Este artículo describe un protocolo para la recogida y detección de miR-15a a partir de desgarros como nueva herramienta diagnóstica para la retinopatía diabética.
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MiR-15a exosomal derivado de la lágrima como nueva herramienta diagnóstica para la retinopatía diabética
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Resumen
Resumen
La retinopatía diabética (RD) es una complicación importante de la diabetes mellitus que afecta a un porcentaje significativo de la población diabética. El diagnóstico y la intervención precoz son fundamentales para prevenir la pérdida irreversible de la visión. Los métodos diagnósticos actuales, aunque efectivos, tienen limitaciones. El miARN, un pequeño ARN no codificante que inhibe la estabilidad y/o la traducción de un ARNm al unirse a las regiones no traducidas 3' (3'-UTRs) de los ARNm objetivo, se ha reconocido cada vez más como significativamente asociado con la diabetes y puede obtenerse a partir de desgarros. Este estudio investigó el potencial del miR-15a exosomal derivado del líquido lacrimal como un novedoso marcador diagnóstico para la DR. Se obtuvieron muestras de lágrimas de 135 pacientes diabéticos (36 con retinopatía diabética [DR] y 50 sin DR) y 49 controles sanos. Se aislaron los exosomas y se midieron los niveles de expresión de miR-15a exosomal mediante PCR digital de gotas (ddPCR). Los resultados mostraron que la expresión exósoma de miR-15a se vio alterada en pacientes diabéticos y con DR en comparación con individuos sanos. Estos hallazgos indican que el miR-15a exosomal derivado del líquido lacrimal podría desempeñar un papel en los mecanismos moleculares subyacentes a la diabetes y sus complicaciones. Además, tiene potencial como biomarcador diagnóstico no invasivo y fiable para la retinopatía diabética, ofreciendo alta sensibilidad y especificidad.
Introducción
La retinopatía diabética (RD) es una de las complicaciones microvasculares más destacadas de la diabetes, que amenaza la visión de millones de personas en todo el mundo. La prevalencia global de DR según los datos poblacionales del IDP Atlas 2019 se estimó en un 22,7% de toda la población diabética a nivel mundial, con el número de nuevos casos en continuo aumento, especialmente en países desarrollados yen desarrollo. Clínicamente, la RD se caracteriza por una RD en fase temprana o retinopatía diabética no proliferativa (NPDR), RD en fase avanzada o retinopatía diabética proliferativa (RDP), y la presencia de edema macular. El aumento de la permeabilidad vascular y la obstrucción capilar son dos cambios patológicos comunes observados en la NPDR, y en el caso de la PDR 2,3 se observa una neovascularización anormal del iris, la mácula, el disco óptico o la retina. La progresión hacia la RDP, que podría provocar hemorragia vítrea y desprendimiento de retina, puede causar un deterioro visualsignificativo 3. En todos los casos, los cambios patológicos pueden detectarse mediante funduscopia o exploración fotográfica del fondo de ojo por parte de oftalmólogosformados. Utilizando el método estándar de fotografía de fondo de ojo, la retinopatía diabética puede detectarse con una sensibilidad del 78%-96% y una especificidad del 86%-97% 5. Sin embargo, este método solo detecta una vez que se ha producido daño en la retina. Existe una necesidad no satisfecha de detección precoz de la DR antes del inicio de signos retinianos clínicamente visibles, como hemorragias retinianas por blot, microaneurismas, exudados y proliferación de nuevos vasos.
El avance de las herramientas moleculares llevó al descubrimiento de los exosomas como una herramienta diagnóstica potencial para diversas enfermedades, incluyendo el cáncer y las enfermedadescardiovasculares 6,7. Los exosomas son partículas de tamaño nanométrico unidas por una membrana bicapa lipídica secretadas por la mayoría de las células en su espacio de vesícula extracelular (EV). Estos exosomas pueden ser transportados por biofluidos como sangre, lágrimas, saliva y orina, lo que los hace fácilmente accesibles para procedimientos diagnósticos no invasivos o mínimamenteinvasivos. Transportan diversos marcadores celulares de origen que incluyen proteínas, lípidos y ácidos nucleicos. De especial interés son los pequeños ARN no codificantes transportados dentro de los EVs. Aunque estos ARN no están codificados para proteínas, desempeñan papeles fundamentales en la regulación génica y han estado implicados en muchos procesos fisiológicos y patológicos, incluyendo las células β pancreáticas, que son muy importantes en el desarrollo de la diabetes 9,10.
Concretamente, se ha demostrado que miR-15a tiene una fuerte asociación con el desarrollo de la diabetes, principalmente a través de la regulación de la producción de insulina y las funciones de las células betapancreáticas. Nuestro grupo ha demostrado recientemente que miR-15a está alterado en el plasma de la retinopatía diabética. Además, también se demostró que la miR-15a es secretada por las células beta pancreáticas, y viaja a través del torrente sanguíneo hasta laretina 12. El líquido lacrimal se considera un fluido fácilmente accesible, fácilmente accesible desde el ojo de forma no invasiva y rentable13. Contiene una mezcla de diversas proteínas, lípidos, electrolitos y otras moléculas, que refleja el estado fisiológico de la superficie ocular y los tejidos circundantes, incluida laretina 14. Se ha detectado un mayor número de miARN en el líquido lagrimal que en la solución sérica y acuosadel humor 15,16. La composición de la lágrima cambia en respuesta a diversas condiciones sistémicas, incluida la diabetes17. De hecho, se ha demostrado que el análisis del líquido lacrimal tiene un potencial prometedor para el seguimiento y diagnóstico de otras enfermedades no relacionadas con los ojos, como la esclerosis múltiple y el cáncer demama 18,19. Con la relación directa de la retinopatía diabética con el ojo, sería más relevante buscar posibles propiedades diagnósticas del líquido lagrimal en esta enfermedad. Se ha observado que los niveles de IL-1RA, IL-8, IL-6 y TNF-α en los fluidos lacrimales de pacientes con retinopatía diabética experimentan cambios, que también varían según la gravedad de laenfermedad 20,21. En comparación con la exploración tradicional de fundoscopia, el análisis del líquido lacrimal para la retinopatía diabética ofrece ventajas potenciales en términos de accesibilidad, no invasividad y especificidad, y permite una detección temprana antes del inicio de la enfermedad22.
Por tanto, el objetivo principal de este estudio es investigar el potencial del miR-15a exosomal derivado del líquido lacrimal como un novedoso marcador diagnóstico para la retinopatía diabética mediante el aislamiento y cuantificación de miARN a partir de fluidos lacrimales de la población diabética con retinopatía. Con esto, se desarrollaría un nuevo método de detección de la retinopatía diabética mediante cribado de líquido lacrimal, que es detectable incluso antes del inicio de las complicaciones retinianas, permitiendo medidas preventivas o terapéuticas tempranas.
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Protocolo
El estudio se llevó a cabo con la aprobación del Comité Ético de Investigación Médica del Centro Médico de la Universidad de Malaya (Número de referencia: 20165-2446). Se obtuvo el consentimiento por escrito de todos los sujetos humanos antes del reclutamiento. Un total de 135 sujetos fueron incluidos entre los pacientes que asistían a la clínica de oftalmología del Centro Médico de la Universidad de Malaya (UMMC), Kuala Lumpur. Los criterios de inclusión incluían a pacientes que recibieron servicios bajo UMMC y tenían entre 20 y 80 años. Los pacientes que recibieron tratamiento activo con insulina, con antecedentes de tratamiento láser o anti-VEGF en los últimos 3 meses, o que tomaron antiplaquetarios o anticoagulantes regulares fueron excluidos del estudio. Los sujetos se dividieron entonces en tres grupos: (1) control sano (control), (2) diabético sin retinopatía (DM Sin DR) y (3) diabético con retinopatía (DR). Un resumen del protocolo se proporciona en la Figura 1. Los detalles de los reactivos y equipos utilizados en este estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.
Figura 1: Visión general del protocolo. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.
1. Preparación de materiales
- Coloca un set básico estéril de apósito que contenga dos pinzas, seis bolas de algodón, cuatro gasas, una bandeja y una bolsa de biohazard.
- Vierte 5 mL de solución de riego con cloruro de sodio al 0,9% en una bandeja.
- Abre un paquete de toallitas limpiadoras para párpados y colócala sobre el campo estéril.
- Prepara un tubo que contenga 250 μL de solución conservante.
- Dobla una tira de Schirmer a nivel de cuña mientras aún está en su embalaje antes de colocar la tira estéril sobre el campo estéril.
- Ponte guantes quirúrgicos de forma aséptica.
- Usando un par de pinzas estériles, humedece las bolas de algodón con una solución de riego estéril de cloruro de sodio al 0,9% p/v.
2. Preparación de sujetos humanos
- Permite que el sujeto se siente cómodamente y pide que cierre los ojos.
- Limpia la piel periorbitaria cuatro veces usando algodón empapado en una solución de irrigación.
- Limpia la piel periorbitaria con una toallita limpiadora de párpados.
3. Recogida de líquido lacrimal humano
- Recoge los fluidos lagrimales utilizando la tira de Schirmers colocada en el fórnix temporal inferior.
- Al colocar la tira parcialmente doblada sobre el ojo derecho, pide al sujeto que mire hacia la izquierda. Baja el párpado inferior para exponer el fórnix inferior.
- Utilizando un par de pinzas estériles, coloca una tira de Schirmer en los dos tercios externos del fórnix conjuntival inferior. Evita que la tira toque la piel para evitar la contaminación de la muestra con sudor u otros materiales sobre la piel.
- Coloca una gasa debajo de la tira para evitar el contacto con la piel.
- Deja que las lágrimas se absorban en la tira hasta la marca de los 20 mm o un máximo de 5 minutos, lo que ocurra primero.
- Si no se alcanza el nivel de 20 mm, documentar el nivel de desgarros basándose en las marcas para permitir la estandarización del volumen del fluido desgarrador.
- Usando un par de pinzas estériles, retira cuidadosamente la tira de Schirmer y coloca la tira en un tubo que contiene solución de suero tampón de fosfato (PBS).
- Coloca el tubo en una nevera para transportarlo al laboratorio.
- Limpia la superficie periorbitaria limpiando cualquier solución residual en la piel.
4. Preprocesamiento de muestras de lágrimas
- Vortex, el tubo que contiene la tira de Schirmer remojado en PBS durante 5 minutos a temperatura ambiente.
- Agita el tubo en un balancín durante 5 minutos a temperatura ambiente.
- Centrifuga el tubo a 2000 x g durante 15 minutos a 4 °C.
- Transfiere la solución a un tubo nuevo, etiqueta y mantenla a -80 °C hasta el procesamiento posterior.
- Descarta la tira restante.
5. Aislamiento de exosomas
NOTA: El aislamiento de ARN se realiza utilizando un kit disponible comercialmente siguiendo el protocolo del fabricante (véase Tabla de Materiales).
- Descongela la solución de lágrimas sobre hielo durante 10 minutos.
- Equilibra la columna de centrifugación durante 15 minutos a temperatura ambiente antes de usarla.
- Quita la salida inferior de la columna y colócala sobre la placa de recogida de residuos proporcionada.
- Retira la alfombra de sellado superior y deja que el buffer de almacenamiento pase a través de la columna mediante fuerza gravitatoria.
- Añade 250 μL de PBS y deja que pase por la columna.
- Repite el paso 5.5.
- Aplica una muestra de 110 μL en la parte superior de cada columna y permite que la muestra entre en la columna.
- Transfiere la columna a una placa de recogida de muestra proporcionada.
- Añade 100 μL de PBS y deja que pase por la columna hasta la placa de recogida de muestras.
- Transfiere la columna a la placa de recogida de residuos.
- Añade 4 PBS de 200 μL a la columna y deja que entre en la columna para eliminar la fracción de proteínas libres de la primera carga.
- Añade 110 μL de muestra en la columna. Permite entrar en la columna.
- Coloca la columna sobre una placa de recogida de muestras. Añade 100 μL de PBS y deja que pase por la columna.
- Centrifuga brevemente la placa de recogida de muestras a 100 x g durante 30 s. Los exosomas aislados ya están listos para aislamiento de ARN.
6. Aislamiento de ARN
NOTA: El aislamiento de ARN se realiza utilizando un kit disponible comercialmente siguiendo el protocolo del fabricante (véase Tabla de Materiales).
- Sujeto 200 μL de los exosomas aislados al aislamiento de ARN.
- Añadir 60 μL de buffer de lisis a los exosomas aislados. Vórtice durante 5 s.
- Incuba a temperatura ambiente durante 3 minutos.
- Añade 20 μL de tampón inhibidor de precipitación, vórtice durante 20 s e incuba a temperatura ambiente durante 3 minutos.
- Centrifugar a 12.000 x g durante 3 minutos a temperatura ambiente.
- Transfiere el sobrenadante transparente e incoloro a un tubo nuevo.
- Añade 1 volumen de isopropanol.
- Vórtice durante 5 s y transfiere la solución a la mini columna de spin que viene en el kit.
- Centrifuga a temperatura ambiente durante 15 s a 8000 x g. Descarta el flujo a través de la corriente.
- Lava la columna con 700 μL de buffer de lavado RWT.
- Centrifugar durante 15 s a 8000 x g. Descarta el flowthrough.
- Lava la columna con 500 μL de tampón de lavado RPE.
- Centrifugar durante 15 s a 8000 x g. Descarta el flowthrough.
- Añade 500 μL de etanol al 80% a la mini columna de spin de la muestra.
- Centrifugar durante 2 minutos a 8000 x g. Desecha el flujo y el tubo de recogida.
- Coloca la mini columna de centrifugación en un nuevo tubo de recogida de 2 mL.
- Centrifuga la columna y el tubo a 18.000 x g durante 5 minutos. Descarta el flujo y el tubo de recogida.
- Coloca la mini columna de spin en un nuevo tubo de 1,5 mL y añade 15 μL de agua libre de RNasa en el centro de la membrana de la columna de espín.
- Incuba durante 3 minutos a temperatura ambiente.
- Centrifuga a 18.000 x g durante 1 minuto para eluir el ARN. El ARN está listo para su procesamiento posterior.
- Realizar análisis de seguimiento de nanopartículas para el control de calidad y la verificación del rendimiento del ARN.
7. Síntesis de ADNc
- Realizar síntesis de ADNc utilizando kits comercialmente disponibles siguiendo los protocolos del fabricante (véase Tabla de Materiales).
- Prepara la mezcla maestra según la Tabla 1 en un tubo microcentrífuga de 1,5 mL.
- Mezcla la solución pipeteando arriba y abajo.
- Pipete 5,1 μL de la mezcla maestra en tubos de PCR de 0,1 μL.
- Añadir 9,9 μL de muestra al tubo asignado que contiene la mezcla maestra.
- Coloca los tubos de PCR en un termociclador y haz que funcione según la Tabla 2.
NOTA: El ADNc está listo para un análisis posterior.
| Componente | Volumen/ reacción |
| Búfer RT 10x | 1,5 μL |
| Mezcla 100M dNTP | 0,15 μL |
| Inhibidor de ARNasa (200U/μL) | 0,19 μL |
| Enzima RT multiscribe (50U/μl) | 1 μl |
| Imprimación RT 20x | 0,75 μL |
| Agua libre de ARNAsa | 1,51 μL |
| Ejemplo | 9,9 μL |
| Volumen total | 15 μL |
Tabla 1: Preparación de la mezcla maestra PCR utilizada para la síntesis de ADNc a partir del ARN aislado.
| Escalón | Temperatura | Duración |
| Transcripción inversa | 16 °C | 30 min |
| 42 °C | 30 min | |
| ¡Para | 85 °C | 5 min |
| Espera | 4 °C |
Tabla 2: Condiciones de termociclo para la síntesis de ADNc.
8. PCR digital de gotas
NOTA: La PCR digital por gotas (ddPCR) se realiza utilizando kits comercialmente disponibles siguiendo los protocolos del fabricante (véase Tabla de Materiales).
- Prepara la mezcla maestra para ddPCR en un tubo microcentrífuga de 1,5 mL según la Tabla 3.
- Pipeta 19,8 μL de mezcla maestra en tubos PCR de 0,1 μL. Añade 2,2 μL de muestras y mezcla bien pipeteando la mezcla arriba y abajo durante 10 veces.
- Transfiere 20 μL de la mezcla de muestra a la línea de muestra del cartucho ddPCR.
- Añade 50 μL de aceite al carril de aceite del cartucho.
- Coloca una junta en el cartucho usando el gancho de la placa.
- Coloca el cartucho en la máquina generadora de gotas. Un clic indica la inserción correcta del cartucho en la máquina de generación de gotas.
- Transfiere cuidadosamente todas las gotas generadas a pozos de una placa de 96 pozos. Añade al menos un pozo sin control de plantilla como un control negativo.
- Sella la placa usando un papel de aluminio perforable en una máquina selladora de placas (véase la Tabla de Materiales).
- Coloca la placa en un termociclador y haz que funcione según la Tabla 4.
- Transfiere la placa a la máquina lectora de gotas para contar las gotas positivas y negativas.
- Cuantifica el número de copia/mL usando el número de copia/valor de 20 μL generado por la ejecución.
| Componente | Volumen/ reacción |
| 2x ddPCR Supermix para sondas (sin dUTP) | 10 μL |
| 20x Cebadores/ sonda | 1 μL |
| Ejemplo | 7 μL |
| Agua libre de ARNAsa | 2 μL |
| Volumen total | 20 μL |
Tabla 3: Preparación de la mezcla maestra PCR utilizada para ddPCR.
| Escalón | Temperatura | Duración | Rampa | Ciclo |
| Activación enzimática | 95 °C | 10 min | ~2 °C/ s por cada paso | 1 |
| Desnaturalización | 94 °C | 30 s | 40 | |
| Recocido | 60 °C | 1 min | 40 | |
| Desactivación enzimática | 98 °C | 10 min | 1 | |
| Espera | 4 °C | N/A | N/A |
Tabla 4: Condiciones de termociclo para la ddPCR.
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Resultados
Curva estándar
Se creó una curva estándar para determinar el volumen exacto de desgarros recogidos de cada paciente. Básicamente, diferentes volúmenes de conservantes entre 3 μL y 25 μL estuvieron expuestos a tiras de Schirmer. Y se observó la distancia de la zona húmeda en el Schirmer. El procedimiento se repitió tres veces para cada procedimiento y se calculó la lectura media. Se generó una curva estándar del volumen de desgarros recogidos frente a la distancia de l...
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Discusión
El examen de fundoscopia, la tomografía de coherencia óptica y la angiografía con fluoresceína son las técnicas de detección actualmente disponibles para la detección de retinopatías diabéticas. Las tres técnicas se utilizan a menudo juntas para proporcionar una evaluación exhaustiva de diversas enfermedades retinianas y coroideas. La funduscopia es un examen clínico que se realiza rutinariamente durante la evaluación de la retinopatía diabética. Este método es realizado por oftalmólogos...
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses en competencia.
Agradecimientos
Esta investigación fue apoyada por el Alcon Research Institute (IF011-2020) y la Beca de Investigación Postdoctoral FOM UMSC Care 2021.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 0,9% en función de cloruro de sodio | Ain Medicare Sdn Bhd | GB16165967618 | |
| 1x Soro tampón de fosfato | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | |
| Biosistemas Aplicados Kit de transcripción inversa de microARN TaqMan | Biosistemas Aplicados | 4366596 | |
| ddPCR Supermix para sondas (sin dUTP) | Laboratorios BioRad | 1863024 | |
| Placas ddPCR de 96 pozos | Laboratorios BioRad | 12001925 | |
| Cartuchos DG8 | Laboratorios BioRad | 1864008 | |
| Juntas DG8 | Laboratorios BioRad | 1863009 | |
| Aceite de generación de gotas para sondas | Laboratorios BioRad | 1863005 | |
| Kit de aislamiento de exosmas Exospin-96 | Sistemas de Guiado de Células | EX07-96 | |
| Kit avanzado de suero/plasma miRNeasy | Qiagen | 217204 | |
| Sellador de placas PCR PX1 | Laboratorios BioRad | 1814000 | |
| Sistema de PCR digital con gotas QX100 | Laboratorios BioRad | QX100 | |
| QXDx Generador de Gotas | Laboratorios BioRad | 12001049 | |
| Tira de Schirmer | Optitech | SCH-100 | |
| Ciclador térmico T100 | Laboratorios BioRad | 1861096 | |
| Ensayo de microARN Taqman MTOMED 20 (ID del ensayo: 000389) | Biosistemas Aplicados | 4440887 | Secuencia de objetivos: UAGCAGCACAUAAUGGUUUGUG |
Referencias
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