Artículo de método

Preparación y análisis de láminas histológicas de globos oculares de rata y ratón para evaluar la retina

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DOI:

10.3791/66663

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23 de agosto de 2024

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1Chair and Department of Experimental and Clinical Physiology, Laboratory of Centre for Preclinical Research, Medical University of Warsaw, 2Department of Pathology, Medical University of Warsaw

Autores correspondientes: Kaja Kasarełło <kaja.kasarello@wum.edu.pl>

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Este manuscrito presenta un protocolo para la preparación histológica de láminas a partir de globos oculares de roedores. Con el método propuesto, la retina interna puede visualizarse y evaluarse fácilmente bajo un microscopio óptico. El procedimiento se presenta para los globos oculares de ratones y ratas.

Resumen

Un globo ocular de roedor es una herramienta poderosa para investigar los mecanismos patológicos de muchas enfermedades oftálmicas, como el glaucoma, la retinopatía hipertensiva y muchas más. Los experimentos preclínicos permiten a los investigadores examinar la eficacia de nuevos fármacos, desarrollar nuevos métodos de tratamiento o buscar nuevos mecanismos patológicos implicados en la aparición o progresión de la enfermedad. Un examen histológico proporciona mucha información necesaria para evaluar los efectos de los experimentos realizados y puede revelar degeneración, remodelación de tejidos, infiltración y muchas otras patologías. En la investigación clínica, rara vez hay posibilidades de obtener tejido ocular adecuado para un examen histológico, por lo que los investigadores deben aprovechar la oportunidad que ofrece el examen de los globos oculares de los roedores. Este manuscrito presenta un protocolo para la preparación histológica de secciones de globos oculares de roedores. El procedimiento se presenta para los globos oculares de ratones y ratas y consta de los siguientes pasos: (i) recolección del globo ocular, (ii) preservación del globo ocular para su posterior análisis, (iii) procesamiento del tejido en parafina, (iv) preparación de portaobjetos, (v) tinción con hematoxilina y eosina, (vi) evaluación del tejido bajo un microscopio óptico. Con el método propuesto, la retina puede visualizarse fácilmente y evaluarse en detalle.

Introducción

El globo ocular es una estructura en forma de globo que constituye el órgano de la vista. El interior del globo ocular se puede dividir en dos segmentos: el segmento anterior, que incluye la córnea, el iris, el cuerpo ciliar, el cristalino, la cámara anterior y la cámara posterior, y el segmento posterior, que incluye el cuerpo vítreo, la retina, la coroides, la esclerótica y la cabeza del nervio óptico. La cámara anterior se encuentra entre la córnea y el iris 1,2. El iris es una estructura circular con una abertura en el centro llamada pupila. En la unión de la córnea y el iris, se encuentra el ángulo de drenaje, donde un sistema especializado de trabéculas drena el humor acuoso del globo ocular al sistema venoso. La cámara posterior está unida por el iris, el cuerpo ciliar y el cristalino, así como por los ligamentos suspensorios que mantienen el cristalino en su lugar. Detrás del cristalino se encuentra el cuerpo vítreo, que es la estructura más grande del globo ocular. El cuerpo vítreo se adhiere a la retina y estabiliza su posición. La retina está rodeada por la coroides y la esclerótica1. La anatomía del globo ocular se resume en la Figura 1.

La pared del globo ocular está constituida por tres capas. La capa más externa es la esclerótica, que protege el globo ocular de lesiones y mantiene su forma. En el polo anterior del globo ocular, la esclerótica se convierte en una córnea transparente. Debajo de la esclerótica, hay una estructura vascular llamada úvea, cuya función principal es nutrir las estructuras del ojo. La úvea forma la coroides, y dentro del polo anterior, el cuerpo ciliar y el iris1. La capa más interna es la retina, que es una estructura altamente especializada del ojo, formada por neuronas, células gliales y células epiteliales pigmentarias. Las neuronas de la retina incluyen las células fotorreceptoras (bastones y conos), las células horizontales, las células bipolares, las células amacrinas y las células ganglionares de la retina (RGC). Estas células están organizadas en capas complejas, y su función es recibir y procesar estímulos luminosos 2,3. Las células gliales de la retina comprenden las células de Müller, los astrocitos y la microglía, que están presentes en todas las capas de la retina. Las muchas funciones de las células gliales incluyen la nutrición de las neuronas, el apoyo de la barrera hematorretiniana, el soporte estructural de las neuronas para mantener la estructura estratificada de la retina, la regulación del metabolismo de las neuronas, la secreción de proteínas biológicamente activas que regulan el funcionamiento, el crecimiento y la supervivencia de las neuronas, y la regulación de los procesos inmunológicos dentro de la retina. Las células epiteliales pigmentarias forman la capa más externa de la retina y actúan como una barrera entre la coroides y los fotorreceptores. Estas células regulan el transporte bidireccional de productos de desecho y nutrientes y también protegen la retina del daño excesivo inducido por la luz al absorber la energía lumínica y neutralizar las especies reactivas de oxígeno generadas por la luz5.

La retina se puede dividir en diez capas: (i) el epitelio pigmentario de la retina, (ii) la capa del segmento fotorreceptor (bastones y conos), (iii) membrana limitante externa (ELM), (iv) capa nuclear externa (ONL), (v) capa plexiforme externa (OPL), (vi) capa nuclear interna (INL), (vii) capa plexiforme interna (IPL), (viii) capa de células ganglionares (GCL), (ix) capa de fibra nerviosa de la retina (RNFL), y (x) membrana limitante interna (ILM)2. Las capas nucleadas de la retina incluyen ONL, INL y GCL, mientras que las capas con conexiones sinápticas entre células incluyen OPL e IPL6. Los núcleos de bastones y conos forman la ONL, y sus axones se extienden hacia la OPL, donde se conectan a las dendritas de las células bipolares y horizontales. Dentro del INL se localizan los núcleos de células horizontales, bipolares y amacrinas. Dentro de la IPL, los terminales axónicos de las células bipolares y amacrinas hacen sinapsis con las dendritas de las RGC. Dentro del GCL, las RGC constituyen la mayoría de los cuerpos celulares, pero también se pueden encontrar allí algunas células amacrinas dislocadas. Los axones de las RGC forman el RNFL y, además, el nervio óptico 7,8,9.

Muchas enfermedades oftálmicas, como los trastornos neurodegenerativos de la retina, conducen a la ceguera irreversible e incurable10. La visión es considerada uno de los sentidos más importantes11, y la ceguera permanente reduce significativamente la calidad de vida del paciente. Para mejorar la comprensión de los mecanismos patológicos de muchas enfermedades, se realiza una amplia investigación preclínica con cultivos celulares o modelos animales. Los estudios preclínicos con animales de experimentación ofrecen la oportunidad de evaluar los mecanismos patológicos subyacentes a las enfermedades oculares y desarrollar nuevas estrategias terapéuticas. Las enfermedades oculares se pueden modelar tanto en animales grandes (monos, vacas, perros y gatos) como en animales pequeños (conejos, ratas, ratones y peces cebra). El uso de animales más grandes permite un mejor acceso al ojo debido a su tamaño. Por otro lado, los experimentos realizados con roedores, debido a su reproducción relativamente rápida, permiten la cría de cepas endogámicas caracterizadas por la susceptibilidad a ciertas enfermedades12,13.

En modelos animales, es posible la enucleación, que permite realizar un examen histopatológico detallado del globo ocular, con la evaluación de patologías menores que aparecen en estructuras particulares del ojo durante el desarrollo de la enfermedad, un examen que se puede realizar muy raramente entre los humanos. La evaluación histopatológica es una herramienta extremadamente valiosa en la investigación de los mecanismos patológicos de los trastornos oculares. En la literatura publicada, las descripciones de la metodología para el examen histológico de los globos oculares son muy limitadas y faltan guías paso a paso, lo que dificulta la recreación para los principiantes. Este estudio tiene como objetivo proporcionar un método simple y conciso para preparar portaobjetos histológicos y evaluar la retina de ratas y ratones.

Protocolo

La investigación se realizó de acuerdo con los lineamientos institucionales. Los globos oculares utilizados en este estudio se obtuvieron de animales incluidos en un experimento realizado sobre la base del número de aprobación del estudio WAW2/122/2020 emitido por el2º Comité de Ética Local de la Universidad de Ciencias de la Vida de Varsovia en Varsovia, Polonia. Nuestro protocolo se desarrolló examinando ratones de 11 y 44 semanas y ratas de 6, 12 y 16 semanas.

1. Preparación de los globos oculares del ratón

NOTA: Este protocolo presenta el método de preparación de secciones de globos oculares de ratón y se desarrolló utilizando globos oculares recolectados de: ratones hembra C57Bl/6 de 11 semanas de edad (peso promedio de 21 g), ratones hembra C57Bl/6 de 44 semanas (peso promedio de 25 g), ratones hembra DBA/2 de 11 semanas (peso promedio de 21,5 g) y ratones hembra DBA/2 de 44 semanas con glaucoma (peso promedio de 25 g).

  1. Enucleación
    1. Use pinzas pequeñas para abrir los párpados. Presione los párpados para que el globo ocular se prolapse.
    2. Disecciona el globo ocular de la cuenca cortando el tejido detrás del globo ocular con unas tijeras pequeñas y afiladas. Una vez que se retira el globo ocular de la órbita, se corta el tejido conectivo que sobresale y los músculos perioculares.
      1. Marque los globos oculares para una mejor orientación, por ejemplo, atando una pequeña sutura en el muñón del tendón del músculo recto lateral del globo ocular para marcar el lado temporal del globo ocular.
  2. Fijación de tejidos
    1. Colocar el globo ocular enucleado en tubos de microcentrífuga de 1,5 mL y dejarlo reposar en una solución de paraformaldehído (PFA) al 4 % disuelto en solución salina tampón fosfato (PBS) durante 24 h.
    2. A continuación, tratar el globo ocular durante 24 h en una solución de sacarosa al 10%, luego retirar y colocar durante 24 h en una solución de sacarosa al 20% y, finalmente, retirar y colocar durante 24 h en una solución de sacarosa al 30%.
      NOTA: Durante todo el proceso, mantenga el globo ocular a una temperatura baja de 4 °C. Deben evitarse las punciones con agujas para la infiltración de sacarosa a fin de minimizar el riesgo de daño en el globo ocular.
  3. Congelación y almacenamiento de tejidos
    1. Retira el globo ocular de la solución de sacarosa y sécalo frotándolo ligeramente con una toalla de papel.
    2. Coloque el globo ocular en un tubo de microcentrífuga limpio de 1,5 ml y congélelo a -80 °C para su posterior procesamiento.
      NOTA: Si se almacena a -80 °C, un globo ocular puede permanecer viable hasta 12 meses hasta el procesamiento futuro.
  4. Preparación de portaobjetos
    1. Descongele el globo ocular a temperatura ambiente. Muévalo del tubo de microcentrífuga a un casete y enjuague con agua corriente durante 20 minutos para lavar la sacarosa.
    2. Deshidrate el globo ocular colocándolo y luego retirándolo de las siguientes soluciones debajo de una campana extractora: solución al 70 % de alcohol etílico (EtOH) durante 10 minutos, solución al 80 % de EtOH durante 10 minutos, solución al 96 % de EtOH durante 10 minutos, solución al 99,9 % de EtOH durante 10 minutos y acetona durante 5 minutos.
    3. Limpie el globo ocular colocándolo en xileno durante 5 minutos debajo de una campana extractora.
    4. Derrita la parafina colocando un poco de parafina sólida en un vaso de precipitados y colocándola en una incubadora de laboratorio ajustada a una temperatura superior a la temperatura de fusión especificada por el fabricante de la parafina (la temperatura de fusión de la parafina está entre 46 °C y 68 °C). Después de que la parafina se haya derretido por completo (el tiempo depende de la cantidad de parafina utilizada), mueva el globo ocular al vaso de precipitados con parafina y manténgalo caliente en la incubadora durante 1 h. Durante 1 h de infiltración de parafina en el tejido, revuelva la parafina cada 10 - 15 min.
      NOTA: Para este paso se puede utilizar un procesador de tejidos que permita la infiltración de parafina mientras se agita la solución.
    5. Incruste el globo ocular en un bloque de parafina como se describe a continuación.
      1. Abra el casete y retire la tapa superior. Elige un molde de metal y vierte una pequeña cantidad de parafina para cubrir el fondo del molde. Retire el globo ocular del casete con pinzas y colóquelo sobre la parafina en el molde. Coloque el globo ocular de lado para asegurar el corte en el plano sagital.
        NOTA: Colocar el globo ocular de lado (con el polo anterior a un lado y el polo posterior al otro) permitirá el corte en el plano sagital. De esta manera, se obtendrán cortes a través de la córnea, el iris, el cuerpo ciliar, la pupila, la retina periférica y central.
      2. Enfríe brevemente el molde en una placa de enfriamiento ajustada a -15 °C para que la parafina se solidifique ligeramente y ancle el tejido en su lugar. Cubra con cuidado el pañuelo con parafina y el fondo del casete para formar un bloque. Coloque el bloque en una placa de enfriamiento para que se solidifique por completo. Luego, retire el bloque del molde de metal y vuelva a colocar los bloques de parafina en la placa de enfriamiento durante al menos 15 minutos para que se enfríen antes de cortar.
    6. Asegure un bloque de parafina en el micrótomo. Ajuste el micrótomo para recortar el exceso de parafina del bloque (lo configuramos para cortar 15 μm) y recorte hasta el centro del globo ocular. Cambie la configuración del micrótomo para cortar secciones más delgadas (lo configuramos para cortar 3,5 μm) y coloque la sección en un portaobjetos. Si usa un micrótomo con un baño de agua adyacente, retire el exceso de agua del portaobjetos con un pañuelo húmedo.
      NOTA: El objetivo es obtener al menos 3 secciones transversales a través de la pupila. Cuanto menos experimentado sea el investigador, más secciones se deben obtener para asegurar la sección al nivel del alumno. Coloca un par de secciones en un portaobjetos. Además, para los investigadores menos experimentados, corte el tejido más grueso, por ejemplo, en secciones de 4 μm o 5 μm de grosor. El uso de un micrótomo con un baño de agua adyacente hace que el proceso de transferencia de secciones de tejido a portaobjetos sea mucho más fácil en comparación con el uso de micrótomos sin baños de agua. Otro punto que vale la pena señalar es que la lente puede ser difícil de cortar. Para minimizar el riesgo de daño tisular por el cristalino frágil, utilice únicamente hojas afiladas de micrótomo diseñadas para cortar tejidos duros. Considere usar una hoja para recortar y otra para cortar secciones para minimizar el desafilamiento de la hoja.
    7. Coloque el portaobjetos en una incubadora de laboratorio a 56 °C durante 30 minutos.
    8. Retire el portaobjetos de la incubadora y comience a teñirlo con hematoxilina y eosina (H&E) manualmente colocando y retirando secuencialmente el portaobjetos hacia y desde las siguientes soluciones. Comience con 7 minutos de xileno, 5 minutos de xileno (otro vaso de precipitados con una solución limpia) y 5 minutos de xileno (otro vaso de precipitados con una solución limpia). A continuación, aplique 2 min de EtOH al 96%, 1 min de EtOH al 96% (otro vaso de precipitados con una solución limpia), 1 min de EtOH al 96% (otro vaso de precipitados con una solución limpia).
    9. Lavar con 5 minutos de agua corriente, luego 2 minutos de hematoxilina de Mayer, 2 minutos de hematoxilina de Mayer (otro vaso de precipitados con una solución limpia), 5 minutos de agua corriente, 5 minutos de agua corriente (otro vaso de precipitados limpio).
    10. Añadir 1 % de eosina durante 2 minutos, seguido de 1 min de EtOH al 96 %, 30 s 96 % de EtOH (otro vaso de precipitados con una solución limpia), 30 s 96 % de EtOH (otro vaso de precipitados con una solución limpia), 2 min de xileno, 1 min de xileno (otro vaso de precipitados con una solución limpia), 2 min de xileno (otro vaso de precipitados con una solución limpia).
      NOTA: Alternativamente, use un tinte de portaobjetos automatizado.
    11. Selle el portaobjetos con un sellador de portaobjetos automatizado. El portaobjetos preparado está listo para su almacenamiento y evaluación bajo un microscopio óptico.
      NOTA: Alternativamente, realice el sellado manual del portaobjetos colocando una capa delgada de soporte de poliestireno sobre el tejido manchado y cubriéndolo con un cubreobjetos de vidrio.
      PRECAUCIÓN: Los pasos que incluyen PFA, EtOH, acetona y xileno deben realizarse bajo una campana extractora de laboratorio.

2. Preparación de la sección de globos oculares de rata y montaje de la corredera

NOTA: Este protocolo presenta el método de preparación de secciones de globos oculares de rata y se desarrolló utilizando los globos oculares recolectados de: ratas SHR macho de 6 semanas (peso promedio de 115,5 g), ratas SHR macho de 12 semanas con hipertensión arterial (peso promedio de 262,5 g), ratas WKY macho de 6 semanas (peso promedio de 143,5 g), ratas WKY macho de 12 semanas (peso promedio de 265 g), ratas Lewis macho de 12 semanas (peso promedio 310 g), y ratas Lewis macho de 16 semanas con diabetes mellitus inducida (peso promedio 259 g).

  1. Enucleación
    1. Use pinzas pequeñas para abrir los párpados. Presione los párpados para prolapsar el globo ocular.
    2. Disecciona el globo ocular de la cuenca cortando el tejido detrás del globo ocular con unas tijeras pequeñas y afiladas.
      NOTA: Marque los globos oculares para una mejor orientación, por ejemplo, atando una pequeña sutura en el muñón del tendón del músculo recto lateral del globo ocular para marcar el lado temporal del globo ocular.
  2. Fijación de tejidos
    1. Colocar el globo ocular enucleado en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL y dejarlo reposar en una solución al 4% de paraformaldehído (PFA) disuelto en solución salina tampón fosfato (PBS) durante 24 h.
    2. A continuación, trate el globo ocular durante 24 h en una solución al 10% de sacarosa, luego retírelo y colóquelo durante 24 h en una solución al 20% de sacarosa, y finalmente retírelo y colóquelo durante 24 h en una solución al 30% de sacarosa.
      NOTA: Durante todo el proceso, mantenga el globo ocular a una temperatura baja de 4 °C. Deben evitarse las punciones con agujas para la infiltración de sacarosa a fin de minimizar el riesgo de daño en el globo ocular.
  3. Congelación y almacenamiento de tejidos
    1. Retira el globo ocular de la solución de sacarosa y sécalo frotándolo ligeramente con una toalla de papel.
    2. Coloque el globo ocular en un tubo de microcentrífuga limpio de 1,5 mL y congélelo a -80 °C para su procesamiento futuro.
      NOTA: Si se almacena a -80 °C, el globo ocular puede permanecer viable hasta 12 meses hasta el procesamiento futuro.
  4. Preparación de portaobjetos
    1. Retire el globo ocular del congelador y del tubo de microcentrífuga. Corta el globo ocular por la mitad a lo largo del plano sagital con un bisturí afilado. Retire y deseche la lente.
      NOTA: Este paso es más fácil de realizar en un globo ocular congelado, recién sacado del congelador. Durante el corte del globo ocular, el cristalino puede dañar el tejido circundante. Para minimizar el riesgo de daños, utilice un bisturí muy afilado y sea cauteloso.
    2. Descongele el globo ocular a temperatura ambiente. Mueva las dos mitades en un casete y enjuague con agua corriente durante 20 minutos para lavar la sacarosa.
    3. Deshidrate el globo ocular colocándolo y luego retirándolo de las siguientes soluciones debajo de una campana extractora: solución al 70% de alcohol etílico (EtOH) durante 15 minutos, solución al 80% de EtOH durante 15 minutos, solución al 96% de EtOH durante 15 minutos, solución al 99,9% de EtOH durante 15 minutos y acetona durante 7 minutos.
    4. Limpie el globo ocular colocándolo en xileno durante 7 minutos debajo de una campana extractora.
    5. Derrita la parafina colocando un poco de parafina sólida en un vaso de precipitados y colocándola en una incubadora de laboratorio ajustada a una temperatura superior a la temperatura de fusión especificada por el fabricante de la parafina (la temperatura de fusión de la parafina está entre 46 °C y 68 °C). Después de que la parafina se haya derretido por completo (el tiempo depende de la cantidad de parafina utilizada), mueva el globo ocular al vaso de precipitados con parafina y manténgalo caliente en la incubadora durante 1 h. Durante 1 h de infiltración de parafina en el tejido, revuelva la parafina cada 10 - 15 min.
      NOTA: Para este paso se puede utilizar un procesador de tejidos que permita la infiltración de parafina mientras se agita la solución.
    6. Incruste el globo ocular en un bloque de parafina como se describe a continuación.
      1. Abra el casete y retire la tapa superior. Elige un molde de metal y vierte una pequeña cantidad de parafina para cubrir el fondo del molde. Retire el globo ocular del casete con pinzas y colóquelo sobre la parafina en el molde. Coloque la mitad del globo ocular con la parte inferior de la taza hacia arriba y la otra hacia abajo.
        NOTA: Colocar las mitades del globo ocular con una mitad con la parte inferior de la copa hacia arriba y la otra hacia abajo permitirá el corte de tejido en el plano sagital. De esta manera, se obtendrán cortes a través de la córnea, el iris, el cuerpo ciliar, la pupila, la retina periférica y central.
      2. Enfríe brevemente el molde en una placa de enfriamiento ajustada a -15 °C para que la parafina se solidifique ligeramente y ancle el globo ocular en su lugar. Cubra cuidadosamente el globo ocular con parafina y la parte inferior del casete para formar un bloque. Coloque el bloque en una placa de enfriamiento para que se solidifique por completo. Luego, retire el bloque del molde de metal y vuelva a colocar los bloques de parafina en la placa de enfriamiento durante al menos 15 minutos para que se enfríen antes de cortar.
    7. Asegure un bloque de parafina en el micrótomo. Ajusta el micrótomo para recortar el exceso de parafina del bloque (lo configuramos para cortar 15 μm) y recorta hasta llegar al centro del globo ocular. Cambie la configuración del micrótomo para cortar secciones más delgadas (lo configuramos para cortar 3,5 μm) y coloque la sección en un portaobjetos. Si está utilizando un micrótomo con un baño de agua adyacente, retire el exceso de agua del portaobjetos con un pañuelo húmedo.
      NOTA: El objetivo es obtener al menos 3 secciones transversales a través de la pupila. Cuanto menos experimentado sea el investigador, más secciones se deben obtener para asegurar la sección al nivel del alumno. Coloca un par de secciones en un portaobjetos. Además, para los investigadores menos experimentados, corte el tejido más grueso, por ejemplo, en secciones de 4 μm o 5 μm de grosor. El uso de un micrótomo con un baño de agua adyacente hace que el proceso de transferencia de secciones de tejido a portaobjetos sea mucho más fácil en comparación con el uso de micrótomos sin baños de agua.
    8. Retire el portaobjetos y comience a teñir con hematoxilina y eosina (H&E) manualmente colocando y retirando secuencialmente el portaobjetos hacia y desde las siguientes soluciones. Comience con 7 minutos de xileno, 5 minutos de xileno (otro vaso de precipitados con una solución limpia) y 5 minutos de xileno (otro vaso de precipitados con una solución limpia). A continuación, aplique 2 min de EtOH al 96%, 1 min de EtOH al 96% (otro vaso de precipitados con una solución limpia), 1 min de EtOH al 96% (otro vaso de precipitados con una solución limpia).
    9. Lavar con 5 minutos de agua corriente, luego 2 minutos de hematoxilina de Mayer, 2 minutos de hematoxilina de Mayer (otro vaso de precipitados con una solución limpia), 5 minutos de agua corriente, 5 minutos de agua corriente (otro vaso de precipitados limpio).
    10. Añadir 1 % de eosina durante 2 minutos, seguido de 1 min de EtOH al 96 %, 30 s 96 % de EtOH (otro vaso de precipitados con una solución limpia), 30 s 96 % de EtOH (otro vaso de precipitados con una solución limpia), 2 min de xileno, 1 min de xileno (otro vaso de precipitados con una solución limpia), 2 min de xileno (otro vaso de precipitados con una solución limpia).
      NOTA: Alternativamente, use un tinte de portaobjetos automatizado.
    11. Selle el portaobjetos con un sellador de portaobjetos automatizado. Los portaobjetos preparados están listos para su almacenamiento y evaluación bajo un microscopio óptico.
      NOTA: Alternativamente, realice el sellado del portaobjetos manualmente, colocando una capa delgada de montante de poliestireno sobre el tejido teñido y cúbralo con un cubreobjetos de vidrio.
      PRECAUCIÓN: Los pasos que incluyen PFA, EtOH, acetona y xileno deben realizarse bajo una campana extractora de laboratorio.

3. Evaluación de las secciones del globo ocular

  1. Escaneo de diapositivas
    1. Coloque el portaobjetos en un escáner de portaobjetos histopatológico y escanee las secciones utilizando el modo de escaneo: 40x. Guarde las imágenes como archivos digitales de alta resolución.
  2. Análisis de diapositivas
    1. Abra el archivo escaneado con el uso de un software de visualización de imágenes. Encuentre secciones transversales de pupila cruzada y analice tres secciones consecutivas.
    2. Encuentre la parte más gruesa de la retina y amplíe la imagen a 20x presionando el cuadro de aumento en la esquina superior derecha y eligiendo 20x. Mueva el ratón hasta el nivel de ELM en la parte más gruesa de la retina y pulse el botón derecho del ratón, elija Anotar y Regla.
    3. Mueva el ratón hacia el ILM y haga clic en el botón de la izquierda. Asigne un título a la medición RT y marque las casillas mostrar título y mostrar longitud. De esta manera, se medirá el grosor de la retina (RT) y la medición se mostrará en μm. Los resultados representativos se muestran en la Figura 2 y la Figura 3.
    4. Use la regla, mida el grosor de cada capa de la retina, incluidas las ONL, OPL, INL e IPL, y etiquételas. Los resultados representativos se muestran en la Figura 4 y la Figura 5.
    5. Para contar el número de células dentro del GCL, establezca una longitud predeterminada de la retina. Por ejemplo, para la retina del ratón, use una sección de 500 μm, y para la retina de la rata, use cinco secciones de 100 μm.
    6. Con la regla, mida la distancia elegida a lo largo del GCL. Pulse el botón derecho del ratón y seleccione Anotar > guardado > 1x RBC. Haga clic en cada célula identificada como un cuerpo redondo teñido con hematoxilina a lo largo del GCL a lo largo de la longitud predeterminada de la retina. Cuenta el número de celdas encerradas en un círculo. Los resultados representativos se muestran en la Figura 6 y la Figura 7.
    7. Después de analizar tres secciones consecutivas, dibuje el promedio de todas las mediciones.

Resultados

Con el uso del protocolo presentado, se puede evaluar en detalle la anatomía y morfología de estructuras específicas del globo ocular. Nuestro equipo se centra en investigar los mecanismos patológicos de la neurodegeneración en los trastornos de la retina, como el glaucoma, la retinopatía diabética y la retinopatía hipertensiva. Para evaluar las características de la neurodegeneración en la retina, evaluamos el RT (globo ocular de ratón -Figura 2, globo ocular de rata -Figura 3), ONL, OPL, INL e IPL (globo ocular de ratón -Figura 4, globo ocular de rata -Figura 5), y el número de células del GCL (globo ocular de ratón -Figura 6, globo ocular de rata -Figura 7). Se espera que la RT y las células de la GCL sean más altas en la retina central y más bajas en la periferia. Al cortar el globo ocular a nivel de la pupila, se logran cortes transversales a través de la retina central (en el polo posterior del globo ocular) y periférica (cerca del cuerpo ciliar) en un portaobjetos.

Si bien el recuento de células GCL puede considerarse bastante objetivo, el sesgo causado por el corte sesgado puede influir en los resultados de la medición de las capas específicas de la retina. Para evitar sesgos, las mediciones se pueden presentar como la relación entre el espesor de una capa dada y el valor RT: ONL/RT, OPL/RT, INL/RT e IPL/RT.

Diagrama de anatomía del ojo que muestra las partes etiquetadas: retina, esclerótica, cristalino, córnea, nervio óptico, mácula.
Figura 1: Anatomía del globo ocular. Sección transversal sagital de un globo ocular con el etiquetado de sus estructuras más grandes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Imagen de microscopio de la sección transversal de la retina, que muestra capas de tejido, medición de espesor de 125 μm.
Figura 2: Grosor de la retina en un ratón. Medición del grosor de la retina (RT) desde la membrana limitante externa hasta la membrana limitante interna en el punto más ancho, marcado con la barra verde. Globo ocular de ratón (cepa: C57Bl/6, edad: 44 semanas). La barra de escala en la esquina izquierda muestra la longitud de 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Sección histológica que muestra capas retinianas, 53,4 μm de espesor; Imagen de microscopía, estudio de tejidos.
Figura 3: Grosor de la retina en una rata. Medición del grosor de la retina (RT) desde la membrana limitante externa hasta la membrana limitante interna en el punto más ancho, marcado con la barra verde. Globo ocular de rata (cepa: Lewis, edad: 16 semanas). La barra de escala en la esquina izquierda muestra la longitud de 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Diagrama de sección transversal del tejido de la retina; capas medidas: IPL, INL, OPL, ONL; Análisis microscópico.
Figura 4: Capas de retina en un ratón. Medición del grosor de las capas individuales de la retina: capa nuclear externa (ONL), capa plexiforme externa (OPL), capa nuclear interna (INL) y capa plexiforme interna (IPL), marcadas con barras verdes. Globo ocular de ratón (cepa: C57Bl/6, edad: 44 semanas). La barra de escala en la esquina izquierda muestra la longitud de 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Imagen microscópica de la sección transversal de la retina con capas marcadas: OPL, ONL, IPL, INL; Barra de escala 100 μm.
Figura 5: Capas de retina en una rata. Medición del grosor de las capas individuales de la retina: capa nuclear externa (ONL), capa plexiforme externa (OPL), capa nuclear interna (INL) y capa plexiforme interna (IPL), marcadas con barras verdes. Globo ocular de rata (cepa: Lewis, edad: 16 semanas). La barra de escala en la esquina izquierda muestra la longitud de 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Sección de histología que muestra la estructura celular en capas, imagen de microscopio, análisis de tejidos, escala de 500 μm.
Figura 6: Recuento de células de la capa de células ganglionares en un ratón. Método de recuento de las células de la capa de células ganglionares (GCL) a lo largo de la retina con una longitud de 500 μm. Los cuerpos unicelulares se identificaron como cuerpos redondos, teñidos con hematoxilina, ubicados dentro de la capa de células ganglionares. Las celdas están marcadas con círculos negros. Globo ocular de ratón (cepa: DBA/2, edad: 44 semanas). La barra de escala en la esquina izquierda muestra la longitud de 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Portaobjetos de histología, sección transversal de retina; capas de tejido visibles; examen microscópico, escala de 100 μm.
Figura 7: Recuento de células de la capa de células ganglionares en una rata. Método de recuento de las células de la capa de células ganglionares (GCL) a lo largo de la retina con una longitud de 100 μm. Los cuerpos unicelulares se identificaron como cuerpos redondos teñidos con hematoxilina ubicados dentro de la capa de células ganglionares. Las celdas están marcadas con círculos negros. Globo ocular de rata (cepa: Lewis, edad: 16 semanas). La barra de escala en la esquina izquierda muestra la longitud de 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Un examen histológico del globo ocular de ratón y rata es una herramienta poderosa en el campo de la oftalmología experimental. Puede proporcionar nueva información relacionada con los cambios en las estructuras oculares en el curso de enfermedades oftálmicas, que de otro modo no se observarían en entornos clínicos. Los protocolos descritos presentan un método sencillo para realizar un análisis histológico de la retina. Las sutilezas del procedimiento necesario para procesar los tejidos anteriores, como la córnea, no se describen aquí.

En el estudio presentado, la enucleación se realizó después de la eutanasia de los animales porque, además de los globos oculares, se recolectaron otros tejidos (sangre, riñones) con fines de investigación. Sin embargo, la enucleación también se puede realizar en animales vivos bajo anestesia. Wilding et al. han descrito el procedimiento14, y nos gustaría remitir a los lectores a este trabajo para que vean fotos del procedimiento de enucleación.

Aunque los protocolos para la preparación de portaobjetos con ojos de ratón y rata son similares, la principal diferencia entre los ojos de ratón y rata que hay que tener en cuenta al preparar portaobjetos es su tamaño. Los globos oculares de las ratas tienen un volumen entre 8 y 10 veces mayor en comparación con los ratones, mientras que la longitud axial media de un globo ocular de ratón es de unos 3,2 mm, y la longitud axial del globo ocular de una rata suele oscilar alrededor de los 6,91mm. Esto facilita la necesidad de cortar los globos oculares de las ratas por la mitad para una mejor penetración del reactivo en el tejido durante el procesamiento. Además, el tiempo necesario para la penetración del reactivo en el tejido de la rata es mayor que el de los globos oculares de ratón. Al cortar los globos oculares de la rata por la mitad, es importante usar una cuchilla afilada, ya que el cristalino firme y congelado puede resultar un obstáculo.

Otro punto que vale la pena discutir es la fijación de los tejidos después de la recolección de los animales. En el protocolo presentado, los globos oculares, después de la enucleación, se fijaron con PFA y se sumergieron en soluciones de sacarosa. La sacarosa actúa como crioprotector, ya que protege las células de los tejidos grandes del daño de los cristales de hielo que se forman durantela congelación. La congelación del tejido permite a los investigadores almacenar el tejido durante más tiempo y también utilizarlo para diversos exámenes en el futuro, incluido un análisis histopatológico con un micrótomo (como se presenta), un análisis histopatológico con un criotomo y el inmunomarcaje para la evaluación mediante microscopía confocal. Por ejemplo, cuando se corta el globo ocular de una rata por la mitad (paso 2.4.1), si el corte se realiza de manera eficiente y rápida (dentro de 5 a 10 s) y el ojo no tiene tiempo de descongelarse, entonces una mitad del globo ocular se puede usar para histopatología y otra se puede volver a colocar en el congelador para un futuro inmunomarcaje. No recomendamos realizar el inmunomarcaje en tejidos previamente infiltrados con parafina debido a posibles cambios en la conformación de los epítopos proteicos tras la fijación con parafina. Sin embargo, si un grupo de investigadores solo planea realizar un análisis histopatológico utilizando un micrótomo, se puede utilizar un método estándar más simple de fijación de tejidos para la inclusión en parafina, por ejemplo, en lugar de realizar los pasos 1.2.1 - 1.4.1 para ratones o los pasos 2.2.1 - 2.4.2 para ratas, colocar los tejidos en una solución al 10% de PFA durante 24 h. y luego almacenarlos en PBS a 4 °C hasta su procesamiento. La sacarosa no será necesaria como crioprotector, ya que los tejidos no se congelarán. Con este método propuesto se evitará el proceso de congelación, que puede resultar beneficioso y conducir a la obtención de portaobjetos de mayor calidad. La congelación de los globos oculares, aunque proporciona a los investigadores más libertad para elegir el momento de realizar el examen histopatológico, es un paso que puede disminuir potencialmente la calidad de la muestra y provocar un desprendimiento de retina. Sin embargo, hay que recordar que si se almacenan tejidos a 4 °C, su estabilidad biológica será menor, y los tejidos deben analizarse en un plazo de 4 semanas. Además, al trabajar con globos oculares de rata, el paso 2.4.1 (cortar los globos oculares por la mitad) será mucho más difícil de realizar en un globo ocular no congelado.

La metodología presentada se desarrolló con base en la metodología descrita por Chai et al.18, Igarashi et al.19, Zhang et al.20 y Dorfman et al.21, sobre la experiencia personal, y un método de ensayo y error. El método de medición del grosor de la retina y de las capas individuales se describe a partir de la metodología presentada por Chai et al.16 y Barber et al.18,22. El método de conteo de RGC retiniano se desarrolló a partir de una revisión de los trabajos de Chai et al.16, Zhang et al.18, Steinle et al.19 y Dorfman et al.18,20,21,23. En general, la preparación de portaobjetos histopatológicos de globos oculares difiere de una preparación estándar de portaobjetos de tejido fijado en formol e incluido en parafina porque el globo ocular es esférico y, por lo tanto, más difícil de manipular, cortar y seccionar. Además, la esclerótica es una barrera para la infiltración de reactivos en el tejido. Al preparar los portaobjetos histológicos de los globos oculares, hay que trabajar con más delicadeza y precisión, teniendo cuidado de no dañar las delicadas estructuras de la parte interna del globo ocular. Las modificaciones de este protocolo pueden incluir el uso de la técnica de inclusión de metacrilato en lugar de la inclusión en parafina, que puede proporcionar mejores resultados morfológicos. Sin embargo, muy pocos investigadores han utilizado este método para la evaluación de la retina24,25.

Este protocolo no está exento de sesgos. El mayor problema con el que luchó nuestro equipo fue el desgarro y el desprendimiento de retina. Especialmente propensa al desgarro era la retina de los globos oculares de rata, ya que tenían que ser cortados por la mitad antes de la preparación del portaobjetos y, por lo tanto, la retina era más propensa al daño. Debido al desprendimiento de retina, este protocolo no se puede utilizar para la evaluación de la coroides, el epitelio pigmentario de la retina o la capa de segmentos fotorreceptores. Sin embargo, nuestro equipo cree que este protocolo se puede utilizar para evaluar la retina interna (desde el ILM hasta el ELM). Para minimizar la cantidad de desgarro y desprendimiento de retina, cada paso del protocolo debe realizarse con cuidado, lentamente y con movimientos precisos.

El análisis histopatológico de la retina no forma parte del diagnóstico humano estándar, pero es un método ampliamente utilizado en la investigación preclínica. Los resultados de la evaluación histopatológica de la retina en estudios preclínicos pueden relacionarse y discutirse con los resultados de la tomografía óptica coherente (OCT)26, que es un examen que muestra un corte transversal a través de la retina durante un examen in vivo que se puede realizar en un entorno clínico, entre humanos en ensayos clínicos. La OCT, sin embargo, es un examen menos detallado. Por lo tanto, la información que podemos extraer de los estudios histológicos realizados como parte de la investigación preclínica es insustituible y necesaria para el desarrollo del conocimiento médico.

Divulgaciones

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.

Agradecimientos

El trabajo, que incluyó ratas, fue financiado como parte del proyecto TIME 2 MUW - excelencia docente como oportunidad para el desarrollo de la Universidad Médica de Varsovia cofinanciado por el Fondo Social Europeo en el marco del Programa Operativo Desarrollo de la Educación del Conocimiento para 2014-2020, el número del acuerdo de cofinanciación: POWR.03.05.00-00-Z040/18-00. El trabajo, que incluyó ratones, se llevó a cabo como parte de un proyecto implementado en los años 2020 a 2022, financiado por una subvención para la ciencia obtenida por la Universidad Médica de Varsovia.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Acetona  Chempur 
Pinzas Dumont #5, 11 cm, 0,05 x 0,01 mm PuntasWorld Precision Instruments14095pequeño, pinza microquirúrgica
EosinMar-Four4P.05.2001/LSolución acuosa
Alcohol etílico 96 %Chempur CH.ET. AL.96%CZDA.
Alcohol etílico 99,9 %Chempur Ch. ETYL. ALK.99,9%BWÚselo para preparar soluciones al 70% y 80% del
glaciar EtOH - 86 ° C Congelador de temperatura ultrabaja NU-9483ENuAire13027D0034Temperatura de congelación - 80 & grados; C
Portaobjetos de cristalMar-FourMI.15.01673Portaobjetos de vidrio esmerilado con un campo mate de doble cara para la descripción
Leica CV5030 Cubreobjetos de vidrio totalmente automatizadosLeica Biosystems 14,04,78,80,101Sellador de portaobjetos automatizado 
Hematoxilina de MayerChempur 
Moldes con base metálica 15 mm  x 15 mmLeica Biosystems 
Microme HM 340 EThermo Scientific90-519-0Microtomo
Hojas de afeitar MicrotomoMar-FourHI. N.35Ángulo de corte 35&grados;
Casete de biopsia Micro-TwinMar-FourLN.13874550
Procesador de tejidos híbrido por microondasMilestone
Multistainer Leica ST5020Leica Biosystems Tinción de portaobjetos automatizada 
Escáner de portaobjetos NanoZoomer 2.0-HTHamamatsuC9600Escáner de portaobjetos histopatológico
NDP.view2 Software de visualización de imágenesHamamatsuU12388-01 Software de visualización deimágenes
Paraffin Pathowax PlusMar-Four4P. PWP.010Temperatura de fusión 56 &° C - 58 ° C
ParaformaldehídoSigma - Aldrich441244-1KGPrepare una solución al 4% en PBS
PBS Tabletas MerckMillipore524650-1EAÚselo para preparar una solución de solución salina tampón de fosfato, según las instrucciones del fabricante Tubos de
microcentrífuga Pierce, 1,5 mLThermo Scientific69715
Frigorífico-congelador EN14000AWElectrolux925032562-00Refrigeración 4 ° C
Hoja de bisturíSwann-MortonT.OST. SKAL00.024
SacarosaChempur 
Tijeras de resorte SuperCut, 12,5 cm, curvoWorld Precision Instruments501925tijeras microquirúrgicas curvas, pequeñas
Cinta adhesiva para selladoras automáticasMar-FourKP-3020/SMRH001
XyleneChempur Ch. KSYL.5l.METAL.OP 
111024800CH1246874023803081427720906

Referencias

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