que el ensayo del espacio social y los ensayos de agresión y cortejo en moscas son útiles para evaluar defectos en la interacción social o la comunicación. El comportamiento de acicalamiento de las moscas es una excelente lectura del comportamiento repetitivo. El ensayo de habituación se utiliza en moscas para estimar la capacidad de aprendizaje de la habituación, que se ha visto afectada en algunos pacientes con TEA. Se puede utilizar una combinación de estos paradigmas de comportamiento para hacer una evaluación exhaustiva del estado de la enfermedad humana similar al TEA en las moscas. Utilizando moscas mutantes Fmr1 , recapitulando el síndrome de X frágil en humanos, y el derribo de filas homólogas de POGZ en neuronas de mosca, hemos demostrado déficits cuantificables en el espaciamiento social, la agresión, el comportamiento de cortejo, el comportamiento de acicalamiento y la habituación. Estos paradigmas conductuales se demuestran aquí en sus formas más simples y directas, con la suposición de que facilitarían su uso generalizado para la investigación sobre el TEA y otros trastornos del neurodesarrollo en modelos de mosca.

Introducción

El Trastorno del Espectro Autista (TEA) engloba un grupo heterogéneo de trastornos neurológicos. Incluye una serie de trastornos complejos del neurodesarrollo caracterizados por déficits multicontextuales y persistentes en la comunicación social y la interacción social y la presencia de patrones de comportamiento y actividad restringidos y repetitivos y de intereses1. Según la Organización Mundial de la Salud (OMS), 1 de cada 100 niños es diagnosticado con TEA en todo el mundo, con una proporción de 4,2 2 entre hombres ymujeres. La enfermedad se hace evidente en el segundo o tercer año de vida. Los niños con TEA muestran una falta de interés en la reciprocidad socioemocional, la comunicación no verbal y las habilidades de relación. Exhiben comportamientos repetitivos como movimientos motores estereotipados, seguimiento de rutinas inflexibles y ritualizadas, y un enfoque intenso en intereses restringidos. Los niños con TEA muestran un alto grado de respuesta al tacto, el olfato, el sonido y el gusto, mientras que la respuesta al dolor y a la temperatura es comparativamente baja1. La penetrancia de este trastorno también es diferente entre los diferentes pacientes que padecen TEA y, por lo tanto, la variabilidad aumenta.

El diagnóstico clínico actual del TEA se basa en la evaluación conductual de los individuos, ya que no existe una prueba genética común o basada en biomarcadores confirmatorios que abarque todas las formas de TEA3. Descifrar las bases genéticas y neurofisiológicas sería útil para orientar las estrategias de tratamiento. En la última década, una gran cantidad de investigaciones han dado como resultado la identificación de cientos de genes que se eliminan o mutan o cuyos niveles de expresión están alterados en pacientes con TEA. La investigación en curso hace hincapié en la validación de la contribución de estos genes candidatos utilizando organismos modelo como el ratón o la mosca de la fruta, en los que estos genes se eliminan o derriban, seguidos de pruebas para detectar déficits de comportamiento similares a los TEA y la elucidación de las vías genéticas y moleculares subyacentes que causan las anomalías. Un modelo de ratón que recapitula las variaciones del número de copias (CNV) en los loci cromosómicos humanos 16p11.2 muestra algunos de los defectos de comportamiento del TEA 4,5,6. La exposición prenatal a un fármaco teratogénico, el ácido valproico (VPA), es otro modelo de ratón que presenta rasgos que se asemejan al TEA humano 7,8. Además, existe una variedad de modelos de ratón que exhiben autismo asociado al síndrome genético, por ejemplo, modelos sindrómicos de un solo gen causados por mutaciones en Fmr1, Pten, Mecp2, Cacna1c, y modelos no sindrómicos de un solo gen causados por mutaciones en genes como los genes Cntnap2, Shank, Neurexin o Neuroligin 5.

La mosca de la fruta (Drosophila melanogaster) es otro organismo modelo prominente para estudiar las bases celulares, moleculares y genéticas de una gran cantidad de trastornos humanos9, incluido el TEA. Drosophila y los humanos comparten procesos biológicos altamente conservados a nivel molecular, celular y sináptico. Las moscas de la fruta se han utilizado con éxito en estudios de TEA 10,11,12 para caracterizar genes relacionados con TEA y descifrar su papel exacto en la sinaptogénesis, la función sináptica y la plasticidad, el ensamblaje de circuitos neuronales y la maduración; Se encontró que los homólogos de mosca de genes asociados a TEA tienen roles en la regulación del comportamiento social y/o repetitivo 11,13,14,15,16,17,18,19,20,21. La mosca de la fruta también ha funcionado como modelo para el cribado de genes de TEA y sus variantes 15,22,23. El mayor desafío en la investigación de los TEA en moscas es que, a diferencia de otros modelos de enfermedades, no existe un único modelo de mosca con TEA. Para comprender el impacto de las mutaciones o la eliminación de un gen específico del TEA, un investigador necesita validar si los fenotipos conductuales imitan suficientemente los síntomas de los pacientes con TEA y, a continuación, proceder a la comprensión de los fundamentos moleculares o fisiológicos de los fenotipos.

Por lo tanto, la detección de fenotipos similares al TEA es vital para la investigación del TEA en el modelo de mosca. A lo largo de los años han surgido un puñado de técnicas conductuales que nos permiten detectar anomalías como déficits en el comportamiento/interacción social, la comunicación, los comportamientos repetitivos y la capacidad de respuesta a los estímulos. Además, se han realizado varias modificaciones y actualizaciones de estas técnicas conductuales en diferentes laboratorios para adaptarse a requisitos específicos, como la ampliación, la automatización de ensayos, las lecturas, la cuantificación y los métodos de comparación. En este artículo de video, se muestran las versiones más básicas de cinco paradigmas conductuales, que, en combinación, se pueden usar para detectar resultados conductuales similares a los TEA de la manera más fácil.

La agresión es un comportamiento innato conservado evolutivamente que afecta a la supervivencia y la reproducción24. El comportamiento agresivo hacia los congéneres está influenciado por la "motivación para la socialización"25,26 así como por la "comunicación"27, ambas comprometidas en los individuos afectados por el TEA. El comportamiento agresivo está bien descrito en Drosophila y su cuantificabilidad a través del robusto ensayo de agresión 28,29,30 y una base genética y neurobiológica bien conocida 31 lo convierte en un paradigma conductual adecuado32 para evaluar el fenotipo de TEA en un modelo de mosca. La agresión se ve afectada por el aislamiento social fuera de un entorno social, lo que conduce a una mayor agresión; Lo mismo se ha observado cuando las moscas macho se alojan en aislamiento durante unos días 33,34. Otro ensayo conductual que cuantifica la sociabilidad en moscas es el Ensayo del Espacio Social35, que mide las distancias entre los vecinos más cercanos y las distancias entre moscas en un pequeño grupo de moscas, lo que lo hace perfectamente adecuado para probar las funciones de los ortólogos del gen ASD en la mosca 12,21,36,37, así como en los modelos de moscas ASD inducidos ambientalmente 38, Artículo 39.

El ensayo de cortejo de Drosophila es otro paradigma conductual utilizado con frecuencia para evaluar la alteración de las habilidades sociales y de comunicación tras la manipulación genética o de circuitos, incluidos los genes relacionados con el autismo 18,19,21,40. Los patrones repetitivos de comportamiento son prevalentes en los pacientes con TEA, que se recapitula en las moscas mediante el comportamiento de acicalamiento, una serie de acciones distintas y estereotipadas que se realizan para la limpieza y otros fines. Se ha utilizado con éxito para evaluar el impacto de las mutaciones del gen TEA en moscas21,41, así como la exposición a productos químicos38,39. Se han descrito múltiples avances y automatización en el ensayo antes de 16,41,42,43; Aquí, estamos demostrando el patrón de ensayo más básico, que es fácil de adoptar y cuantificar.

Se sabe que el TEA afecta la capacidad de habituación, aprendizaje y memoria en algunos pacientes 44,45,46,47,48,49,50, organismos modelo de TEA 51,52 y también causa déficits en diferentes comportamientos olfativos50. La habituación al salto con luz apagada de Drosophila se ha utilizado anteriormente para detectar los genes del TEA23. La habituación puede ser ensayada por un método simple de habituación olfativa 53,54,55. Describimos el método para inducir la habituación olfativa y analizamos el resultado utilizando un ensayo clásico de elección de olor binario basado en Y-maze56 que se puede utilizar para detectar defectos en la habituación en la condición de mutante del gen TEA o de derribo de genes. Para evaluar si el impacto de una mutación (o eliminación de genes) o de un tratamiento farmacológico en el comportamiento de una mosca equivale a un fenotipo similar al TEA, se puede utilizar una combinación de estos 5 ensayos descritos aquí.

Protocolo

Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles relacionados con todos los materiales y reactivos utilizados en este protocolo.

1. Ensayo de agresión

  1. Preparación de la arena de ensayo de agresión
    1. Tome una placa estándar de 24 pocillos (Figura 1A) y use cada pocillo de la placa como una sola "arena" (Figura 1B) para la agresión de las moscas. Llene la mitad de cada pocillo con comida regular para moscas y deje que se seque durante la noche.
      NOTA: Opcionalmente, se puede incluir un punto focal para la agresión en la arena, como un punto de pasta de levadura o una hembra decapitada para asegurar la agresión masculina.
    2. Tome cualquier lámina transparente de plástico / acrílico, suficiente para cubrir la superficie de unos tres o cuatro pocillos. Perfore la lámina para hacer una pequeña abertura de ~ 2,5 mm de diámetro para insertar moscas individuales en los pozos a través de ella.
  2. Preparación del aspirador de moscas
    1. Tome un tubo de goma/silicona de 30-50 cm de largo (Figura 1C1).
    2. Tome una punta de pipeta de 200 μL (o 1.000 μL) y corte ~1 cm de la punta estrecha. Inserte el extremo cortado en un extremo del tubo de goma; Esta punta será el "extremo de la boca", que se utiliza para la aspiración bucal.
    3. Tome otra punta de pipeta y corte el extremo estrecho de esta punta para hacer una abertura suficiente para que una mosca entre a través de ella. Inserte la base de esta punta de pipeta en el extremo de la cola del tubo; este será el "extremo de la mosca" del aspirador, desde donde se aspirará la mosca (Figura 1C2).
    4. Inserte un trozo de tela de malla o una capa delgada de algodón en el "extremo moscard" del tubo, en la unión entre el tubo y la punta. Asegúrese de que una mosca aspirada en la punta de la pipeta quede atrapada en la punta, delante de la malla.
    5. Selle las uniones entre el tubo y las puntas de pipeta con parafilm.
  3. Preparación de tubos de alojamiento único y viales de alojamiento grupal
    1. Preparación de tubos de un solo alojamiento
      1. Agregue casi 500 μL de alimento para moscas recién preparado a un tubo de microfuga de 2 mL (Figura 1D). Use una mini centrífuga para bajar la comida hasta la parte inferior del tubo.
      2. Configure la comida para que se solidifique a temperatura ambiente manteniendo la tapa abierta durante la noche. Cubra los tubos con un trozo de tela fina para evitar que las moscas callejeras entren en los tubos.
      3. Perfore las tapas de los tubos de microfuga con agujas para que circule el aire y cierre las tapas después de que los alimentos se solidifiquen.
    2. Preparación de viales de alojamiento grupal
      1. Tome viales regulares para moscas y llene un mínimo de los viales con alimentos recién preparados (Figura 1D).
  4. Preparación de las moscas antes del experimento
    1. Mantener las líneas de mosca de los genotipos deseados en botellas normales de vidrio/plástico que contengan alimento estándar para moscas en una incubadora a 25 °C en un ciclo de luz/oscuridad de 12 h.
    2. Recoja moscas recién cerradas (0 a 24 h) del genotipo deseado y sepárelas por sexo bajo anestesia con dióxido de carbono utilizando un microscopio estereoscópico.
    3. Inserte la mitad de las moscas macho individualmente en 'tubos de alojamiento único'. Mantenga la otra mitad de las moscas macho en un grupo de 10 con las moscas hembras en "viales de alojamiento grupal" regulares para crear una condición social. Almacene todos los tubos y viales a 25 °C durante 5 días.
      NOTA: Mantenga una temperatura de 24-25 °C y ~50% de humedad en la sala de comportamiento. Las cepas de moscas utilizadas fueron: w1118 y moscas mutantes transheterocigotas FMR (Fmr1Δ50M/Fmr1Δ113M)57. Las moscas Fmr1 , que se mantuvieron aisladas durante 5 días, muestran episodios de agresión significativamente disminuidos hacia otro macho (Figura 1E).
  5. Realización del experimento de comportamiento agresivo
    1. Realice el experimento de agresión durante la ventana de tiempo ZT0-ZT3, ya que las moscas muestran un pico de actividad durante este momento del día.
      NOTA: ZT=Tiempo Zeitgeber en un ciclo estándar de luz/oscuridad de 12 h; ZT0 = luces encendidas, es decir, el inicio de la fase de luz, ZT3 = 3 h después del inicio de la fase de luz, y así sucesivamente. ZT12= luces apagadas.
    2. Transfiera dos moscas macho de las cámaras de alojamiento simple o grupal por el método de aspiración bucal a la arena de agresión a través del orificio de la tapa; Aleja el agujero inmediatamente para asegurarte de que las moscas no puedan escapar.
    3. Deje que las moscas se aclimaten dentro de la arena durante 1-2 minutos. Inicie un temporizador durante 20 minutos. Graba en vídeo las moscas durante los 20 minutos colocando una cámara o un teléfono móvil exactamente verticalmente sobre la arena utilizando un soporte. Asegúrese de que los tipos de combates agresivos sean visibles en el video.
      NOTA: Asegúrese de que la arena esté iluminada con claridad y evite que el resplandor o el reflejo de la tapa caiga directamente sobre la lente de la cámara.
    4. Repita el experimento para 15-20 pares de moscas para cada genotipo y cada tipo de condición de alojamiento.
      NOTA: El sesgo inconsciente puede ser anulado por doble ciego de las moscas de control y de prueba, así como de los archivos de video que pertenecen a múltiples genotipos.
  6. Análisis de los datos del ensayo de agresión
    1. Transfiera los archivos de video a una computadora con una pantalla lo suficientemente grande para que los combates agresivos sean visibles.
    2. Reproduzca el video y cuente el número total de combates agresivos en un lapso de tiempo de 20 minutos58,59.
    3. Compile y organice datos de cada genotipo y cada patrón de alojamiento en una hoja de cálculo y realice análisis de datos utilizando cualquier software estadístico. Realice una prueba t de dos colas y trace los datos como caja y bigotes.

2. Ensayo del espacio social

NOTA: El protocolo de ensayo, el ámbito y el análisis aquí descritos han sido descritos anteriormente60,61.

  1. Preparación del escenario del ensayo de espacio social (SSA)
    1. Coloque los dos espaciadores acrílicos triangulares (altura = 8,9 cm, base = 6,7 cm y grosor = 0,3 cm) planos sobre un panel de vidrio rectangular (13,5 cm x 10,4 cm, grosor 0,3 cm) de modo que los ángulos rectos de los espaciadores acrílicos estén alineados con las esquinas del panel de vidrio (Figura 2A).
    2. Coloque dos espaciadores acrílicos rectangulares (6,7 cm x 1,5 cm, grosor = 0,3 cm) planos sobre el panel de vidrio, alineados con las bases de los dos espaciadores triangulares. Después de esta disposición, confirme que los cuatro espaciadores acrílicos rodean una arena triangular (~ 2,16 cm cuadrados61) en el panel de vidrio rectangular que no está cubierto por espaciadores (Figura 2A, B). Coloque una pegatina de una regla (Figura 2C) en uno de los espaciadores triangulares y asegúrese de que sea visible desde la parte superior.
    3. Ahora coloque un segundo panel de vidrio rectangular (13,5 cm x 10,4 cm, grosor de 0,3 cm) encima de los espaciadores acrílicos de modo que se alinee con el panel de vidrio en la parte inferior; Los espaciadores acrílicos terminarían intercalados entre el espacio de vidrio, dejando un espacio triangular en el medio entre dos paneles de vidrio. Utilice cuatro clips de carpeta pequeños para sujetar los cristales y los espaciadores.
  2. Preparación de las moscas para el SSA
    1. Recoja moscas recién cerradas (0 a 24 h) del genotipo deseado y sepárelas por sexo bajo anestesia fría utilizando un microscopio estereoscópico.
      NOTA: Enfríe el aparato de anestesia fría (se puede utilizar una placa de Petri) en una incubadora a -20 °C. Coloque las moscas en viales vacíos, sumerja estos viales en hielo (en un balde de hielo) hasta que las moscas se vuelvan inmóviles, colóquelas en la placa de Petri fría y comience a clasificar.
    2. Almacene las moscas macho y hembra por separado durante 24 h en viales de comida en una incubadora a 25 °C con un ciclo de luz/oscuridad de 12 h.
      NOTA: Para los experimentos demostrados aquí, las cepas de mosca utilizadas fueron w1118 y moscas mutantes transheterocigotas FMR (Fmr1Δ50M/Fmr1Δ113M).
  3. Realización del experimento SSA
    1. Mantener las mismas condiciones experimentales que el ensayo de agresión (temperatura: 24-25°C, humedad ~ 50%) y realizar el experimento durante la ventana de tiempo ZT0-ZT3.
    2. Retire el clip de carpeta inferior derecho y desplace ligeramente ese espaciador rectangular hacia afuera para que se cree un espacio (~ 0,5 cm) entre los dos espaciadores rectangulares.
    3. Transfiera las moscas (recolectadas el día anterior) del frasco de alimento a un vial vacío. Transfiéralos a la arena del espacio social (el área triangular) mediante una suave aspiración a través del espacio creado entre los espaciadores rectangulares. Cierre inmediatamente el espacio deslizando el espaciador rectangular y el clip de carpeta hacia atrás en sus posiciones y asegúrese de que no quede espacio para que escapen las moscas.
    4. Al sostener la cámara en posición vertical, golpee suavemente la cámara 3 veces sobre una almohadilla blanda para asegurarse de que todas las moscas estén en la base de la cámara al inicio del experimento.
    5. Sujete la cámara SSA en posición vertical y ponga en marcha el temporizador. Tome una foto clara de la arena después de 20 minutos cuando las moscas se asienten en sus posiciones en la arena y muestren un movimiento mínimo. Evite el deslumbramiento y la iluminación irregular.
    6. Repita el experimento 3 veces para la misma población de moscas golpeando las moscas y repitiendo los pasos de los pasos 2.3.5 a 2.3.7 (réplicas internas). Repita 3 veces con una población diferente de moscas del mismo genotipo/condición (repeticiones independientes).
      NOTA: Congele la cámara de ensayo para descartar las moscas de la cámara. Limpie las superficies de vidrio y plástico con etanol para eliminar todos los olores después de realizar una ronda de experimento con un grupo de moscas.
  4. Análisis de los datos del ensayo del espacio social
    1. Analice las imágenes en el software ImageJ62 y enumere las distancias entre moscas del vecino más cercano como se describió anteriormente61.
    2. Realizar análisis estadísticos y trazar gráficos utilizando software estadístico.
      NOTA: Las cepas de moscas utilizadas para el ensayo SSA descrito aquí fueron w1118 y moscas mutantes transheterocigotas Fmr1 (Fmr1Δ50M/Fmr1Δ113M)57. Las moscas Fmr1 muestran una distancia significativamente mayor de los vecinos más cercanos (Figura 2D).

3. Ensayo de cortejo

  1. La cámara de cortejo
    1. Ensamble las cuatro piezas de la cámara de cortejo (Figura 3A) juntas en el orden que se muestra en la Figura 3B. Cada perforación del disco central, intercalada entre la tapa y las piezas de la base, funcionará como la "cámara de cortejo" (Figura 3C).
  2. Obtención de hembras preapareadas
    1. Inicie y mantenga múltiples botellas de cultivo de moscas CS (Cantón S, tipo salvaje) con ~ 60-100 moscas macho y hembra en cada botella de alimento.
    2. Cuando emerjan los adultos, deseche todas las moscas adultas y transfiera las moscas que emergen de estos frascos cada 2-3 horas a nuevos viales de alimento suplementados con una pequeña cantidad de pasta de levadura.
      NOTA: Evite el hacinamiento de los viales. Tenga cuidado de no transferir moscas, larvas o pupas viejas al vial de apareamiento.
    3. Incube estos "viales de apareamiento" durante 4 días para asegurarse de que todas las hembras se hayan apareado.
  3. Preparación de tubos de alojamiento único para machos
    1. Agregue casi 500 μL de alimento para moscas a cada tubo de microfuga de 2 mL. Use una máquina minicentrífuga para bajar la comida hasta la parte inferior del tubo.
    2. Permita la solidificación de los alimentos durante la noche, corte la tapa del tubo de microfuga, cúbralo con parafilm y perfore el parafilm con una aguja para que circule el aire.
  4. Recolección y aislamiento de machos vírgenes
    1. Establezca cruces con 10-15 machos y 20-30 hembras vírgenes de los genotipos deseados en viales de alimento separados.
    2. Recoja machos vírgenes de los genotipos deseados de la progenie y manténgalos individualmente en "tubos de alojamiento único" utilizando el aspirador. Siga recolectando machos recién encerrados cada 5-6 h (hasta 40-50 machos para cada genotipo) y aíslelos en tubos individuales de un solo alojamiento.
    3. Vuelva a sellar la tapa del tubo con el parafilm.
  5. Realización del experimento del ensayo de cortejo
    1. Después de 5 días de aislamiento de los machos de prueba, realice el ensayo de cortejo durante la ventana de tiempo ZT0-ZT3.
    2. Configure los dispositivos de grabación de vídeo con mucha antelación, centrándose en el espacio de trabajo del ensayo.
    3. Con la ayuda de un aspirador, recoja una hembra preapareada (de 6 a 10 días de edad) de los viales de apareamiento e insértela en una cámara de cortejo.
    4. Usando el aspirador, transfiera suavemente una mosca macho (control/prueba) desde el tubo de alojamiento único a la cámara de cortejo que contiene la hembra preapareada única a través del orificio de transferencia. Gire la tapa rápidamente para cerrar la cámara.
    5. Graba en video el comportamiento de las moscas durante 15 min.
  6. Análisis de datos de vídeo y estadísticas
    1. Transfiera los archivos de video a una computadora; Fíjate en la duración del tiempo que pasa el macho en el cortejo durante 15 minutos revisando manualmente el vídeo.
    2. Calcule el índice de cortejo (IC) para cada mosca macho, que es la fracción (o porcentaje) de tiempo que el macho dedica a cortejar a la hembra durante 15 min.
    3. Cuente el número total de intentos de cópula en 15 min.
    4. Obsérvese la duración del desfase de tiempo mostrado por el macho antes de su primer intento de cortejo como latencia de cortejo (CL).
      NOTA: Se recomienda analizar de 40 a 60 machos por condición/genotipo para lograr poder estadístico y determinar la consistencia de los resultados del IC.

4. Ensayo de comportamiento de aseo

  1. Arena de ensayo de comportamiento de aseo
    1. Utilice una pequeña cámara circular con un volumen de ~0,4cm3 como arena para registrar el comportamiento de acicalamiento.
      NOTA: La misma arena de cortejo descrita en la sección 3 se puede utilizar para el ensayo de comportamiento de acicalamiento.
    2. Dado que el comportamiento de aseo implica la grabación del movimiento de los órganos más finos, como las piernas, utilice una grabación de vídeo de alta resolución o de alto contraste. Para seguir este protocolo, utilice un panel LED cubierto de vidrio difuso como superficie iluminada uniformemente de dimensiones 20 cm x 20 cm. Coloque la cámara de cortejo en la parte superior del panel para asegurarse de que la luz pase desde la parte inferior a través de la cámara.
  2. Preparación de las moscas antes del experimento
    1. Mantener el genotipo experimental de moscas en botellas de alimentos a 25 °C con un ciclo de luz/oscuridad de 12 h.
    2. Recoja moscas recién cerradas (0 a 24 h) del genotipo deseado y sepárelas por sexo bajo anestesia fría utilizando un microscopio estereoscópico como se describe en el ensayo de espacio social.
    3. Aislar las moscas macho en tubos de alojamiento único (como los utilizados en el ensayo de agresión) durante 24 h.
      NOTA: Para el experimento demostrado aquí, las cepas de mosca utilizadas fueron: W1118 y moscas mutantes transheterocigotas FMR (Fmr1Δ50M/Fmr1Δ113M).
  3. Realización del ensayo de comportamiento de aseo
    1. Mantenga una temperatura de 24-25 °C y una humedad ~ 50%; realizar el experimento durante la ventana de tiempo ZT0-ZT316.
    2. Transfiera una mosca macho de un solo alojamiento desde un tubo de un solo alojamiento al campo de aseo mediante el uso de un aspirador. Deslice inmediatamente el orificio de la tapa para asegurarse de que las moscas no puedan escapar.
    3. Coloque la arena de aseo en un panel LED difuso y deje que la mosca se aclimate dentro de la arena durante 1 minuto. Graba en vídeo la mosca durante 10 minutos colocando la cámara exactamente verticalmente sobre la arena montada en un soporte. Asegúrese de que los tipos de sesiones de aseo sean visibles y cuantificables en el video.
      NOTA: El comportamiento de acicalamiento incluye frotarse la cabeza, los ojos, las antenas, la probóscide, el tórax, el abdomen, los genitales y las alas con patas (primer par: T1, segundo par: T2 o tercer par de patas: T3). Los parámetros conductuales de acicalamiento que se han tenido en cuenta en este estudio son los descritos en Andrew et al. 41 y los demostrados en la Figura 4.
    4. Repite el experimento para cada genotipo.
    5. Análisis de los datos de comportamiento de grooming
      1. Analice los videos y calcule los siguientes cuatro parámetros: Índice de aseo (porcentaje de tiempo dedicado al acicalamiento); latencia de acicalamiento (tiempo hasta la primera sesión de acicalamiento); número de aseo personal; y la duración media del aseo (duración total del combate/número de combates).
      2. Marque un solo ataque de aseo como terminado cuando una mosca deje de mostrar cualquiera de los parámetros y permanezca inmóvil durante 2 segundos o detenga el combate y camine al menos 4 pasos.

5. Ensayo para la habituación olfativa

NOTA: Como se muestra en la Figura 5, el ensamblaje final debe realizarse el día del ensayo Y-maze54,56.

  1. Preparación de las moscas para la habituación
    1. Criar moscas de los genotipos deseados para todos los experimentos en una incubadora con una temperatura ambiente de 25 oC y 70% de humedad bajo luz estándar de 12 h: ciclo de oscuridad (LD) de 12 h h.
    2. Recoja moscas de 0 a 12 h de edad recién cerradas y transfiera ~ 30-40 moscas en una botella mediana fresca con un tapón de algodón apretado.
    3. Asigne códigos a cada botella para mantener al experimentador ciego sobre los genotipos bajo experimentación.
  2. Inducción de la habituación olfativa
    1. Coloque 1 mL del odorante preferido diluido con líquido de parafina (light) en un tubo de microfuga de 1.5 mL. Para el control, basta con utilizar 1 mL de luz líquida de parafina en un tubo de microfuga de 1,5 mL. Agite el contenido en el tubo durante 10 minutos para asegurar una mezcla uniforme y luego cúbralo con una envoltura de plástico perforada uniformemente.
      NOTA: En el video, se utilizará un 20% de butirato de etilo.
    2. Use alambre para suspender los tubos que contienen el odorante diluido o solo el líquido diluyente en botellas de medios separadas que contienen moscas.
    3. Cubra bien las botellas con algodón y luego envuélvalas con papel kraft para evitar la difusión del vapor odorante. Etiquete las botellas de control y que contienen olores como ingenuas y expuestas a olores (habituadas), respectivamente. Mantenga estos biberones de inducción durante 3 días en una incubadora con las condiciones mencionadas anteriormente.
  3. Preparación de moscas y el aparato de laberinto en Y
    1. Transfiera las moscas de las botellas de inducción a viales que contengan solo papel de filtro empapado en agua.
    2. Déjalos morir de hambre durante aproximadamente 16-18 horas a temperatura ambiente antes del experimento para aumentar la motivación.
    3. Asegúrese de que los componentes del aparato Y-maze estén limpios y libres de olores; Ensamble las cuatro partes de forma vertical. Conecte las cámaras de escalada al laberinto en Y, que luego se conecta a la parte superior del adaptador. Fije firmemente la parte inferior del laberinto en Y al vial de entrada que sirve como tallo central en la parte inferior, como se muestra en la Figura 5.
    4. Conecte el extremo cónico de cada cámara de escalada con los frascos de reactivos que contienen odorante (dilución 10-3 con agua destilada) utilizando tubos de silicona inodoros.
    5. Bombee el odorante a un caudal igual (~120 mL/min) desde las botellas de gas hasta los dos brazos de la Y con la ayuda de una bomba de vacío y deje que se sature durante 15 minutos para obtener consistencia.
  4. Realización del clásico ensayo de laberinto en Y
    1. Introduzca suavemente las moscas hambrientas de cada vial en el vial de entrada de la configuración Y-maze.
    2. Permíteles aclimatarse durante un breve período; conecte el vial de entrada con el adaptador Y-maze para comenzar la prueba; y deja que las moscas trepen por los brazos del laberinto en Y y queden atrapadas en las dos cámaras de recolección. Establezca la duración de cada prueba en 1 min.
    3. Al finalizar, golpee las moscas hasta el fondo del vial de entrada y cambie la posición de los brazos del laberinto en Y para evitar el sesgo lateral. Tome cuatro lecturas para el mismo conjunto de moscas.
    4. Registre el número de moscas que trepan por cada uno de los dos brazos del laberinto en Y dentro de la duración del tiempo.
    5. Repita el ensayo durante al menos 8 lotes para obtener un conjunto de datos representativo.
  5. Análisis e interpretación de los datos recopilados
    1. Cuantifique los resultados calculando el Índice de Rendimiento (IP), que se puede representar como la diferencia entre el número de moscas que eligen el brazo de aire (A) y el número de moscas que eligen el brazo de olor (O) como una fracción del número total de moscas participantes.
    2. Utilice pruebas estadísticas (prueba t de Student no apareada) para verificar si el IP de las moscas ingenuas frente a las expuestas al olor es significativo.

Resultados

Ensayo de agresión
Como modelo de mosca ASD se han utilizado moscas mutantes Fmr1 63,64. w1118 machos se utilizaron como control y Fmr1 transheterocigoto Fmr1Δ113M/Fmr1Δ50M57 moscas macho como moscas experimentales; Los machos adultos fueron alojados en tubos de aislamiento durante 5 días. Se introdujeron machos homotípicos (mismo genotipo, mismas condiciones de alojamiento) en la arena de agresión y se registró su comportamiento durante 20 min. Se contó el número total de episodios agresivos en 20 min para cada genotipo. Se encontró que el número de episodios agresivos durante 20 min fue significativamente menor en el caso de los machos mutantes que en los machos control (Figura 1E). Esta reducción de la agresividad en las moscas Fmr1 podría deberse a un menor interés en la interacción social con otra mosca. Por el contrario, las moscas macho mutantes Fmr1 alojadas en grupos/socialmente muestran recuentos de episodios de agresión comparables a los de las moscas w1118 alojadas socialmente (datos no mostrados), lo que probablemente indica un papel positivo del entorno social en la inducción del comportamiento social.

Ensayo de espacio social
El ensayo de espacio social se realizó en moscas w1118 y modelo ASD (Fmr1Δ113M/Fmr1Δ50M ). Se calculó la distancia al vecino más cercano para cada mosca y se realizaron 10 réplicas biológicas para cada genotipo. Las moscas mutantes muestran distancias significativamente más altas entre los vecinos más cercanos que las contrapartes de control (Figura 2D), lo que indica una preferencia por un mayor distanciamiento de otras moscas.

Ensayo de cortejo
Se realizó el ensayo de cortejo de moscas macho de un solo hogar para cuantificar el comportamiento de cortejo innato de dos moscas modelo de TEA separadas. En primer lugar, se comparó el comportamiento de cortejo de las moscas transheterocigóticas Fmr1 con el de w1118; Las moscas Fmr1 mostraron un índice de cortejo significativamente más bajo, así como un menor número de intentos de cópula (Figura 3E1). En un segundo experimento, un ortólogo de Drosophila del gen POGZ humano (un gen de riesgo de TEA20 altamente prevalente), fue derribado mediante la expresión de un microARN de horquilla corta contra fila en neuronas del cuerpo de hongo utilizando la línea controladora MB247-GAL4. Estas moscas modelo de TEA fueron probadas para detectar cualquier defecto en el patrón de cortejo innato; El índice de cortejo y el número de intentos de cópula se calcularon a partir de videos de 15 minutos. Las moscas de derribo mostraron un índice de cortejo significativamente reducido, así como recuentos de intentos de cópula (Figura 3E2), lo que indica su comunicación defectuosa hacia las hembras.

Comportamiento de acicalamiento
El comportamiento de acicalamiento se utiliza como lectura del comportamiento repetitivo en Drosophila 16,42,43. El comportamiento de acicalamiento se cuantificó en moscas transheterocigotas Fmr1 y se comparó con el de w1118. La latencia hasta el primer acicalamiento disminuye significativamente en las moscas Fmr1, mientras que la duración media del acicalamiento y el índice de acicalamiento aumentan significativamente en las moscas Fmr1 (Figura 4C), lo que indica un mejor comportamiento de acicalamiento (o repetitivo) en las moscas modelo TEA. Por el contrario, no se encontró que el número total de episodios de acicalamiento en las moscas mutantes se alterara significativamente en comparación con el de las moscas de control.

Ensayo de habituación olfativa
Se ha encontrado que la habituación es defectuosa en un gran número de individuos autistas y se puede utilizar como un ensayo para lo mismo en Drosophila23. Aquí, la habituación olfativa se probó en el modelo ASD mediante el derribo de la fila en interneuronas locales olfativas impulsadas por LN1-GAL4. Un odorante aversivo, butirato de etilo al 20%, se ha utilizado en estos experimentos para inducir la habituación en estas moscas. Los resultados muestran que las moscas de derribo no se habituaron después de una exposición de 3 días al odorante (las dos últimas barras del gráfico de la Figura 5E no muestran una diferencia significativa entre las moscas ingenuas y las habituadas) en comparación con las moscas de tipo salvaje, moscas que muestran una habituación típica después de la exposición al butirato de etilo durante 3 días (las moscas expuestas muestran una caída significativa en el índice de rendimiento en comparación con las moscas ingenuas). Esto indica que las moscas no se habitúan después de la exposición al butirato de etilo durante 3 días y son repelidas por el olor repulsivo, lo que demuestra que estas moscas ASD tienen una deficiencia de habituación.

figure-results-1
Figura 1: Arena de agresión y patrones de comportamiento representativos. (A) La configuración de la arena de agresión en una placa de 24 pocillos con una tapa perforada para la entrada de moscas. Recuadro: Dimensiones de una sola arena con comida para moscas. (B) Fotografía de un tubo de alojamiento único que contiene una sola mosca macho aislada y un frasco de alojamiento grupal que contiene moscas macho y hembra, recapitulando un entorno social. (C) Un aspirador para la transferencia de moscas basada en la aspiración bucal. Elementos necesarios para el montaje de un aspirador de moscas que indica los lados del tubo para la entrada de moscas (extremo de mosca) y el lado que se insertaría en la boca (extremo de la boca) (C1) y un aspirador de moscas ensamblado (C2). (D) Patrones representativos de comportamiento agresivo entre hombres: acercamiento, amenaza de alas, esgrima, agarre, embestidas, boxeo y peleas. (E) Las moscas macho mutantes Fmr1 muestran un comportamiento agresivo reducido hacia otros machos en comparación con los controles. Diagrama de caja que muestra el número de episodios agresivos para machos socialmente aislados de w1118 (control) frente a moscas transheterocigóticas Fmr1 (Fmr1Δ113M/Fmr1Δ50M). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-2
Figura 2: Configuración de la arena de ensayo del espacio social. (A) Diagrama que muestra las dimensiones y la disposición de los paneles de vidrio y los espaciadores acrílicos. (B) La disposición final de los componentes de la arena donde los espaciadores acrílicos se intercalan entre las piezas de vidrio, dejando un pequeño espacio para la entrada de moscas en la parte inferior. El espacio triangular creado entre las piezas de vidrio y los espaciadores es la arena SSA para las moscas, aquí las moscas solo pueden moverse en dos dimensiones. (C) Fotografía de la configuración final de la arena de la SSA con moscas dentro de la cámara. Abreviatura: SSA = matriz de espacio social. (D) Las moscas modelo ASD (Fmr1 transheterocigóticas) muestran un mayor distanciamiento entre sí en el ensayo de espacio social en comparación con w1118. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-3
Figura 3: Ámbito de cortejo y patrones de comportamiento representativos. Diagramas que muestran (A) el diseño y (B) la disposición de los discos en una arena de ensayo de cortejo. (C) Foto de la arena de cortejo después del arreglo final. (D) Imágenes representativas que muestran los patrones de comportamiento de cortejo de un macho ingenuo hacia una hembra apareada: persecución, orientación, parpadeo de las alas, lamido, intento de cópula y cópula. (E) Gráficos que muestran el índice de cortejo y el número de intentos de cópula en dos modelos de TEA: (E1) Moscas mutantes Fmr1 que muestran una reducción significativa en el índice de cortejo y el intento de cópula en comparación con el control w1118 . (E2) se utilizaron moscas knockdown row como otro modelo de TEA donde se expresó row-shRNA enneuronas cuerpo y de hongo (MB247-GAL4); Se observó una reducción significativa en el comportamiento de cortejo al derribar la fila. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-4
Figura 4: Configuración de la arena y patrones de comportamiento representativos del comportamiento de acicalamiento. (A) La arena en forma de disco o rueda (la misma arena de cortejo que se muestra en la Figura 3) se configura en un panel LED con un difusor para una iluminación uniforme desde la parte inferior y el video se capturó desde la parte superior. Esto asegura un mayor contraste requerido para identificar el movimiento fino de los apéndices durante el cepillado. (B) Fotografías de los patrones de comportamiento de acicalamiento observados en moscas macho adultas. T1 =1er par de patas, T2 = 2par de patas, T3 = tercer par de patas. Se utiliza una nomenclatura abreviada intuitiva para los patrones de aseo en B: T1-cabeza = cabeza frotada con las primeras patas; T1-T1 = primer par de patas frotadas entre sí, y así sucesivamente. Abreviatura: LED = diodo emisor de luz. (C) Gráficos que muestran los resultados de los ensayos de acicalamiento realizados en moscas transheterocigóticas Fmr1 y comparados con w1118. Las moscas mutantes Fmr1 mostraron una latencia significativamente reducida para el primer episodio de acicalamiento, lo que indica el inicio temprano del acicalamiento en comparación con el control. Además, la duración media del episodio de acicalamiento y el índice de acicalamiento aumentaron significativamente en los mutantes Fmr1 , lo que indica un mayor comportamiento repetitivo en las moscas modelo de TEA. Por el contrario, el número total de episodios de acicalamiento no se alteró significativamente en las moscas mutantes en comparación con el control. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 5: Inducción y configuración del ensayo para la habituación olfativa y resultado representativo después del ensayo. (A) Componentes de la configuración del ensayo de elección de olor binario: (A1) el laberinto en Y, (A2) el adaptador, (A3) la disposición de estos dos, (A4) un par de tubos de recolección para sujetar en la parte superior de los brazos del laberinto en Y, (A5) la botella de vidrio y los tubos de vidrio para mantener la solución odorante o el agua a través de la cual el aire burbujeará antes de pasar al laberinto en Y. (B) Configuración de la botella de comida para moscas para la inducción de la habituación olfativa; el diagrama de dibujos animados (B1) muestra cómo el tubo de microfuga que contiene odorante se cuelga de un alambre de cobre a mitad de camino dentro de la botella; (B2) finalmente, la abertura de la botella está cubierta por algodón y sellada por sobres de papel marrón. (C) Foto de la disposición total de la configuración del laberinto en Y. (D) Fotografías que muestren la distribución de moscas en las cámaras de recolección después del final de un experimento. (D1) Las moscas ingenuas (expuestas solo a parafina inodora, control) muestran repulsión hacia el odorante aversivo (20% de butirato de etilo utilizado para la inducción de la habituación en este estudio) y eligen en el brazo del laberinto en Y lleno de aire regular, mientras que las moscas expuestas (D2) (habituadas) se distribuyen uniformemente en ambos brazos. Abreviatura: ID = diámetro interno. (E) Los resultados del ensayo de habituación olfativa de las moscas mostraron un defecto de habituación. Las moscas de tipo silvestre (Cantón S), después de 3 días de exposición al butirato de etilo, mostraron una reducción significativa en el índice de rendimiento en comparación con las moscas naif, lo que indica habituación. Cuando las progenies de las moscas LN1-GAL4 x row-shRNA se expusieron durante 3 días, no se encontró que el índice de rendimiento fuera significativamente diferente al de las moscas naif; esto demuestra que estas moscas no se habituaron después de una exposición de 3 días al odorante, recapitulando un síntoma similar al TEA humano. Abreviaturas: TEA = trastorno del espectro autista; shRNA = ARN de horquilla corta. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Drosophila se utiliza como un buen organismo modelo para la investigación de trastornos neurológicos humanos debido a un alto grado de conservación de las secuencias génicas entre los genes de la mosca y los genes de las enfermedades humanas9. Numerosos paradigmas conductuales robustos lo convierten en un modelo atractivo para el estudio de los fenotipos que se manifiestan en mutantes que recapitulan enfermedades humanas. Dado que cientos de genes están implicados en el trastorno del espectro autista (TEA), no existe un modelo común de TEA en ningún organismo modelo. Por lo tanto, para cada mutante, los investigadores primero deben establecer fenotipos similares a los TEA en la mosca. En este artículo, hemos tratado de simplificar el proceso proponiendo el uso de cinco paradigmas de comportamiento de mosca en conjunto para dicha evaluación. Estos paradigmas se emplean en moscas para evaluar los principales déficits conductuales que ocurren comúnmente en los pacientes humanos con TEA: déficits sociales y de comunicación, mejora de los comportamientos repetitivos y un defecto de habituación. Si una mutación genética de mosca muestra defectos en todos o en la mayoría de estos cinco paradigmas, podría ser una fuerte indicación de un escenario similar al TEA.

La mayoría de los paradigmas conductuales descritos aquí se han utilizado varias veces en la literatura previa para resolver diversas preguntas de investigación. No es raro encontrar variaciones en las técnicas entre los diferentes estudios. Los ajustes en las técnicas se realizaron para que coincidan con la necesidad de la investigación y para adaptarse a la demanda de la pregunta específica que se está resolviendo. Por ejemplo, en el ensayo de cortejo, el comportamiento de cortejo innato y aprendido se puede cuantificar hacia una mosca de prueba, que puede ser un macho inmaduro65, una hembra virgen66,67, una hembra preapareada 68,69,70, una hembra virgen congelada65, o incluso una hembra decapitada19. En el método descrito en este artículo, se han utilizado hembras preapareadas de tipo salvaje como probador para comprobar el patrón de cortejo de una mosca modelo de TEA macho. Lareceptividad exual de una hembra preapareada es relativamente menor que la de una mosca virgen71. Como resultado, el número de episodios de cortejo de los machos y su duración son más hacia una hembra apareada que hacia una virgen; Del mismo modo, la latencia hasta la cópula también es más larga que la de las hembras vírgenes probadoras, en cuyo caso la cópula temprana conduce a un índice de cortejo reducido, lo que reduce el alcance de una comparación efectiva entre genotipos. Por lo tanto, el uso de hembras preapareadas como probador proporciona un mejor análisis comparativo del comportamiento de cortejo de una mosca TEA frente a una mosca de tipo salvaje. Por otro lado, el uso de hembras vírgenes puede proporcionar información adicional que puede quedar enmascarada cuando se utilizan hembras apareadas. El uso de hembras apareadas también puede influir y alterar el comportamiento de cortejo de los machos. En resumen, se sugiere que los investigadores elijan su estrategia experimental y detalle en función de la necesidad del experimento específico.

Hay que tener cuidado antes de aplicar la técnica en cualquiera o en todos los homólogos de mosca de los genes del TEA. Todos estos paradigmas conductuales están regulados por un número específico y reducido de neuronas. La expresión de un determinado gen debe establecerse primero antes de pasar a un paradigma de comportamiento específico. Por ejemplo, si el homólogo de la mosca de un gen asociado al TEA no se expresa en las neuronas del cuerpo del hongo o en las neuronas glutamatérgicas, entonces el comportamiento de cortejo y acicalamiento puede no verse afectado en su mutante.

Otro punto con el que los investigadores deben tener cuidado es que la falta de un defecto no siempre significa que la mutación no tenga ningún papel. Por ejemplo, en los experimentos de comportamiento de acicalamiento con mutantes Fmr1 , el recuento total de episodios de acicalamiento no es significativamente menor en los mutantes que en los controles, mientras que otros parámetros como el índice de acicalamiento, etc. demuestran un defecto en el comportamiento de acicalamiento. Esto puede explicarse por la prolongación de cada episodio de acicalamiento en los mutantes Fmr1 , lo que resulta en un recuento bajo del número total de combates a pesar de que la duración total del combate es mucho mayor. Esto enfatiza la necesidad de cuantificar múltiples parámetros para cada patrón de comportamiento. Además, hay que recordar que el término TEA abarca una amplia gama de enfermedades causadas por variaciones en cualquiera de los cientos de genes, lo que da lugar a fenotipos heterogéneos con diversos grados de penetrancia entre los individuos afectados. Por ejemplo, se observa un déficit de habituación en algunos pacientes, pero no en todos. Lo mismo se esperaría en los modelos de mosca de la enfermedad.

Para el análisis de la conducta agresiva se tuvieron en cuenta en este estudio diferentes tipos de parámetros agresivos: embestida, amenaza de alas, forcejeos, etc. (Figura 1)30. Cada pelea debe identificarse y contarse como un tipo de pelea individual o como un recuento total de peleas. Es importante familiarizarse primero con los patrones de agresión de las moscas macho, que se describen en59,72 y se muestran en la Figura 1. Al contar los números de combates agresivos, los puntos de inicio y final de un solo evento de agresión deben identificarse claramente; Se pueden mostrar múltiples tipos de patrones de agresión dentro de un solo combate, seguidos del final del combate. Un ataque de agresión se considera terminado cuando una mosca deja de mostrar cualquiera de los comportamientos o movimientos agresivos durante 2 segundos o detiene el ataque y comienza a alejarse.

La mayoría de estos paradigmas conductuales tienen múltiples variaciones y avances descritos por múltiples laboratorios. Cada una de las modificaciones específicas se ha creado para satisfacer las necesidades de un propósito específico. Del mismo modo, las técnicas de cuantificación o análisis automatizadas y basadas en algoritmos han liberado a estas técnicas de las posibilidades de errores manuales. En este trabajo se han demostrado las técnicas más básicas con la menor cantidad de requerimientos materiales, con la esperanza de que estas técnicas puedan ser fácilmente adoptadas y utilizadas por el máximo número de investigadores.

Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Agradecimientos

Estamos inmensamente agradecidos a Mani Ramaswami (NCBS, Bangalore) y Baskar Bakthavachalu (IIT Mandi) por la configuración del ensayo de habituación y elección de olor, a Pavan Agrawal (MAHE) por sus valiosas sugerencias sobre el ensayo de agresión, a Amitava Majumdar (NCCS, Pune) por compartir su prototipo de cámara de ensayo de cortejo y las líneas de mosca mutantes Fmr1 , y a Gaurav Das (NCCS, Pune) por compartir la línea MB247-GAL4. Agradecemos al Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC, Indiana, EE. UU.), al Instituto Nacional de Genética (NIG, Kyoto, Japón), a la Universidad Hindú de Banaras (BHU, Varanasi, India) y al Centro Nacional de Ciencias Biológicas (NCBS, Bangalore, India) por las líneas de Drosophila . El trabajo en el laboratorio contó con el apoyo de subvenciones de SERB-DST (ECR/2017/002963) a AD, la beca DBT Ramalingaswami otorgada a AD (BT/RLF/Re-entry/11/2016) y el apoyo institucional del IIT Kharagpur, India. SD y SM reciben becas de doctorado de CSIR-Senior Research Fellowship; PM recibe una beca de doctorado de MHRD, India.

Materiales

Figura 5A
Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Arena de agresión:
Placa estándar de 24 pocillos de poliestireno12 cm x 8 cm x 2 cm. Diámetro de un solo pocillo= 18 cm. Sigma-aldrich #Z707791; profundidad = 1 cm
plástico/acrílicoAlternativa: una tapa perforada de una placa de cultivo celular
Ensayo de espacio social:
Pinzasde 19 mm
Láminas de vidrio y láminas acrílicas de tamañosEspesor = 5 mm
Ensayo de corte:
Tuerca y tornillo con rosca
Láminas de metacrilato de formaspersonalizadasi) Tapa: Un disco de metacrilato transparente redondo hecho a medida (2-3 mm de grosor, 70 mm de diámetro) con un orificio de carga en la región periférica y otro orificio de tornillo en el centro (diámetro ~ 3 mm para cada uno); ii) Un segundo disco de metacrilato transparente más grueso (3-4 mm de espesor, 70 mm de diámetro), con 6-8 perforaciones de 15 mm de diámetro, equidistantes del centro; iii) Base: Igual que la tapa, excepto sin el orificio
de cargaEnsayo de aseo: < / fuerte>
Panel10– Panel LED de montaje en techo de 15 vatios
Habituation and Y-maze assay
Tapón dede gas Borosil #1761021
FrascoOD= 25 mm x Altura= 85 mm; Vidrio de borosilicato
Odorante (butirato de etilo)Merck #E15701
cera de parafina (líquida) lightSRL #18211
Pinzas dePolymed #14098
Tubos deOD = 0,6 cm, ID = 0,3 cm; pinzas de rodillo para el control del caudal
Bombade vacío Hana #HN-648 (Cualquier bomba de acuario con dirección de flujo invertido manualmente)
LaberintoVidrio de borosilicato
Tubo de vidrio en forma de Y (vidrio de borosilicato)Hecho a medida, mediciones en Figura 5A
>Elementos comunes:
Cualquier software para la reproducción de video (por ejemplo, reproductor multimedia VLC)https://www.videolan.org/vlc/
Ordenador para el análisis
de datos de vídeo Botellas para moscasOD= 60 mm x Altura= 140 mm; vidrio/polipropileno
Viales para moscasOD= 25 mm x Altura= 85 mm; Vidrio de borosilicato
Graph-pad SoftwarePrisma https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/www.graphpad.com/scientific-software/prism/
ImageJ softwarehttps://imagej.net/downloads
Temporizador Cámara
de video con grabación de video configurada Videocámarao cámara de teléfono móvil funcionará
Para aspirador de moscas:
AlgodónAbsorbente, autoclave
ParafilmSigma-aldrich
#P7793 Puntas200 µ L o 1000 y micro; L, elija dependiendo del diámetro exterior del tubo de silicona Longitud del tubo
silicona / caucho= 30-50 cm. El tubo debe ser inodoro
Composición de la comida para moscas:
Ingredientes (cantidad para 1 L de comida)
Agar (8 g)SRL # 19661 (CAS: 9002-18-0)
Harina de maíz (80 g)D-glucosa orgánica, obtenida localmente
(20 g)SRL # 51758 (CAS: 50-99-7)
Ácido propiónico (4 g)SRL # 43883 (CAS: 79-09-4)
Sacarosa (40 g)SRL # 90701 (CAS: 57-50-1)
Tego (Metil para hidroxibenzoato) (1.25 g)SRL # 60905 (CAS: 5026-62-0)
Levadura en polvo (10 g)HIMEDIA # RM027
Líneas de mosca utilizadas en los experimentos de este estudio:
Tipo salvaje (Cantón S o CS)BDSC # 64349
w1118BDSC # 3605
w[1118]; Fmr1[Δ 50M]/TM6B, Tb[+]BDSC # 6930
w[*]; Fmr1[Δ 113M]/TM6B, Tb[1]BDSC # 67403
MB247-GAL4 (Gaurav Das, NCCS Pune, India)BDSC # 50742
LN1-GAL4NP1227, consorcio NP, Japan
row-shRNABDSC # 25971
transparente de Lámina transparente de de encuadernación personalizados LED cubierto de vidrio difuso Climbing chambers x2, vidrio de borosilicato Adaptador para conectar Y-maze con un vial de entrada Metacrilato, hecho a medida, mediciones en Clear reactivos botellas Borosil #1500017 lavado de vidrio rodillo silicona en Y de pipeta de

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