Agregación celular encapsulada en matriz de membrana basal para investigar la formación de tejido del bazo murino

Summary

Este artículo describe un protocolo para agregar y encapsular células del bazo dentro de una matriz semisólida de membrana basal. Las construcciones de matriz de membrana basal se pueden utilizar en cultivos tridimensionales para estudiar el desarrollo de organoides, o para estudios de trasplante in vivo y regeneración de tejidos.

Abstract

El bazo es un órgano inmunitario que desempeña un papel clave en las respuestas inmunitarias transmitidas por la sangre. La pérdida anatómica o funcional de este tejido aumenta la susceptibilidad a infecciones sanguíneas graves y sepsis. El autotrasplante de cortes de bazo se ha utilizado clínicamente para reemplazar el tejido perdido y restaurar la función inmunitaria. Sin embargo, el mecanismo que impulsa la regeneración robusta e inmunológicamente funcional del tejido del bazo no se ha dilucidado por completo. Aquí, nuestro objetivo es desarrollar un método para agregar y encapsular células del bazo dentro de una matriz semisólida con el fin de investigar los requisitos celulares para la formación de tejido del bazo. Las construcciones celulares encapsuladas en la matriz de la membrana basal son susceptibles tanto para el cultivo in vitro de organoides tridimensionales como para el trasplante bajo la cápsula renal para evaluar directamente la formación de tejido in vivo . Mediante la manipulación de las células de entrada para la agregación y encapsulación, demostramos que las células estromales neonatales derivadas del injerto PDGFRβ⁺MAdCAM-1^- son necesarias para la regeneración del tejido del bazo en modelos de trasplante animal.

Introduction

La rotura traumática del bazo y la aparición de múltiples nódulos esplénicos en el cuerpo fue uno de los primeros indicios de que el tejido del bazo albergaba capacidad regenerativa ^1,2. Posteriormente, se introdujeron en la clínica los autotrasplantes de bazo para preservar el tejido del bazo en pacientes que requerían esplenectomía de urgencia³. Sin embargo, a pesar de ser parte de la práctica clínica durante décadas, se sabe muy poco sobre cómo se regenera el bazo. Los modelos de trasplante animal han proporcionado información sobre múltiples parámetros de la regeneración del bazo y la función inmune ^4,5. En particular, las modificaciones experimentales en el método de preparación del injerto han permitido estudiar con mayor detalle la regeneración tisular a nivel celular y molecular.

Los trasplantes que involucran cortes de bazo entero pasan por una fase de necrosis masiva antes de que se reconstruya una nueva estructura del bazo⁶. La fase inicial de la necrosis del injerto sugiere que la mayor parte del tejido trasplantado consiste en gran parte en glóbulos rojos y blancos y es innecesario para la regeneración del bazo. Esto se investigó experimentalmente mediante la exclusión de células hematopoyéticas de injertos de bazo antes del trasplante bajo la cápsula de riñón de ratón. En este caso, se demostró que la fracción no leucocitaria/no eritrocitaria del bazo, que incluye células estromales y endoteliales, es suficiente para inducir la formación de tejido de novo ⁷. El tejido del estroma del bazo podría procesarse aún más en una suspensión unicelular, lo que permitiría el uso de tecnologías de clasificación celular para manipular la composición del injerto celular. Mediante la eliminación selectiva de tipos de células candidatas, se identificaron dos poblaciones de células estromales CD45-TER-119^- que eran indispensables para el desarrollo del injerto: una población de células CD31⁺CD105⁺MAdCAM-1⁺ de tipo endotelial y una población de células mesenquimales PDGFRβ⁺ más ampliamente definida⁸.

La construcción de injertos a partir de células del bazo varía en términos de materiales de soporte y procesos de carga celular. Los bazos de ingeniería tisular se han preparado previamente cargando unidades esplénicas en un andamio de polímero de ácido poliglicólico/ácido láctico^{poli-L 5,9}. Curiosamente, las células estromales del bazo absorbidas en una esponja de colágeno no lograron injertarse, mientras que las células estromales agregadas y cargadas sobre una lámina de colágeno facilitaron la regeneración del bazo⁸. También se ha demostrado que la resuspensión de células estromales del bazo dentro de una matriz de Matrigel induce la agregación celular en condiciones de cultivo tridimensionales¹⁰. Sin embargo, este método no se ha probado para su uso en modelos de trasplante. El objetivo general del protocolo actual es agregar y encapsular a la fuerza células estromales del bazo directamente dentro de la matriz de la membrana basal, que posteriormente pueden transferirse a un sistema de cultivo de tejidos in vitro tridimensional o utilizarse como vehículo para trasplantes de modelos animales (Figura suplementaria 1).

Protocol

Todos los procedimientos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con los protocolos experimentales aprobados por el Comité de Ética Animal de la Universidad de Queensland (UQBR/079/19).

1. Recolección de tejidos y preparación de células estromales

1. Eutanasia de ratones donantes neonatos BALB/c machos y/o hembras de 0,5 días de edad mediante la inducción de la hipotermia envolviendo a los animales dentro del papel de seda y colocándolos bajo hielo picado durante >10 min.
   NOTA: Este protocolo se puede adaptar a diferentes cepas de ratones, edades y número de animales.
2. Prepare instrumentos quirúrgicos estériles.
3. Coloque el ratón en una posición lateral derecha. Frotar la piel con etanol al 80% y hacer una incisión de 1 cm con unas tijeras quirúrgicas Iris para exponer la pared peritoneal.
4. Haga una segunda incisión de 0,5 cm por encima del bazo y use un par de pinzas finas para levantar suavemente el tejido. Use un par de tijeras quirúrgicas para cortar los vasos sanguíneos y extirpar el tejido. Transfiera el tejido a una placa de Petri que contenga solución salina tamponada con fosfato (PBS) helada. Extirpe cualquier resto de tejido conectivo adherido al bazo.
   NOTA: Un microscopio estereoscópico puede ayudar a los movimientos motores finos necesarios para manipular instrumentos quirúrgicos.
5. Para disociar tejidos enteros, transfiera el bazo neonatal (grupos de 10 o menos) al borde interno de un tapón de tubo cónico invertido de 14 ml. Altere mecánicamente los tejidos con un movimiento de presión utilizando el extremo posterior de plástico de un émbolo de jeringa de 1 ml.
6. Coloque y asegure la tapa firmemente sobre un tubo cónico de 14 ml que contenga 10 ml de PBS frío. Invierta el tubo 5 veces para lavar todo el tejido alterado de la tapa hacia el tubo.
7. Repita el paso 1.6 para cualquier tejido restante.
8. Deje la sonda en hielo durante 1 minuto para que el tejido se asiente en el fondo de la sonda.
9. Deseche cuidadosamente el sobrenadante (que contiene células hematopoyéticas) pasando la solución a través de un filtro celular reversible de 70 μm.
10. Recupere la fracción estromal no soluble invirtiendo el filtro y lavando el tejido estromal de nuevo en el tubo cónico de 14 ml utilizando 2 ml recién preparados de medio Eagle modificado de Dulbecco (sDMEM) suplementado que contiene 1 mg/ml de colagenasa IV, 40 μg/ml de DNasa I y 2% de suero fetal bovino (FBS).
    PRECAUCIÓN: La colagenasa IV y la colagenasa D son sustancias peligrosas y deben manipularse dentro de un gabinete de bioseguridad con el equipo de protección personal adecuado.
11. Para preparar una suspensión unicelular, digiera enzimáticamente el tejido agrupado (hasta 20) durante 10 min a 37 °C con rotación constante.
12. Añadir 4 ml de sDMEM recién preparado que contenga 1 mg/ml de colagenasa D, 40 μg/ml de DNasa I y 2 % de FBS directamente al tubo que contiene el tejido estromal. Incubar durante 10 minutos más a 37 °C con rotación constante.
13. Detenga la digestión agregando 8 ml de PBS helado. Recoja las células centrifugando a 200 x g durante 5 min a 4 °C.
14. Deseche el sobrenadante y lave las células dos veces resuspendiéndolas en 1 ml de PBS frío y centrifugando a 200 x g durante 5 min a 4 °C. Mantenga las células en hielo.
    NOTA: Las células se pueden contar y ajustar a la concentración deseada. Esto puede requerir optimización para diferentes poblaciones celulares. Con este protocolo, normalmente se recuperan 0,5 x 10⁶- 1 x 10⁶ células estromales o bazo, dependiendo de la edad de los ratones donantes. Opcionalmente, las células se pueden teñir y clasificar FACS en esta etapa para definir la composición celular.

2. Encapsulación matricial de agregados celulares

1. Enfríe previamente las puntas de pipeta P200 estériles dentro de un congelador a -20 °C.
2. Corte una película flexible de laboratorio (por ejemplo, Parafilm) en trozos de 1 cm x 2 cm y esterilícela sumergiéndola en etanol al 80% durante 10 minutos, seguido de PBS durante 10 minutos. La película de laboratorio puede prepararse con antelación y almacenarse estéril.
3. Preparar 0,5 x 10 6-2,5 x 10⁶ celdas centrifugando a 200 x g durante 5 min a 4 °C. Aspire cuidadosamente el sobrenadante, dejando aproximadamente 20 μL del volumen restante de PBS. Mantenga el gránulo de la celda en hielo.
   NOTA: El PBS restante se puede aspirar suavemente sin alterar el gránulo de la celda para confirmar el volumen.
4. Aspire 2 μL de matriz de membrana basal helada en una punta de pipeta P200 preenfriada, utilizando una pipeta P20.
   NOTA: Una matriz de membrana basal altamente concentrada (por ejemplo, matriz de Corning Matrigel de alta concentración) ayuda a formar un tapón solidificado fuerte.
5. Gire suavemente para expulsar la punta de la pipeta. Estire una tira preesterilizada de la película de laboratorio y colóquela sobre el extremo de la punta de la pipeta, teniendo cuidado de no perforar la película. Continúe envolviendo la punta en la película para sellar la punta de la pipeta. Coloque con cuidado la punta sellada directamente sobre hielo, teniendo cuidado de no romper la película.
6. Vuelva a suspender el gránulo celular en el PBS restante y coloque la solución suavemente sobre la matriz de la membrana basal. Mantén la construcción en hielo.
7. Prepare un tubo de centrifugación colocando un tubo de racimo de 1,2 ml dentro de un tubo cónico de 14 ml.
8. Coloque la punta de la pipeta dentro de la configuración del tubo anidado y centrifugue a 400 x g y 4 °C durante 5 min.
9. Coloque el tubo cónico de 14 ml en orientación vertical e incube a 37 °C durante 15 min para permitir que la matriz de la membrana basal se solidifique dentro de la punta de la pipeta.
   NOTA: El tubo cónico de 14 ml se puede colocar en hielo hasta que sea necesario para la aplicación posterior.

3. Cultivo tridimensional de organoides

1. Retire con cuidado la película de laboratorio de la punta de la pipeta.
2. Inserte un émbolo de alambre fino de acero inoxidable a través de la abertura más grande de la punta de la pipeta.
3. Expulse el tapón de matriz hasta que se libere a través de la punta en un pocillo de una placa de cultivo de tejidos de 6 pocillos no tratada que contenga 2 ml de sDMEM suplementado con 10% de FBS, 1x Glutamax, 1x aminoácidos no esenciales (NEAA), 10 μM de inhibidor de roca, 10 U/mL de penicilina/estreptomicina y 50 μM de β-mercaptoetanol.
   NOTA: El recipiente de cultivo de tejidos y el volumen de medio correspondiente se pueden ajustar según sea necesario.
   PRECAUCIÓN: La NEAA, la penicilina/estreptomicina y el β-mercaptoetanol son sustancias peligrosas y deben manipularse dentro de un gabinete de bioseguridad con el equipo de protección personal adecuado.
4. Cultivar organoides a 37 °C, 5% de CO₂ y 95% de humedad durante 4-12 semanas.
5. Reemplace la mitad del medio cada 5 días.
   NOTA: Si los organoides comienzan a adherirse a la placa de cultivo de tejidos, transfiéralos a un pocillo nuevo.

4. Trasplante de cápsula renal

1. Prepare instrumentos quirúrgicos estériles.
2. Realizar un trasplante renal subcapsular del tapón de la matriz de la membrana basal:
   1. Anestesiar a ratones receptores hembra BALB/c de 8 semanas de edad con isoflurano siguiendo las Pautas Institucionales de Ética Animal.
      PRECAUCIÓN: El isoflurano es una sustancia peligrosa. Los gases residuales deben eliminarse para evitar la entrada en el entorno del espacio de trabajo.
   2. Coloque el ratón en una posición lateral derecha.
   3. Afeitar el vello del sitio de la cirugía y desinfectar la piel siguiendo las Pautas Institucionales.
      NOTA: Se recomienda desinfectar el sitio quirúrgico tres veces con movimientos circulares alternando exfoliante a base de yodo o clorhexidina y a base de alcohol.
   4. Realizar una incisión de 2 cm en la piel perpendicular a la columna vertebral para exponer la pared peritoneal.
      NOTA: Se pueden usar tijeras quirúrgicas finas o una hoja de bisturí para la incisión en la piel. Los usuarios deben seguir las Pautas Institucionales de Ética Animal o los Procedimientos Operativos Estándar.
   5. Haga una incisión más pequeña de 0,5 cm en la pared peritoneal por encima del riñón.
      NOTA: La incisión debe aproximarse al ancho del riñón para asegurar que el riñón permanezca exteriorizado durante el trasplante.
   6. Exteriorizar el riñón a través de la abertura peritoneal aplicando presión hacia abajo con el pulgar y el índice. Se puede usar un par de pinzas de anillo para ayudar a la exteriorización. Asegúrese de que el riñón esté húmedo durante todo el procedimiento aplicando regularmente PBS estéril con un hisopo de algodón.
   7. Bajo un microscopio estereoscópico, pellizque la grasa perirrenal de la cápsula renal con un par de pinzas ultrafinas dobladas en un polo del riñón. Use un segundo par de pinzas ultrafinas dobladas para rasgar suavemente la membrana de la cápsula renal hacia arriba en una dirección opuesta, creando una pequeña abertura.
   8. Inserte con cuidado la punta de una pinza debajo de la membrana de la cápsula. Use un movimiento de barrido lento para separar la membrana de la cápsula del parénquima renal.
   9. Prepare el tapón de la matriz de la membrana basal para el trasplante retirando la película de laboratorio de la punta de la pipeta.
   10. Levante la cápsula renal con una punta de la pinza e inserte la punta de la pipeta a través de la abertura, empujándola hacia el polo opuesto del riñón.
   11. Inserte un émbolo de alambre en la punta de la pipeta y expulse el tapón de la matriz mientras retira simultáneamente la punta de la pipeta del riñón.
   12. Humedecer el riñón con PBS y volver a internalizarlo.
   13. Cerrar la pared peritoneal con una sutura 5-0 Vicryl y cerrar la piel con dos autoclips.
   14. Administrar analgésico (Buprenorfina a 0,05-0,1 mg/kg por vía subcutánea o siguiendo las Guías Institucionales de Ética Animal).
       PRECAUCIÓN: La buprenorfina es una sustancia peligrosa y debe manipularse con el equipo de protección personal adecuado.
3. Cierre el flujo de isoflurano, pero mantenga el flujo de oxígeno encendido para permitir que el ratón respire oxígeno puro hasta que comience a recuperar la conciencia.
4. Regresa el ratón a su jaula. Mantenga al animal caliente durante la recuperación colocando parcialmente la jaula encima de una almohadilla térmica o debajo de una lámpara de calor, y controle hasta que el ratón se recupere completamente de la anestesia.
5. Monitorear la recuperación postquirúrgica durante las primeras dos semanas o según lo requieran las Pautas Institucionales.

Results

La agregación celular es importante para promover el contacto y la señalización de célula a célula. El encerramiento de los agregados celulares dentro de la matriz de la membrana basal apoyó ambos cultivos tridimensionales para la formación de organoides tisulares in vitro y facilitó la entrega mecánica de células en la cápsula renal para el trasplante de injerto. Para establecer estas construcciones, la matriz de la membrana basal se mantuvo primero en un estado fluídico en condiciones heladas. Posteriormente, la agregación celular se logró colocando una suspensión celular concentrada en capas y utilizando la fuerza centrífuga para empujar las células a través de la matriz de alta densidad. Se requirió la optimización de la velocidad de centrifugación (200-2000 x g) para lograr un posicionamiento de la célula de la capa media (Figura 1A), que también dependía del número de células. Las fuerzas centrífugas más altas (>500 x g) impulsaron las células hasta la punta de la pipeta (Figura 1B), y se requiere precaución para los números de células más pequeños (es decir, <5 x 10⁵) que pueden perderse durante la extracción de la cubierta de película flexible de laboratorio. Por el contrario, es posible que las células no viajen adecuadamente a través de la matriz de la membrana basal si las fuerzas G son demasiado bajas (≤200 x g) (Figura 1C). Es posible que la velocidad de centrifugación para números de celda <1 x 10⁵ o >2,5 x 10⁶ necesite una mayor optimización. Después de la centrifugación, las células se colocaron dentro de la matriz de la membrana basal calentando la construcción a 37 °C durante 15 min. Este proceso de solidificación permitió que el "tapón" de la matriz se expulsara por completo (Figura 1D) utilizando un émbolo de alambre delgado.

Formación in vitro de organoides de bazo
Los tapones de la matriz de la membrana basal expulsados en un recipiente de cultivo de tejidos apropiado formaron de forma reproducible estructuras tridimensionales similares a organoides que pudieron mantenerse siguiendo las técnicas y condiciones estándar de cultivo de tejidos (37 °C, 5% CO₂, 95% de humedad)¹¹. En cultivo, el sustrato de la matriz de la membrana basal de soporte se disipó gradualmente entre los días 0 y 14 (Figura 2A, i-iii) y ya no se pudo observar en el día 21, dejando una masa celular esférica intacta similar a un organoide (Figura 2A, vi) que mide aproximadamente 545 μm (DE = 120 μm, n = 6)¹¹ de diámetro. Estas estructuras organoides se mantuvieron en cultivo más allá de los 30 días, pero no aumentaron de tamaño con el tiempo (Figura 2B). Los organoides del bazo estaban compuestos por células linfoides CD45-TER-119-estromal, CD45-TER-119⁺ eritrocitos y CD45⁺TER-119- linfoides^, sin embargo, la frecuencia de cada población fue variable entre los organoides individuales (n = 4; Tabla 1). Para evaluar la estructura general de los organoides del bazo, se prepararon y visualizaron criosecciones de tejido de 50 μm de espesor. Los organoides estaban formados por una estructura no hueca, con células presentes en todo el diámetro del tejido (Figura 2D). La evaluación de las secciones de organoides con un espesor de capa de una sola célula de 7 μm reveló que las células estaban dispuestas en estructuras similares a cordones sin una orientación espacial clara (Figura 2D), con áreas vacías de núcleos entre cadenas de células. La tinción del anticuerpo CD45 verificó la presencia de células hematopoyéticas nucleadas que rodeaban densamente las regiones periféricas del organoide (Figura 2E). Además, se observaron células CD45⁺ de morfología distinta en forma de huso en regiones organoides más centrales. La ausencia general de tinción de anticuerpos CD90.2 (células T) y CD19 (células B), pero la tinción positiva de CD11b, demostró la presencia específica de células mieloides (Figura 2F). También se detectaron células endoteliales CD105⁺ y CD31⁺ no hematopoyéticas en múltiples organoides¹¹.

Trasplante de injerto de bazo in vivo
La encapsulación de células estromales agregadas del bazo dentro de una matriz semisólida facilita los estudios de trasplante animal. Esta técnica se utilizó para incrustar preparaciones de células estromales neonatales no fraccionadas o clasificadas por CD45-TER-119-FACS dentro de un tapón de matriz de membrana basal, que sirve como vehículo para el trasplante debajo de la cápsula de riñón de ratón. De acuerdo con protocolos similares de agregación celular⁸, las construcciones celulares encapsuladas en matriz de membrana basal (MECC) regeneraron con éxito el tejido del bazo en 4/5 trasplantes de animales independientes, confirmando así la viabilidad de esta técnica de construcción de injertos. Para probar la utilidad de los MECC en la definición de los tipos celulares necesarios para la regeneración del bazo, se construyeron injertos de MECC a partir de células del bazo neonatal que estaban específicamente deplecionadas de células estromales PDGFRβ⁺MAdCAM-1⁺ o PDGFRβ⁺MAdCAM-1^- (CD45^-)¹¹. Los injertos que carecían de células PDGFRβ⁺MAdCAM-1⁺ conservaron la capacidad de regeneración tisular macroscópica (4/4 injertos; Figura 3A) ¹¹. Tres de cada cuatro tejidos regenerados exhibieron una composición y estructura normal de las células del bazo, mostrando arteriolas centrales, folículos de pulpa blanca, compartimentos segregados de células T y B, células dendríticas foliculares, células reticulares de la zona marginal y macrófagos metalófilos marginales, sinusoides de pulpa roja, células mieloides y macrófagos (Figura 3B)¹¹. Por el contrario, los injertos que carecían de células PDGFRβ⁺MAdCAM-1^- no lograron regenerar el tejido del bazo (1/4 de los injertos)¹¹. Estos datos respaldan la importancia de las células PDGFRβ⁺ derivadas del injerto en la regeneración del tejido del bazo⁸, y señalan un requisito específico para las ^{células estromales} PDGFRβ⁺MAdCAM-1-.

Figura 1. Encapsulación de la matriz de la membrana basal de células estromales agregadas del bazo. Se utiliza una punta de pipeta de 200 μL para facilitar la agregación celular dentro de una matriz de membrana basal. En primer lugar, se establece una capa de matriz fluídica aspirando 2 μL de matriz de membrana basal helada en una punta de pipeta preenfriada. Se deposita una suspensión celular por encima de la capa de la matriz y se aplica una fuerza centrífuga para movilizar y agregar células dentro de la matriz de la membrana basal. (A) Los ajustes de la velocidad de la centrífuga están optimizados para colocar los agregados celulares a mitad de camino a lo largo de la capa de la matriz. (B) Una velocidad centrífuga excesiva da como resultado células que se agregan al final de la pipeta. (C) La velocidad insuficiente impide el movimiento de la célula a través de la matriz. (D) Se expulsa un tapón de matriz semisólida de la punta de la pipeta después de la incubación a 37 °C durante 15 minutos. Las puntas de flecha indican la ubicación de los agregados de celdas dentro de la matriz. Barra de escala, 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2. Cultivo in vitro de agregados de bazo encapsulados en matriz de membrana basal y formación de estructuras organoides tridimensionales. (A) Desarrollo de organoides del bazo durante un curso de 35 días. Los paneles (i-vi) corresponden a los días 0, 7, 14, 21, 28 y 35 en cultura. Las imágenes se capturaron con un microscopio de contraste de fase invertida Nikon TS2. Barra de escamas, 500 μm. (B) Diámetro del organoide del bazo durante períodos de cultivo prolongados. Cada línea representa un organoide individual. (C) Caracterización por citometría de flujo de poblaciones de células estromales (CD45-TER-119^-), linfoides (CD45⁺TER-119^-) y eritroides (CD45-TER-119⁺) después de 53 días en cultivo. Panel superior: Tejido de control preparado a partir del estroma del bazo neonatal. Panel inferior: Organoide del bazo, día 52. (D) Morfología macroscópica del tejido organoide a 50 μm (paneles superiores) y 7 μm (paneles inferiores) de espesor de sección después de 22 días en cultivo. (E) Localización y morfología de las células hematopoyéticas CD45⁺ después de 34 días en cultivo. La región ampliada se muestra en los paneles de la derecha. Las secciones son de 7 μm. (F) Evaluación de células mieloides (CD11b), T (CD90.2) y B (CD19) después de 34 días en cultivo. La región ampliada se muestra en el recuadro. Las secciones son de 7 μm. Las imágenes se capturaron con un microscopio de células vivas Nikon Eclipse Ti2-E. Barras de escala (D, E, F), 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3. Análisis de tejido de injerto en matriz de membrana basal. Los injertos se construyeron a partir del estroma del bazo neonatal deplecionado de células PDGFRβ⁺MAdCAM-1⁺ (n = 4). Datos adicionales disponibles en línea¹¹. (A) Aspecto macroscópico de un injerto de bazo regenerado a las 4 semanas después del trasplante debajo de la cápsula renal. El área amarilla en forma de recuadro indica tejido del bazo regenerado. La imagen fue capturada con un microscopio estereoscópico Leica M60 equipado con un adaptador de zoom Snap y un iPhone 6S de Apple. Barra de escala, 1000 μm. (B) Imágenes compuestas de inmunofluorescencia multicolor de tejidos de injerto de 30 μm de espesor crioseccionados en el plano coronal. La tinción de anticuerpos se realizó con los marcadores indicados para visualizar la microarquitectura del tejido del bazo. Las imágenes se capturaron con un microscopio de células vivas Nikon Eclipse Ti2-E. Las áreas en cuadro muestran las regiones de mayor aumento. Barra de escala, 1000 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Organoide No.	Células estromales	Eritrocitos	Linfocitos
1	62	7.7	31
2	22	24	55
3	3.6	0.1	96
4	10	76	12

Tabla 1. Porcentaje de poblaciones de células estromales, eritroides y linfoides entre los organoides individuales del bazo.

Figura complementaria 1. Resumen esquemático del protocolo en el que se destacan los principales pasos en la generación de construcciones celulares integradas en matriz para estudios in vitro e in vivo . Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discussion

La agregación de células neonatales del bazo dentro de un medio semisólido representa un método viable para generar construcciones de bazo. Se han utilizado protocolos similares basados en matrices de membrana basal para iniciar cultivos tridimensionales de bazo¹⁰. Aquí, demostramos que las construcciones de bazo son igualmente susceptibles a los sistemas de cultivo de organoides in vitro , así como a los modelos de trasplante in vivo . Cabe destacar que el trasplante de organoides de bazo cultivados in vitro aún no se ha probado, pero sería de interés determinar la capacidad de regeneración total o parcial del tejido del bazo. Este protocolo también hereda las técnicas de agregación celular descritas en estudios previos de trasplante de bazo⁸. Estos estudios involucraron la carga de agregados celulares sobre una lámina de colágeno seguida de un trasplante debajo de la cápsula renal. El encapsulamiento de los agregados celulares dentro de la matriz de la membrana basal ofrece una clara ventaja en términos de orientación del injerto, donde se elimina la variación asociada con el trasplante de colágeno con el lado de la hoja hacia abajo frente al trasplante con el lado del agregado celular hacia abajo.

La metodología para preparar construcciones de matrices de membrana basal es relativamente sencilla. El uso de una matriz de membrana basal de alta concentración garantiza que las células se apoyen inicialmente en un estado agregado, antes de que la matriz se disipe durante varios días. En nuestra experiencia, la mezcla y dilución de la matriz de la membrana basal es mínima después de una cuidadosa estratificación (Paso 2.6) y centrifugación (Paso 2.8) de una solución celular suspendida con PBS. La mayoría de las optimizaciones se centran en el posicionamiento del gránulo de celda dentro del tapón de matriz (Figura 1). Esto se puede abordar probando varias variables, como la velocidad de centrifugación, el tiempo, la composición del volumen de la matriz de la membrana basal, el volumen de la solución celular suspendida en PBS y el tamaño de la punta de la pipeta. El número y las características de las células (tamaño, densidad) también pueden influir en los ajustes, y la preparación de cada célula debe optimizarse individualmente.

Es importante destacar varias limitaciones. La matriz de membrana basal puede ser un producto sensible a la temperatura, y se debe tener cuidado de trabajar rápido para mantener fríos los reactivos. Esto evita la solidificación prematura de la matriz y asegura una encapsulación adecuada de las células. Si bien todos los materiales relevantes se almacenan, preparan o mantienen en un entorno frío, los pasos de manipulación manual (p. ej., expulsión de la punta de pipeta, sellado con película flexible de laboratorio [Paso 2.5]) pueden introducir calor externo del usuario de forma variable, cambiando la viscosidad de la matriz e influyendo en las características de migración celular durante la centrifugación. Por lo tanto, la reproducibilidad dentro de los experimentos y entre ellos puede ser difícil de lograr de manera consistente.

La segunda limitación es el requisito de experiencia y competencia del usuario. Ciertas técnicas manuales pueden requerir un entrenamiento prolongado para realizarlas de manera eficiente y exitosa. Por ejemplo, el sellado de la punta de pipeta con film de laboratorio (paso 2.5) puede dar lugar inicialmente a bajas tasas de éxito, pero esto mejorará inevitablemente con la práctica. La competencia con las técnicas microquirúrgicas animales también se obtiene a través de la repetición. En el caso de los trasplantes, se debe tener cuidado, especialmente al insertar la punta de la pipeta debajo de la cápsula renal (Paso 4.2.10), insertar el émbolo de alambre para expulsar el tapón (Paso 4.2.11) y retirar la punta del riñón. Es importante que el tapón se expulse de forma suave y constante mientras se retira simultáneamente la punta de la pipeta. El movimiento excesivo puede provocar la perforación de la cápsula renal o el daño del parénquima, lo que provoca un sangrado excesivo.

En resumen, aquí se ha descrito un proceso para encapsular células dentro de una matriz semisólida con un enfoque en la comprensión de la formación del tejido del bazo. Este sistema también podría aplicarse a una amplia gama de tipos de células con el potencial de múltiples aplicaciones posteriores in vitro o in vivo .

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tubos de polipropileno de 96 pocillos 1,2 mL	Corning	CLS4401	Para colocar dentro de un tubo cónico de 14 ml
B-mercaptoetanol	Gibco 21985023		Stock 55 mM, usar a 50 uM
Colagenasa D	Roche	11088858001
Colagenasa IV	Sigma-Aldrich	C5138	De Clostridium histolyticum
Desoxirribonucleasa I (DNasa I)	Sigma-Aldrich	D4513	Desoxirribonucleasa I de páncreas bovino, Tipo II-S, polvo liofilizado, Proteína ≥ 80 %, ≥ 2.000 unidades/mg de proteína
Dulbecco' s Águila Modificada' s Medio (DMEM)	Sigma-Aldrich	D5796	4500 mg/L de glucosa, L-glutamina y bicarbonato de sodio, sin piruvato de sodio, líquido. Filtrado estéril.
Solución salina tamponada con fosfato (PBS) de DulbeccoSigma-Aldrich		D8537	Sin cloruro de calcio y cloruro de magnesio, Eclipse
200 &mu filtrada estérilmente; l Puntas de pipeta	Labcon	1030-260-000
Suero fetal bovino de punta biselada (FBS)	Gibco	26140-079	Lote # 1382243
GlutaMAX	Gibco		35050061 Stock 100X, uso en 1X
Matrigel	Corning	354263	Membrana basal de matriz Matrigel Alta concentración, lote # 7330186
MEM Aminoácidos no esenciales	Gibco	11140076	Stock 100X, uso en 1X
Penicilina/Estreptomicina	Gibco	15140122	Stock 10.000 unidades/ml Penicilina, 10.000 ug/ml Estreptomicina
Colador de células reversible	STEMCELL Technologies	27216	70 μ m
Pinzas de anillo	NAPOX	A-26	Tamaño del anillo: 3 mm
Inhibidor de rocas (Y-27632)	MedChemExpres	HY-10071
Centrífuga Thermofisher Heraeus Megafuge 40R	velocidades de aceleración y desaceleración de Thermofisher
pinzas ultrafinas	EMS	78340-51S	Estilo 51S. Las pinzas de acero austenítico con bajo contenido de carbono SA antimagnéticas/antiácidas son resistentes a la corrosión. Acabado satinado antirreflejo.
Vicryl 5/0 Sutura Ligapak Carrete	Ethicon	J283G
Wiretrol II Émbolo de Alambre Largo	Drummond	5-000-2002-L	Émbolo de Acero Inoxidable, 25 & 50 μ L/WRTL II, Largo
Aplicador de pinzas para heridas	MikRon	427630
Pinzas para heridas	MikRon	427631	9 mm