Preparación de un modelo de pancreatitis aguda grave en ratones mediante una combinación de caeruleina e inyección intraperitoneal de lipopolisacáridos

Resumen

La administración intraperitoneal de fármacos es un enfoque no invasivo seguro y eficaz para inducir la lesión pancreática. Este estudio comparó cinco protocolos distintos de inyección intraperitoneal en ratones para inducir diversos grados de lesión pancreática y estableció un modelo de lesión pancreática grave para investigar los cambios patológicos y las estrategias de tratamiento para la pancreatitis aguda grave (PAS).

Resumen

El tratamiento de la pancreatitis aguda (PAS) grave, con altas tasas de mortalidad, plantea un importante reto clínico. La investigación de los cambios patológicos asociados con el SAP utilizando modelos animales puede ayudar a identificar posibles objetivos terapéuticos y explorar nuevos enfoques de tratamiento. Los estudios anteriores indujeron principalmente lesión pancreática a través de la inyección retrógrada de taviaborocolato de sodio en el conducto biliar, pero el impacto del daño quirúrgico en la calidad del modelo animal sigue sin estar claro. En este estudio, empleamos varias frecuencias de inyecciones intraperitoneales de caeruleína combinadas con diferentes dosis de LPS para inducir lesión pancreática en ratones C57BL/6J y comparamos el alcance de la lesión en cinco protocolos de inyección intraperitoneal. En cuanto a la inducción de pancreatitis aguda en ratones, se propone un protocolo de inyección intraperitoneal que da como resultado una tasa de mortalidad de hasta el 80% en 5 días. En concreto, los ratones recibieron diez inyecciones intraperitoneales diarias de Caerulein (50 μg/kg), seguidas de una inyección de LPS (15 mg/kg) una hora después de la última administración de Caerulein. Al ajustar la frecuencia y la dosis de los medicamentos inyectados, se puede manipular la gravedad de la lesión pancreática de manera efectiva. Este modelo exhibe una fuerte capacidad de control y tiene un ciclo de replicación corto, lo que lo hace factible para que lo complete un solo investigador sin requerir equipos costosos. Simula de forma cómoda y precisa las características clave de las enfermedades observadas en el SAP humano, al tiempo que demuestra un alto grado de reproducibilidad.

Introducción

La pancreatitis aguda grave se caracteriza por un inicio rápido, una progresión rápida y altas tasas de mortalidad dentro del dominio de la enfermedad del sistema digestivo¹. Su alta tasa de mortalidad siempre ha sido un foco destacado de la investigación clínica. Debido a los cambios impredecibles en las condiciones clínicas, la heterogeneidad de las manifestaciones de la enfermedad y la disponibilidad limitada de muestras humanas, el establecimiento de modelos animales se ha vuelto cada vez más crucial para la investigación de enfermedades.

La inyección retrógrada de taurocolato de sodio en el conducto biliar común se usa comúnmente para crear un modelo de rata de SAP². Al simular la obstrucción pancreáticobiliar e inducir el reflujo de la bilis y el líquido pancreático, esta técnica de modelado exhibe una alta tasa de éxito en la replicación de modelos animales de SAP. Sin embargo, hay que tener en cuenta que la cirugía invasiva sí tiene un impacto en el propio modelo animal. Además, este método se limita a animales más grandes, como ratas y perros, que se utilizan principalmente como sujetos experimentales. Las técnicas alternativas, como la intubación duodenal³, la punción duodenal directa⁴ y la punción directa del conducto biliar-conducto pancreático⁵, se utilizan con frecuencia con fines de modelado.

La inyección intraperitoneal y los métodos de modelado dietético ofrecen ventajas no invasivas que se pueden aplicar a animales de cualquier tamaño. El modelo murino de PAS inducida por la alimentación con deficiencia de colina (CDE)⁶ presenta ciertas complicaciones, como hiperglucemia e hipocalcemia mal controlables, lo que lo hace inadecuado para evaluar nuevos enfoques diagnósticos y terapéuticos. Por otro lado, la inyección intraperitoneal de Caerulein combinada con L-arginina⁷ representa el método más comúnmente empleado para inducir pancreatitis aguda en ratones. En concreto, la administración intraperitoneal repetida de Caeruleína, un análogo de la colecistoquinina, proporciona un enfoque muy adecuado para investigar diversos aspectos relacionados con esta enfermedad destructiva, incluyendo la patogenia, la inflamación y los procesos de regeneración. Debido a su similitud estructural con la colecistoquinina (CCK), la caeruleína estimula eficazmente la contracción de la vesícula biliar y la secreción de enzimas pancreáticas, lo que conduce a un desequilibrio en la secreción de enzimas seguido de la posterior autodestrucción⁸. El lipopolisacárido (LPS), que es ubicuo y se ha estudiado ampliamente como una molécula de patrón molecular asociada a patógenos, puede combinarse con Caerulein mediante inyección intraperitoneal para establecer un modelo eficaz de SAP en ratones. Esta combinación desencadena y libera rápidamente un número significativo de citocinas inflamatorias, lo que resulta en una inflamación local y sistémica excesiva. Varios estudios han reportado la inducción de modelos de SAP en ratones a través de la inyección intraperitoneal de Caerulein combinada con LPS. Esto puede atribuirse al hecho de que la inyección intraperitoneal de Caerulein puede causar edema pancreático y hemorragia en ratones, mientras que la adición de LPS puede inducir inmediatamente necrosis pancreática y exacerbar la respuesta inflamatoria sistémica, sepsis e incluso insuficiencia orgánica. Actualmente, existe variación en la dosis y la frecuencia de las inyecciones intraperitoneales de caeruleína, así como inconsistencia en la dosis adicional de LPS. Lograr la consistencia en los modelos SAP de ratón es un desafío 9,10,11,12; Por lo tanto, es necesario establecer un protocolo estandarizado para obtener un modelo ideal. En este artículo, describimos un protocolo para la inyección intraperitoneal en ratones e investigamos la frecuencia óptima de inyección y la dosis adicional de LPS.

Protocolo

Este protocolo fue revisado y aprobado por el Comité de Ética del Primer Hospital Afiliado de la Universidad de Ciencia y Tecnología de Anhui (Huainan, China) (Código de Ética: 2023-KY-905-001). El estudio siguió las pautas de los Institutos Nacionales de Salud para el cuidado y uso de roedores de investigación en todos los procedimientos con animales. Para el presente estudio se utilizaron ratones adultos C57BL/6J con un peso de 20-30 g. Los ratones se alojaron en un laboratorio animal durante una semana en condiciones controladas (aproximadamente 21 °C con un ciclo alternado de 12 horas día-noche). Los ratones tenían acceso ad libitum a la comida y al agua en todo momento. Los detalles de los reactivos y equipos utilizados en el estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Preparación animal

1. Asigne 84 ratones C57BL/6J sanos a seis grupos, incluido el grupo de control, Lesión pancreática (PI) I, PI II, PI III, PI IV y PI V.
2. Antes de iniciar el procedimiento de modelado, etiquete a cada grupo de ratones con muescas en las orejas y déjelos ayunar durante 12 h.

2. Preparación del diluyente de fármaco inducido

1. Disolver la Caerulein (1 mg) en 1 mL de PBS y refrigerar a -20 °C.
2. Mida y registre el peso de los ratones experimentales 1 h antes de la inyección intraperitoneal del fármaco.
3. Extraiga la masa total de caeruleína necesaria en una proporción de 50 μg/kg, basada en el peso total de todos los ratones.
4. Diluir de nuevo el fármaco Caerulein obtenido con PBS.
   NOTA: El volumen total de dilución de PBS debe ser equivalente a 5 veces el valor del peso total de todos los ratones. Se utilizó el mismo método de dilución para obtener el diluyente LPS.

3. Inyección intraperitoneal

NOTA: Se administraron inyecciones intraperitoneales a cada grupo de ratones de acuerdo con el protocolo descrito en la Tabla Suplementaria 1 para inducir el modelo. Se agruparon y trataron 10 ratones adicionales con tasas de supervivencia a los 7 días.

1. Agarre y sostenga a los ratones de manera que el vientre de los ratones quede hacia arriba y la cabeza se coloque más abajo que la cola para evitar daños a los órganos al insertar la jeringa.
2. Desinfecte el abdomen de los ratones con bolas de algodón con alcohol al 75%.
3. Sostenga la jeringa en la mano derecha (usando una aguja que mida ≤0.5/≥0.3) e inserte la aguja en la piel subcutánea en el lado izquierdo de la línea blanca abdominal.
   NOTA:Cambie al lado derecho para la siguiente inyección.
4. Una vez que la aguja haya alcanzado la capa subcutánea, muévala hacia adelante aproximadamente 3-5 mm y luego inserte la aguja de la jeringa en la cavidad abdominal en un ángulo de 45°. En este punto, uno debería sentir cierta resistencia.
5. Mantenga la aguja inmóvil e inyecte la sustancia lentamente.
   NOTA: No exceda 5 veces el valor de peso de los ratones como el volumen de una sola inyección intraperitoneal.
6. Después de la inyección, saque la aguja y masajee suavemente y presione el lugar de la inyección con un hisopo de algodón estéril para difundir completamente el medicamento en la cavidad abdominal de los ratones.
7. Use una jeringa nueva para repetir con los próximos ratones experimentales.

4. Pruebas de capacidad conductual de campo abierto

NOTA: 12 h después de la última inyección intraperitoneal, se realizaron pruebas de capacidad conductual en campo abierto para evaluar la distancia total de actividad y el tiempo de inmovilidad de los ratones.

1. Coloque cuatro cajas blancas idénticas directamente debajo de la cámara.
2. Conecte la cámara al ordenador mediante un cable de vídeo.
3. Asegúrese de que la caja experimental esté limpia y libre de olores antes de comenzar el experimento.
4. Coloque al animal en el centro de la cuadrícula, de espaldas al experimentador, y permita que se adapte al entorno durante 10 minutos.
5. Inicie el software de seguimiento de video y haga clic en el menú Archivo para crear un nuevo experimento.
6. Configure el monitoreo para cuatro campos de visión simultáneos.
7. Marque la longitud y el ancho del objeto experimental que puede moverse dentro de la caja en la pantalla de monitoreo en tiempo real (30 cm × 30 cm).
8. Una vez completada la configuración, comience la videovigilancia y la grabación.
9. Registre la actividad de los ratones durante 15 min.
10. Después de la prueba, retire al animal de la rejilla y devuélvalo a su jaula. Limpie a fondo la rejilla con un esterilizante que contenga dióxido de cloro.

5. Recolección y análisis de sangre periférica de ratones

1. Eutanasia de los ratones (siguiendo el protocolo aprobado institucionalmente).
   1. Realizar la eutanasia en los ratones experimentales 36 h después de la inyección intraperitoneal. Mida y registre el peso corporal de los ratones antes de la eutanasia.
      NOTA: Administrar 0,18 mL de hidrato de cloral al 10% por vía intraperitoneal, asegurándose de que no haya reacción a la estimulación del dedo del pie o de la cola.
   2. Con la mano izquierda, asegure los ratones y con la mano derecha, sostenga las tijeras para recortar los bigotes de un lado de los ratones.
   3. Presione suavemente la piel alrededor del ojo para inducir la congestión y la protrusión del globo ocular.
   4. Use pinzas curvas para agarrar el globo ocular y extraerlo rápidamente, recolectando sangre periférica en un tubo de microcentrífuga.
      NOTA: Se utilizaron dos tipos diferentes de tubos de microcentrífuga, uno que contenía anticoagulante y el otro sin él.
   5. Al mismo tiempo, presione ligeramente el área del corazón de los ratones con el dedo medio de la mano izquierda para aumentar la velocidad de bombeo del corazón.
2. Dejar la sangre periférica sin anticoagulante a temperatura ambiente durante 30 min.
3. Mida las concentraciones séricas de amilasa (Amy) y lipasa (Lip) utilizando un analizador bioquímico automatizado a través del método de tasa enzimática y el método de circulación enzimática (siguiendo las instrucciones del fabricante).
4. Determine los niveles de indicadores inflamatorios como la Pro calcitonina (PCT) en plasma utilizando el método de quimioluminiscencia utilizando un generador de imágenes de quimioluminiscencia comercial (siguiendo las instrucciones del fabricante).
5. Use kits de ELISA para medir los niveles de HMGB-1, IL-6 y TNF-α en el suero de ratones (siguiendo las instrucciones del fabricante).
6. Analice la sangre periférica tratada con anticoagulante utilizando un analizador de células sanguíneas totalmente automático para evaluar los parámetros relevantes.

6. Recolección del tejido pancreático y preparación de una sección de parafina

1. Coloque los ratones en posición supina y asegúrelos en una placa de espuma.
2. Afeita y desinfecta el área, luego haz una incisión en la mediana abdominal y voltea el tubo del intestino delgado hacia la derecha para exponer completamente el páncreas.
3. Desconecte el duodeno y el conducto pilórico y ubique el intestino delgado debajo del páncreas. Libera completamente el tejido pancreático a lo largo del conducto intestinal.
4. Use pinzas sin dientes para sujetar el bazo y tire suavemente hacia arriba.
   NOTA: No toque directamente el tejido pancreático y evite usar fuerza excesiva durante todo el proceso de disociación.
5. Diseccionar bruscamente el tejido del ligamento pancreático posterior hasta la cabeza del páncreas y desconectar el conducto biliar y los vasos sanguíneos.
6. Retire el tejido pancreático, seque la humedad de la superficie con papel absorbente, pese y registre.
7. Fije la mitad del tejido pancreático con paraformaldehído al 4% y guarde la otra mitad en un refrigerador a -80 °C.
8. Prepare las secciones de parafina pancreática siguiendo los pasos a continuación.
   1. Limpie el tejido pancreático fijo con alcohol al 75% y recórtelo a un tamaño aproximado de 0,5 cm × 0,5 cm.
   2. Sumerja el tejido en etanol al 70% durante 20 minutos, etanol al 80% durante otros 20 minutos y etanol al 90% durante 15 minutos.
   3. Trate el tejido dos veces con etanol al 95% durante 15 minutos cada vez y luego dos veces con etanol al 100% durante 5 minutos cada vez.
   4. Someter el tejido a dos rondas de tratamientos de 12 min y 5 min con solución de xileno para mayor transparencia.
   5. Remojar el pañuelo transparente en un tanque de cera a 65 °C durante 1 h.
   6. Incrusta el pañuelo en parafina derretida y deja que se enfríe. Obtener secciones de parafina pancreática con una cortadora (grosor: 5 μm).
   7. Aplanar las rodajas de parafina obtenidas en agua a 45 °C, montarlas y secarlas (condiciones de horneado: 40 °C durante 14-16 h).

7. Tinción de hematoxilina y eosina (H&E)

1. Coloque las secciones de parafina pancreática en xileno I y II durante 30 minutos, luego en alcohol anhidro, 95%, 85% y 75% durante 5 minutos cada una, y agua ultrapura durante 5 minutos.
2. Tiñir el núcleo celular con hematoxilina durante 160 s, luego enjuagar con agua corriente lentamente.
3. Aplique una solución de diferenciación de alcohol con ácido clorhídrico durante 5-10 s, luego enjuague con agua corriente rápidamente.
4. Tratar las secciones con alcohol anhidro durante 5 min.
5. Incubar el citoplasma con eosina durante 30 s, luego enjuagar con agua corriente.
6. Sumerja las secciones en etanol al 75%, 85%, 95% y 100% durante 10 s cada una, luego trátelas con xileno durante 5 minutos para que se deshidraten.
7. Por último, sella las secciones con resina neutra y observa bajo un microscopio.
8. Realizar la puntuación patológica y los estándares¹³.
   NOTA: Determinar la gravedad de la pancreatitis en función de indicadores como edema, necrosis acinar, sangrado, hemorragia y necrosis grasa, e inflamación inflamatoria y perivascular. Utilice las directrices de implementación publicadas anteriormente para puntuar¹³.

8. Tinción inmunohistoquímica

1. Desparafinar las secciones de tejido pancreático incluidas en parafina en xileno y posteriormente rehidratarlas en un gradiente de soluciones de etanol.
2. Llevar a cabo el bloqueo enzimático endógeno utilizando 3% H₂O₂ durante 20 min después de una rotura de membrana de 30 min.
3. Bloquear el anticuerpo con suero bovino al 5% a temperatura ambiente durante 30 min, luego incubar durante la noche a 4 °C con una dilución 1:1500 de conejo anti-HMGB1.
4. Enjuague las secciones con PBS, luego incube en los anticuerpos secundarios correspondientes durante 30 min a 37 °C. Después de eso, lleve a cabo el desarrollo del color DAB, la contratinción de hematoxilina y selle con goma neutra.

9. Método TUNEL para la detección de la apoptosis en cortes pancreáticos

1. Desparafinar las secciones de parafina pancreática en xileno durante 5 min, repetir dos veces y lavar con etanol degradado (100% durante 5 min, 90% durante 2 min, 70% durante 2 min y agua destilada durante 2 min).
2. Lave el exceso de líquido que rodea las secciones de parafina con PBS. Tratar cada muestra con 100 μL de proteinasa K, asegurando una cobertura completa del tejido. Incubar las muestras a 37 °C durante 20 min. Posteriormente, remoje las muestras en PBS 3 veces, cada vez durante 5 min.
   NOTA: La solución de proteinasa K se preparó diluyendo la solución original de proteinasa K (200 μg/mL) con PBS en una proporción de 1:9 (volumen), lo que resultó en una concentración final de 20 μg/mL, excluyendo la DNasa. El lavado a fondo de la proteinasa K es esencial para evitar interferencias con las reacciones de etiquetado posteriores.
3. Añadir una cantidad adecuada de 3% de H₂O₂ (diluido por PBS) sobre el tejido para infiltrarlo completamente e incubar durante 20 min. Enjuague el pañuelo con PBS 3 veces durante 5 minutos cada una.
   NOTA: Las secciones de parafina deben mantenerse húmedas. Para inactivar las peroxidasas endógenas en el tejido, el tiempo de incubación no debe ser demasiado largo para evitar falsos positivos debido a la rotura del ADN causada por el 3% de_H2O2.
4. Cubrir toda el área de la muestra a analizar con 50 μL de tampón de equilibrio e incubar durante 10 min.
5. Elimine la mayor cantidad posible de búfer de equilibrio. A continuación, añada 56 μL de tampón de incubación TdT a cada muestra de tejido e incube durante 1 h (a temperatura ambiente).
   NOTA: No se debe permitir que el portaobjetos se seque y se debe evitar la exposición a la luz. El tampón de incubación TdT se preparó de acuerdo con las instrucciones del fabricante (enzima TdT recombinante: Mezcla de etiquetado Biotina-dUTP: Tampón de equilibrio = 1 μL: 5 μL: 50 μL).
6. Lave las muestras de tejido con PBS inmediatamente. Enjuágalos 4 veces durante 5 minutos cada uno. Retire suavemente cualquier exceso de solución de PBS alrededor de las muestras con papel de filtro.
7. Añadir 100 μL de solución de reacción de estreptavidina-HRP previamente diluida (estreptavidina-HRP: TBST = 1:300) a cada muestra de tejido para la reacción de estreptavidina-HRP. Incubar durante 30 min. Luego, lave las muestras con PBS y enjuáguelas 3 veces durante 5 minutos cada una.
8. Realice la tinción de DAB añadiendo 50 μL de DAB a cada sección de parafina. Observe la tinción bajo un microscopio en tiempo real. Después de que aparezca una tinción positiva, coloque inmediatamente los portaobjetos en una caja húmeda. Detenga la reacción lavándolo con agua pura.
9. Sumerja los portaobjetos en una solución de tinción de hematoxilina durante 3-5 minutos, luego enjuague con agua pura.
10. Diferenciar en solución de diferenciación de hematoxilina durante unos 2 s, seguido de un enjuague inmediato con agua pura.
11. Logre la coloración azul con la solución de rebludo de hematoxilina durante unos segundos y enjuague los portaobjetos con agua pura.
    NOTA: Realice un examen microscópico después de la tinción nuclear. Si la tinción es demasiado oscura, devuelva los portaobjetos a la solución de diferenciación. Si la tinción es demasiado ligera, reinicie el proceso de tinción desde el paso de tinción nuclear.
12. Deshidratar las muestras con 4 rondas de etanol anhidro fresco durante 5 minutos cada una. Luego, sumérgelos en butanol durante 5 min y en xileno durante 5 min. Finalmente, use xileno fresco durante otros 5 minutos.
13. Monta las correderas con goma neutra. Deje que se sequen al aire de forma natural o séquelos en un horno a 60 °C.
14. Realizar el examen histológico con un microscopio de luz blanca. Los núcleos apoptóticos aparecerán de color marrón.
15. Calcule el índice apoptótico (IA) correspondiente.
    NOTA: Observe las diapositivas de manera doble ciego. En los portaobjetos TUNEL-positivos, seleccione aleatoriamente 5 áreas positivas con un aumento alto (400x) y cuente al menos 100 células acinares en cada área para determinar el porcentaje de células positivas. AI = (número total de células apoptóticas/número total de células) × 100%.

10. Citometría de flujo

1. Obtenga tejidos pancreáticos frescos y lávelos a fondo después de perfundirlos con PBS.
2. Prepare una solución de digestión de colagenasa IV al 0,5% y utilice tijeras de tejido estériles para digerir adecuadamente los tejidos pancreáticos.
3. Añadir una solución de terminación de digestión BSA al 5% en función del estado de los fragmentos pancreáticos y de la turbidez del líquido, y centrifugar la mezcla a baja temperatura durante 5 min (~300 x g, 4 °C).
4. Deseche el sobrenadante para terminar la digestión.
5. Prepare un medio de cultivo celular que contenga fluoruro de fenilmetano sulfonilo (PMSF) y 2,5% de suspensión de células de suero fetal bovino para resuspender las células pancreáticas.
6. Filtre las suspensiones de células acinares pancreáticas a través de una malla de nailon de 200 mallas para obtener suspensiones celulares a través del filtrado celular.
7. Centrifugar la suspensión de células acinares pancreáticas a baja temperatura (siga las condiciones mencionadas en el paso 10.3).
8. Deseche el sobrenadante.
9. Lave las celdas con PBS preenfriado.
10. Resuspenda suavemente las células en un tampón de unión 1x preenfriado mediante resuspensión centrífuga.
11. Etiquete las células acinares pancreáticas con anexina V-FITC/PI de acuerdo con las instrucciones del fabricante después de ajustar la concentración celular.
12. Utilice la citometría de flujo dentro de 1 h para detectar la apoptosis en las células acinares pancreáticas.

11. Detección de Western blot de Caspasa-3 y HMGB-1

1. Extrae la proteína pancreática.
   1. Extraer 50 mg de tejido pancreático y cortarlo en pequeños fragmentos.
   2. Añadir 1 mL de tampón de lisis RIPA (que contiene PMSF e inhibidor de la proteasa fosforilada).
   3. Homogeneizar el tejido pancreático en hielo durante 5 min con un molinillo eléctrico.
   4. Incubar el tejido homogeneizado en hielo agitando suavemente durante 2 h.
   5. Centrifugar el homogeneizado a 4 °C durante 10 min a 4.500 x g.
   6. Recoja la solución sobrenadante y guárdela a -80 °C.
2. Realizar la cuantificación de proteínas.
   1. Diluir un cierto volumen de muestra estándar BSA (25 mg/mL) hasta una concentración de 0,5 mg/mL.
   2. Prepare una cantidad específica de solución de trabajo de BCA mezclando 50 volúmenes de solución A de BCA con 1 volumen de solución B de BCA, asegurando una mezcla completa y uniforme.
   3. Coloque la muestra estándar de BSA en los orificios de muestra estándar en una placa de 96 pocillos del orden de 0, 1, 2, 4, 8, 12, 16 y 20 μL. Equilibre el volumen de cada orificio con agua destilada, lo que da como resultado un volumen total de 20 μL.
   4. Agregue 2 μL de muestras en los orificios de muestra, luego agregue secuencialmente 18 μL de agua destilada para diluir (1:9).
   5. Llene cada pocillo con 200 μL de solución de trabajo de BCA y déjelo reposar a 37 °C durante aproximadamente 20-30 min.
   6. Mida la absorbancia a una longitud de onda de 562 nm. Calcule la concentración de proteínas de las muestras en función de la curva estándar.
   7. Añadir un volumen específico de solución de craqueo RIPA y tampón diluyente para diluir las muestras hasta que la concentración alcance los 5-10 μg/μL, lo que se considere adecuado.
   8. Almacene las muestras a -20 °C después de la desnaturalización de las proteínas (100 °C; 10 min).
3. Realiza el Western blot.
   1. Haga los preparativos para SDS-PAGE.
      1. Instale los moldes para hacer pegamento e inspeccione su rendimiento de sellado.
      2. Agregue TEMED al adhesivo de separación al 10% y mezcle uniformemente.
      3. Inyecte la mezcla en el molde, representando aproximadamente dos tercios del volumen, evitando las burbujas.
      4. Añade el isopropanol al molde y presiona el adhesivo durante unos 40 min.
      5. Utilice el mismo programa para configurar el adhesivo concentrado al 5%.
      6. Vierta el isopropanol y agregue el adhesivo inmediatamente.
      7. Coloca el peine verticalmente hasta que el pegamento se polimerice por completo.
   2. Realice la operación de electroforesis.
      1. Añada la muestra que se va a analizar en el orden de control experimental esperado, en orden inverso, en los orificios de muestreo del adhesivo SDS-PAGE.
      2. Agregue simultáneamente la marca de proteína para determinar la ubicación de la proteína objetivo y la proteína de referencia interna.
      3. Coloque la muestra en el tanque de electroforesis después de completar la adición de la muestra.
      4. Inicialmente, corría a 80 V durante 30 min, seguido de hacer funcionar el gel para separar la proteína a 100 V durante 60 min.
         NOTA: Se debe prestar atención a la posición del azul de bromofenol para evitar una electroforesis excesiva.
   3. Realizar la transferencia de proteínas.
      1. Corta la película de PVDF en la esquina superior derecha para que sirva como marca.
      2. Coloque la película de PVDF en una solución de metanol durante 5-10 s para que se active.
      3. Remoje la película de PVDF en un tampón de electroforesis durante aproximadamente 15 minutos.
      4. Retire con cuidado el gel después de la electroforesis y recorte el exceso de gel, asegurándose de que el gel permanezca húmedo durante todo el proceso.
      5. Ensamble la férula en el siguiente orden: placa negativa → esponja → tres capas de papel de filtro → gel → película de PVDF → tres capas de papel de filtro → esponja → placa positiva.
         NOTA: Asegúrese de que no haya burbujas entre el gel y la película de PVDF.
      6. Coloque la abrazadera ensamblada en la ranura giratoria húmeda (de negro a negro) con cubitos de hielo colocados a su alrededor.
      7. Encienda la alimentación e inicie la transferencia de película a 400 mA durante 100 min.
   4. Realizar el sellado de la película de PVDF y la incubación de anticuerpos primarios y secundarios.
      1. Retire suavemente la película de PVDF después de la transferencia y enjuague con TBST durante 10 minutos, repitiendo el proceso de 3 a 5 veces.
      2. Sellar el film de PVDF en leche desnatada al 5% durante 2 h.
      3. Retire la película de PVDF y enjuague con TBST durante 10 minutos, repitiendo el proceso 4 veces.
      4. Coloque la película de PVDF y el anticuerpo primario diluido juntos en un refrigerador a 4 °C agitando suavemente e incube durante la noche.
      5. Retire la película de PVDF al día siguiente y enjuague con TBST durante 10 minutos, repitiendo el proceso 4 veces.
      6. Incubar la película de PVDF en un diluyente de anticuerpos secundario marcado con HRP durante aproximadamente 2 h.
      7. Enjuague la película de PVDF con TBST durante 10 minutos, repitiendo el proceso 4 veces.
   5. Exponer la película y analizarla.
      1. Aplique la solución ECL preparada sobre la película de manera uniforme.
      2. Exponga la película en una habitación oscura con un exposímetro durante aproximadamente 2-3 minutos y luego guárdela.
      3. Realice el análisis utilizando el software image J.

Resultados

El proceso de modelado experimental en ratones se ilustra en la Figura 1. Después de 12 h de la finalización de la inyección, se utilizó una grabadora de video de campo abierto para monitorear la distancia de movimiento y la duración de la inmovilidad de diferentes grupos experimentales de ratones durante 5 ciclos (Figura 2A). Durante los 5 ciclos, los ratones del grupo PI V mantuvieron un nivel bajo de distancia de movimiento dentro de los 3 minutos, mientras que la tasa de inmovilidad dentro de los 3 minutos aumentó con cada ciclo subsiguiente (Figura 2B,C). Además, se realizó un análisis estadístico de la distancia total de movimiento de ratones de diferentes grupos experimentales durante los 5 ciclos. El grupo PI V mostró la menor distancia total de movimiento en comparación con los otros grupos experimentales, y la diferencia fue estadísticamente significativa (p < 0,001) (Figura 2D,E). Con la excepción del grupo control y el grupo PI I, los ratones de los otros grupos experimentales mostraron un crecimiento negativo en el peso del valor D. Entre ellos, el grupo PI V mostró el mayor cambio en el peso, y la diferencia en el cambio de peso en comparación con los otros grupos experimentales fue estadísticamente significativa (Figura 2F). Después de evaluar la tasa de supervivencia de 10 ratones adicionales en cada grupo experimental, los resultados mostraron que la tasa de mortalidad de los ratones en el grupo PI V alcanzó el 80% en el^{quinto día.} Sin embargo, no hubo diferencias estadísticamente significativas en la tasa de mortalidad entre los otros cuatro grupos experimentales y los ratones del grupo control (Figura 2G).

Utilizando un microscopio de alta potencia, se observó una importante hinchazón celular, necrosis e infiltración de células inflamatorias en los grupos de ratones PI IV y PI V (Figura 3A,B). Utilizando los criterios de valoración proporcionados en la Tabla Suplementaria 2, se evaluó la patología pancreática de diferentes grupos experimentales de ratones, y se observaron diferencias significativas en la puntuación de patología pancreática en comparación con los ratones del grupo control (p < 0,001) (Figura 3C; Figura complementaria 1). Además, en comparación con el grupo control, los niveles séricos de amilasa y lipasa en los ratones medidos fueron significativamente más altos en los grupos experimentales de PI II a PI V, y las diferencias fueron estadísticamente significativas. Curiosamente, no hubo diferencias estadísticamente significativas en los ratones del grupo PI I (Figura 3D,E). Se empleó el método ELISA para evaluar los niveles de marcadores inflamatorios¹⁴, incluyendo TNF-α e IL-6, en el suero de ratones. Los resultados revelaron que los niveles de TNF-α e IL-6 en los ratones del grupo PI V fueron significativamente más altos que los de los otros grupos experimentales, y las diferencias fueron estadísticamente significativas (Figura 3F,G). En comparación con el grupo control, los niveles de PCT aumentaron en los cuatro grupos experimentales, pero solo la diferencia en el grupo PI V fue estadísticamente significativa (p < 0,05) (Figura 3H).

Estado apoptótico de los tejidos pancreáticos en diferentes grupos experimentales de ratones
Al realizar la tinción con TUNEL en los tejidos pancreáticos de cada grupo de ratones, se observó el estado de necrosis celular en los tejidos pancreáticos de diferentes grupos experimentales (Figura 4A). Los valores de la escala de grises (OD) por unidad de área de secciones de tejido pancreático y la tasa positiva de necrosis celular se analizaron semicuantitativamente utilizando el software Image J. Los resultados mostraron que, en comparación con los otros grupos experimentales, el nivel de necrosis celular en los tejidos pancreáticos del grupo de ratones PI V aumentó significativamente, y la diferencia fue estadísticamente significativa (p < 0,001) (Figura 4B,C). Se realizaron experimentos de inmunotransferencia de proteínas para evaluar los niveles de expresión de la proteinasa-3 específica de cistinil aspartato (Caspasa-3), un marcador de necrosis celular, en los tejidos pancreáticos de ratones de diferentes grupos experimentales (Figura 4D). La cuantificación de la expresión de caspasa-3 mostró que el nivel de expresión de la proteína caspasa-3 en los tejidos pancreáticos del grupo PI V aumentó significativamente, y la diferencia fue estadísticamente significativa (p < 0,001). Los niveles de expresión de la proteína se cuantificaron y normalizaron al control interno GapDH (Figura 4E). Además, las suspensiones frescas de células acinares pancreáticas se marcaron con anexina V-FITC/PI y se analizaron mediante citometría de flujo. Se encontró que, en comparación con los otros grupos experimentales de ratones, el grupo PI V tuvo una tasa positiva significativamente mayor de muerte celular, lo cual fue estadísticamente significativo (p < 0,001) (Figura 4F,G).

El contenido de HMGB-1 en el suero periférico y el nivel de expresión de HMGB-1 en el tejido pancreático
Con el fin de investigar la relación entre la proteína HMGB-1 y la lesión pancreática, se realizó tinción y cuantificación inmunohistoquímica en los tejidos pancreáticos de ratones de cada grupo experimental. Hubo diferencia estadísticamente significativa entre el grupo experimental y el grupo control (p < 0,001) (Figura 5A,B). Se utilizó ELISA para medir los niveles de HMGB-1 en el suero de ratones de diferentes grupos experimentales. Los resultados mostraron que, en comparación con el grupo control, los niveles séricos de HMGB-1 fueron significativamente mayores en todos los grupos experimentales, observándose el nivel más alto en el grupo PI V, y la diferencia fue estadísticamente significativa (p < 0,001) (Figura 5C). Además, el análisis de Western blot detectó una expresión elevada de la proteína HMGB-1 en los tejidos pancreáticos de ratones en todos los grupos experimentales, con diferencias estadísticamente significativas en comparación con el grupo control (p < 0,001) (Figura 5D,E).

Figura 1: Diagrama de flujo experimental. Día 2 y Día 3: Inyección intraperitoneal. Día 4: El experimento de campo abierto se inició después de 12 h de la última inyección intraperitoneal. Día 5: Eutanasia 36 h después de la inyección intraperitoneal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Cambios macroscópicos en el modelo de ratones PI. (A) Se representa el gráfico de trayectoria de movimiento en tiempo real de los ratones. (B) La distancia total de movimiento dentro de cada período de monitoreo para diferentes grupos experimentales de ratones. (C) El porcentaje de tiempo de inmovilidad dentro de cada período de monitoreo para diferentes grupos experimentales de ratones. (D,E) Se analizó la distancia total de movimiento y el porcentaje de tiempo de inmovilidad durante 15 min para ratones de diferentes grupos experimentales. (F) Se muestra el valor D que representa el peso de los ratones antes y después del proceso de modelado. (G) Se observó la supervivencia de 10 ratones en cada grupo durante los 7 días siguientes a la inyección intraperitoneal. Los datos se expresan como medias ± SEM, n = 4. "ns" denota no significativo, *P < 0.05, ****P < 0.001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Cambios patológicos en la pancreatitis de ratones entre diferentes grupos experimentales. (A) Las secciones histológicas teñidas con H&E del tejido pancreático de los ratones en diferentes grupos experimentales (secciones de tejido pancreático incluidas en parafina teñidas con hematoxilina y eosina, aumentos de 100 veces y barras de escala de 200 μm, y 400 veces y barras de escala de 50 μm, respectivamente. Las flechas largas amarillas indican islotes; flechas largas rojas indican células acinares; flechas largas de color marrón indican vasos sanguíneos; flechas largas azules indican conductos). (B) Cálculo de la relación entre el peso pancreático y el peso corporal en ratones. (C) Puntuación patológica del páncreas de ratones. (D,E) Detección de los niveles séricos de amilasa y lipasa en ratones. (De F a G) Medición ELISA de los niveles séricos de TNF-α e IL-6 en ratones. H) Evaluación del nivel del PCT. Los datos se expresan como medias ± SEM, n = 4. "ns" denota no significativo, *P < 0.05, ****P < 0.001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Apoptosis del tejido pancreático en ratones. (A) Se obtuvieron imágenes representativas de la tinción con TUNEL a partir de secciones de parafina pancreática de ratones e imágenes de área ampliada. (400x, barra de escala 50 μm, amarillo parduzco son células positivas). (B,C) Análisis cuantitativo del valor de la escala de grises por unidad de área de secciones de tejido pancreático de ratones teñidas con TUNEL y el porcentaje de células muertas teñidas positivamente. (D) El nivel de expresión de caspasa-3 en el tejido pancreático se detectó mediante Western blot. (E) Cuantificación de la expresión de caspasa-3 en tejido pancreático. (F) Se empleó la citometría de flujo para evaluar el grado de muerte celular en células acinares pancreáticas de ratones. (G) Enumeración de células muertas en etapa tardía en células acinares pancreáticas de ratón. Los datos se expresan como medias ± SEM, n = 4. "ns" denota no significativo, *P < 0.05, ****P < 0.001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Expresión de HMGB-1 en tejido pancreático de ratones. (A) Imágenes representativas e imágenes ampliadas (x400, barra de escala de 50 μm) de tinción inmunohistoquímica de HMGB-1 en secciones pancreáticas. El color amarillo parduzco indica células positivas (n = 4). (B) El porcentaje de células HMGB-1 positivas en secciones de tejido pancreático (n = 24). (C) El nivel de HMGB-1 en el suero de ratón (n = 4). (D,E) Se realizó un Western blot para detectar el nivel de expresión de HMGB-1 en el tejido pancreático y obtener los resultados de la cuantificación (n = 4). Los datos se expresan como medias ± SEM, "ns" denota no significativo, *P < 0,05, ****P < 0,001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura complementaria 1: Lesión orgánica múltiple en el modelo de ratones del grupo PI V. (A) Se analizaron imágenes representativas de los cambios histológicos en los tejidos del páncreas, los pulmones, el hígado y los riñones recogidas de los ratones del grupo CON y PI V mediante tinción H&E (aumento de 200x, barra de escala de 50 μm). Las alteraciones patológicas asociadas a la necrosis de células acinares se indican con flechas negras. Las flechas amarillas indican cambios patológicos caracterizados por hemorragia intersticial y edema en los alvéolos. El edema y la necrosis de los hepatocitos se indican con flechas verdes. Los cambios patológicos relacionados con la hemorragia glomerular se marcan con flechas rojas. (B) El cálculo de las puntuaciones histológicas se realizó en tejidos de páncreas, pulmón, hígado y riñón obtenidos de ratones del grupo CON y del grupo PI V. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla complementaria 1: Protocolo de inyección intraperitoneal. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla complementaria 2: Criterios de puntuación patológica para la gravedad de la pancreatitis. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

En la actualidad, existe una falta de medios efectivos para mejorar la alta tasa de mortalidad en pacientes con pancreatitis aguda grave. Es crucial investigar la eficacia de los fármacos para mejorar los mecanismos de estabilidad inmunitaria. Existe una necesidad urgente de un modelo animal ideal para la pancreatitis aguda grave. Los ratones con un fondo genético C57BL/6J se utilizan ampliamente en la investigación biomédica, incluidos los estudios sobre la fisiopatología de la SAP. Más de 70 años de diferenciación genética en ratones B6J han dado lugar a la deleción espontánea de varios exones¹⁵, lo que conduce a una reducción de la sensibilidad a la lesión pancreática inducida por la Caerulein¹⁶. Además, los modelos animales existentes de pancreatitis aguda tienen limitaciones, como el trauma quirúrgico o la aplicabilidad solo a animales más grandes, lo que dificulta las investigaciones científicas que utilizan estos modelos. Por lo tanto, es muy valioso establecer un modelo animal estable, eficiente y conveniente utilizando esta cepa genética específica.

La ceruleína es un análogo de la colecistoquinina que induce daño en el tejido pancreático al causar una obstrucción relativa del líquido digestivo pancreático y la secreción de enzimas a través de inyecciones de alta frecuencia en un corto período de tiempo cuando los ratones han ayunado y almacenado cantidades suficientes de líquido digestivo¹⁷. El LPS es el componente principal que se encuentra en las paredes celulares bacterianas y puede causar MODS y SIRS en ratones¹⁸. Un estudio previo demostró que la combinación de inyecciones de caeruleína a diferentes frecuencias con dosis variables de LPS administradas por inyección intraperitoneal indujo cambios patológicos similares observados en el SAP humano^19,20. Este estudio utilizó un enfoque no invasivo para inducir diversos grados de lesión pancreática mediante la combinación de diferentes frecuencias de inyecciones de caeruleína con diferentes dosis de LPS administradas intraperitonealmente en ratones. Asegurar una absorción uniforme por el peritoneo fue crucial durante el desarrollo del protocolo. Para cumplir con este requisito, es crucial seguir estrictamente los pasos de la inyección intraperitoneal para garantizar un control preciso sobre la administración de cada fármaco. Además, el frotamiento suave y la aplicación de una presión adecuada en el lugar de la inyección con un hisopo de algodón estéril después de cada inyección de medicamento son esenciales para una distribución uniforme del medicamento en toda la cavidad peritoneal. Además, la colocación exacta y precisa de la cabeza del alfiler en la cavidad peritoneal, con la aguja apuntando hacia la zona central de la parte superior del abdomen, es de suma importancia. Se debe realizar una capacitación previa para permitir que los operadores perciban con precisión cualquier ausencia de resistencia al insertar la aguja en la cavidad abdominal. La utilización de una bomba de infusión microcuantitativa en lugar de la operación manual podría mejorar la calidad de la inyección de medicamentos; Desafortunadamente, esto no se implementó en este estudio. Sin embargo, mediante el empleo de diferentes esquemas de inyección, inducimos diversos grados de lesión pancreática y observamos efectivamente diferencias en la lesión pancreática causada por diferentes frecuencias y dosis bajo condiciones técnicas idénticas inducidas por Caerulein combinada con inyecciones de LPS. Esto proporciona información valiosa para el uso futuro de Caerulein en modelos animales no invasivos para la inducción de pancreatitis aguda grave.

La combinación de caeruleína y LPS dio lugar a niveles significativamente elevados de amilasa y lipasa sérica, aumento del peso pancreático y cambios histológicos, incluida la infiltración extensa de células inflamatorias, edema de células acinares pancreáticas, necrosis y hemorragia, como lo demuestra la tinción con hematoxilina y eosina (HE). Además, con una dosis creciente de LPS, los cambios patológicos en el páncreas se hicieron más pronunciados. Sin embargo, cabe destacar que no hubo diferencias perceptibles en las puntuaciones de patología pancreática entre los grupos PI IV y PI V, mientras que la extensión de la necrosis de las células del tejido pancreático fue más pronunciada en el grupo PI III en comparación con el grupo PI IV. Esta observación sugiere que la frecuencia de dosificación de Caerulein puede servir como un factor primario que contribuye a la lesión pancreática, mientras que el LPS exacerba su progresión, lo que conduce a daño inflamatorio sistémico^18,21. HMGB-1 es una proteína que funciona dependiendo de su localización²². La HMGB-1 extracelular actúa como una proteína involucrada en las señales de alerta de inflamación y está estrechamente asociada con la gravedad de la pancreatitis aguda 23,24,25. En este estudio, los niveles séricos de HMGB-1 en ratones de todos los grupos experimentales fueron significativamente más altos en comparación con el grupo de control, siendo el grupo PI V el que mostró el aumento más significativo. Los experimentos de inmunohistoquímica y electroforesis de proteínas también confirmaron la alta expresión de HMGB-1 en el tejido pancreático. Esta importante proteína puede servir como diana terapéutica para inhibir la tormenta inflamatoria en la pancreatitis aguda grave.

En resumen, es crucial desarrollar un modelo no invasivo, simple y fácil de realizar de SAP en ratones. En este protocolo experimental, la inducción de lesión pancreática mediante Caerulein combinada con LPS es fiable y eficaz. Mediante la administración de Caerulein por vía intraperitoneal durante diez días consecutivos a una dosis de 50 μg/kg, seguida de una única inyección intraperitoneal de 15 mg/kg de LPS, se puede establecer un modelo animal de SAP estable, fiable, rentable y eficiente.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
20&veces; Solución de reparación de antígeno de ácido cítrico (pH 6.0)	Wuhan servicebio Technology Co., Ltd, China	G1202-250 ml
Amilasa	Mindray, China
Anexina V-FITC/PI	Wuhan servicebio Technology Co., Ltd, China	G1511	diluido a 1:20
Anti-HMGB1 Rabbit pAB	Wuhan servicebio Technology Co., Ltd, China	GB11103	diluido a 1:1800
BCA kit de detección cuantitativa de proteínas Wuhan	servicebio Technology Co., Ltd, China	G2026-200T
BD FACSCanto II Citómetro de flujo	BD Life Sciences, San José, CA, 95131, EE. UU.	BD FACSCanto ii
BSA	Wuhan servicebio Technology Co., Ltd, China	GC305010-100g
C57BL / 6J	Cavion Experimental Animal Co., Changzhou, China		número de licencia SCXY (Su) 2011– 0003
Cerúletida	MCE, Nueva Jersey, EE. UU.	17650-98-5	50 µ g/kg
Generador de imágenes de quimioluminiscencia	Cytiva CO., LTD.; Solución
(Polvo seco pH 6.0)	Wuhan servicebio Technology Co., Ltd, China	G1201-5 L
Colagenasa IV	Wuhan servicebio Technology Co., Ltd, China	GC305014	0,5 mg / ml DAB
(SA-HRP) Kit de detección de apoptosis de células de túnel	Wuhan servicebio Technology Co., Ltd, China	G1507-100 T
Dimension EXL con sistema químico integrado LM	Siemens Healthcare Diagnostics Inc. Brookfield, EE. UU	YZB / EE. UU. 8311-2014
Desarrollador ECL	Wuhan servicebio Technology Co., Ltd, China
Colorante de eosina (soluble en alcohol)	Wuhan servicebio Technology Co., Ltd, China	G1001-100 ml
EthoVision XT	Noldus, Países Bajos
IgG de cabra etiquetada con FITC IgG	Wuhan servicebio Technology Co., Ltd, China	GB22303	diluido a 1:50
Analizador de células sanguíneas completamente automático	Zybio Inc. China	Zybio-Z3 CRP
GapDH	Wuhan servicebio Technology Co., Ltd, China	GB11103	diluido a 1:1500
Solución de retorno de azul de hematoxilina	Wuhan servicebio Technology Co., Ltd, China	G1040-500 ml
Solución de diferenciación de hematoxilina	Wuhan servicebio Technology Co., Ltd, China	G1039-500 ml
Colorante de hematoxilina	Wuhan servicebio Technology Co., Ltd, China	G1004-100 ml
HMGB-1 ELISA kits	njjcbio Co., Ltd, China
HOMOGENEIZADOR	Wuhan servicebio Technology Co., Ltd, China	KZ-III-F;
IgG anti-conejo de cabra con etiqueta HRP	Wuhan servicebio Technology Co., Ltd, China	GB23303	diluido a 1:1500
IL-6 ELISA kits	Wuhan servicebio Technology Co., Ltd, China	GEM0001
Lipasa	Mindray, China
Lipopolisacárido	Wuhan servicebio Technology Co., Ltd, China	GC205009	15 mg / kg
Centrífuga de alta velocidad de baja temperatura	Changsha Pingfan Apparatus& Instrument Co., Ltd., China	TGL-20M
líquido de ruptura de membrana	Wuhan servicebio Technology Co., Ltd, China	G1204
microtomo	Jinhua Craftek Instrument Co., Ltd.; China	CR-601ST
Malla de nailon	Wuhan servicebio Technology Co., Ltd, China		200-mesh
de detección de apoptosis celular TUNEL de un solo paso (método de tinción DAB)	Wuhan servicebio Technology Co., Ltd, China	G1507-100T
Máquina de inclusión de tejidos de parafina	PRECISION MEDICAL INSTRUMENTS CO., LTD; Changzhou, China	PBM-A
Aparato de secado de tejidos patológicos	PRECISION MEDICAL INSTRUMENTS CO., LTD; Changzhou, China	PHY-III
Solución salina tamponada con fosfato	Wuhan servicebio Technology Co., Ltd, China	G4202-100ML
PMSF	Wuhan servicebio Technology Co., Ltd, China	G2008-1 ml
Microscopio de fluorescencia positiva	Olympus Corporation, Tokio, Japón	BX53
Pro Calcitonina	Mindray, China
Membrana de PVDF	Millipore, EE. UU.		0.22 µ m
RIPA	Wuhan servicebio Technology Co., Ltd, China	G2002-100 ml
SDS-PAGE	Beyotime Biotechnology, China	P0012A
TNF-α Kits ELISA	Wuhan servicebio Technology Co., Ltd, China	GEM0004
Baño de agua ultrasónico	DONGGUAN KQAO ULTRASONIC EQUIPMENT CO., LTD.; China	KQ-200KDE
Mezclador de hidromasaje	SCILOGEX; Estados Unidos