Agregación celular encapsulada en matriz de membrana basal para investigar la formación de tejido del bazo murino

Resumen

Este artículo describe un protocolo para agregar y encapsular células del bazo dentro de una matriz semisólida de membrana basal. Las construcciones de matriz de membrana basal se pueden utilizar en cultivos tridimensionales para estudiar el desarrollo de organoides, o para estudios de trasplante in vivo y regeneración de tejidos.

Resumen

El bazo es un órgano inmunitario que desempeña un papel clave en las respuestas inmunitarias transmitidas por la sangre. La pérdida anatómica o funcional de este tejido aumenta la susceptibilidad a infecciones sanguíneas graves y sepsis. El autotrasplante de cortes de bazo se ha utilizado clínicamente para reemplazar el tejido perdido y restaurar la función inmunitaria. Sin embargo, el mecanismo que impulsa la regeneración robusta e inmunológicamente funcional del tejido del bazo no se ha dilucidado por completo. Aquí, nuestro objetivo es desarrollar un método para agregar y encapsular células del bazo dentro de una matriz semisólida con el fin de investigar los requisitos celulares para la formación de tejido del bazo. Las construcciones celulares encapsuladas en la matriz de la membrana basal son susceptibles tanto para el cultivo in vitro de organoides tridimensionales como para el trasplante bajo la cápsula renal para evaluar directamente la formación de tejido in vivo . Mediante la manipulación de las células de entrada para la agregación y encapsulación, demostramos que las células estromales neonatales derivadas del injerto PDGFRβ⁺MAdCAM-1^- son necesarias para la regeneración del tejido del bazo en modelos de trasplante animal.

Introducción

La rotura traumática del bazo y la aparición de múltiples nódulos esplénicos en el cuerpo fue uno de los primeros indicios de que el tejido del bazo albergaba capacidad regenerativa ^1,2. Posteriormente, se introdujeron en la clínica los autotrasplantes de bazo para preservar el tejido del bazo en pacientes que requerían esplenectomía de urgencia³. Sin embargo, a pesar de ser parte de la práctica clínica durante décadas, se sabe muy poco sobre cómo se regenera el bazo. Los modelos de trasplante animal han proporcionado información sobre múltiples parámetros de la regeneración del bazo y ....

Protocolo

Todos los procedimientos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con los protocolos experimentales aprobados por el Comité de Ética Animal de la Universidad de Queensland (UQBR/079/19).

1. Recolección de tejidos y preparación de células estromales

1. Eutanasia de ratones donantes neonatos BALB/c machos y/o hembras de 0,5 días de edad mediante la inducción de la hipotermia envolviendo a los animales dentro del papel de seda y colocándolos bajo hielo picado durante >10 min.
   NOTA: Este protocolo se puede adaptar a diferentes cepas de ratones, edades y número de animales.
2. Prepare instrumentos quirúrgicos ....

Resultados

La agregación celular es importante para promover el contacto y la señalización de célula a célula. El encerramiento de los agregados celulares dentro de la matriz de la membrana basal apoyó ambos cultivos tridimensionales para la formación de organoides tisulares in vitro y facilitó la entrega mecánica de células en la cápsula renal para el trasplante de injerto. Para establecer estas construcciones, la matriz de la membrana basal se mantuvo primero en un estado fluídico en condiciones heladas. Posteriormente, .......

Discusión

La agregación de células neonatales del bazo dentro de un medio semisólido representa un método viable para generar construcciones de bazo. Se han utilizado protocolos similares basados en matrices de membrana basal para iniciar cultivos tridimensionales de bazo¹⁰. Aquí, demostramos que las construcciones de bazo son igualmente susceptibles a los sistemas de cultivo de organoides in vitro , así como a los modelos de trasplante in vivo . Cabe destacar que el trasplante de organoid.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tubos de polipropileno de 96 pocillos 1,2 mL	Corning	CLS4401	Para colocar dentro de un tubo cónico de 14 ml
B-mercaptoetanol	Gibco 21985023		Stock 55 mM, usar a 50 uM
Colagenasa D	Roche	11088858001
Colagenasa IV	Sigma-Aldrich	C5138	De Clostridium histolyticum
Desoxirribonucleasa I (DNasa I)	Sigma-Aldrich	D4513	Desoxirribonucleasa I de páncreas bovino, Tipo II-S, polvo liofilizado, Proteína ≥ 80 %, ≥ 2.000 unidades/mg de proteína
Dulbecco' s Águila Modificada' s Medio (DMEM)	Sigma-Aldrich	D5796	4500 mg/L de glucosa, L-glutamina y bicarbonato de sodio, sin piruvato de sodio, líquido. Filtrado estéril.
Solución salina tamponada con fosfato (PBS) de DulbeccoSigma-Aldrich		D8537	Sin cloruro de calcio y cloruro de magnesio, Eclipse
200 &mu filtrada estérilmente; l Puntas de pipeta	Labcon	1030-260-000
Suero fetal bovino de punta biselada (FBS)	Gibco	26140-079	Lote # 1382243
GlutaMAX	Gibco		35050061 Stock 100X, uso en 1X
Matrigel	Corning	354263	Membrana basal de matriz Matrigel Alta concentración, lote # 7330186
MEM Aminoácidos no esenciales	Gibco	11140076	Stock 100X, uso en 1X
Penicilina/Estreptomicina	Gibco	15140122	Stock 10.000 unidades/ml Penicilina, 10.000 ug/ml Estreptomicina
Colador de células reversible	STEMCELL Technologies	27216	70 μ m
Pinzas de anillo	NAPOX	A-26	Tamaño del anillo: 3 mm
Inhibidor de rocas (Y-27632)	MedChemExpres	HY-10071
Centrífuga Thermofisher Heraeus Megafuge 40R	velocidades de aceleración y desaceleración de Thermofisher
pinzas ultrafinas	EMS	78340-51S	Estilo 51S. Las pinzas de acero austenítico con bajo contenido de carbono SA antimagnéticas/antiácidas son resistentes a la corrosión. Acabado satinado antirreflejo.
Vicryl 5/0 Sutura Ligapak Carrete	Ethicon	J283G
Wiretrol II Émbolo de Alambre Largo	Drummond	5-000-2002-L	Émbolo de Acero Inoxidable, 25 & 50 μ L/WRTL II, Largo
Aplicador de pinzas para heridas	MikRon	427630
Pinzas para heridas	MikRon	427631	9 mm

Las se ajustaron a 8