Artículo de método

Aislamiento y criopreservación de células mononucleares de sangre periférica humana altamente viables a partir de sangre total: una guía para principiantes

DOI:

10.3791/66794

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25 de octubre de 2024

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1Division of Cardiology, Department of Medicine, University of California San Diego, 2Department of Medical Biochemistry, Amsterdam Immunity and Infection: Inflammatory diseases; Amsterdam Cardiovascular Sciences: Atherosclerosis and Ischemic Syndrome, Amsterdam UMC location University of Amsterdam, 3Department of Cellular and Molecular Medicine, University of California San Diego, 4Division of Clinical Immunology & Rheumatology, Department of Medicine, Heersink School of Medicine, University of Alabama at Birmingham, 5Comprehensive Arthritis, Musculoskeletal, Bone and Autoimmunity Center, Heersink School of Medicine, University of Alabama at Birmingham, 6Department of Medicine, University of California San Diego

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo presenta una guía accesible para recolectar, almacenar y descongelar células mononucleares de sangre periférica adecuada para análisis posteriores y flujos de trabajo como la citometría de flujo y la secuenciación de ARN. También se muestran las colecciones de pelajes de plasma y buffy.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se utilizan habitualmente en la investigación biomédica sobre el sistema inmunitario y su respuesta a enfermedades y patógenos. Este protocolo detallado describe el equipo, los suministros y los pasos para aislar, criopreservar y descongelar PBMC de alta calidad y altamente viables a partir de células sanguíneas completas adecuadas para aplicaciones posteriores como la citometría de flujo y la secuenciación de ARN. También se describen los protocolos para el procesamiento de plasma y capa leucocitaria de la sangre total en paralelo y simultáneamente con PBMC. Este protocolo paso a paso fácil de seguir, que utiliza la centrifugación en gradiente de densidad para aislar las PBMC, va acompañado de una lista de verificación de suministros, equipos y pasos de preparación. Este protocolo es adecuado para personas con experiencia previa con técnicas de laboratorio y puede implementarse en laboratorios clínicos o de investigación. La viabilidad celular de alta calidad y la secuenciación del ARN fueron el resultado de PBMC recopilados por operadores sin experiencia previa en el laboratorio utilizando este protocolo.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo demuestra un método y un flujo de trabajo accesibles para el aislamiento de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de sangre completa. Este protocolo está especialmente dirigido a técnicos de investigación noveles, estudiantes y personal de laboratorio clínico con el objetivo de facilitar la recolección y criopreservación de PBMCs sin suponer una formación previa en técnicas de laboratorio.

Este protocolo utiliza la centrifugación para separar los componentes de la sangre total por densidad. La sangre total consta de cuatro componentes principales enumerados en orden decreciente de densidad: glóbulos rojos/eritrocitos (~45% del volumen), glóbulos blancos (<1% del volumen), plaquetas (<1% del volumen) y plasma (~55% del volumen)1,2,3,4,5,6. Los glóbulos blancos se pueden subdividir en dos categorías en función de las características de sus núcleos: redondos o multinucleados6. Las PBMC se definen como glóbulos blancos con núcleos redondos y constan de los siguientes tipos de células: linfocitos (linfocitos T, linfocitos B, linfocitos NK), linfocitos dendríticos y monocitos6. Los glóbulos blancos multinucleados incluyen granulocitos, que consisten en los siguientes tipos de células: neutrófilos, basófilos y eosinófilos6. Los glóbulos blancos multinucleados son más densos que los PBMC6. Las densidades de cada componente de la sangre total se detallan en la Tabla 1.

En este protocolo, la sangre entera se recolecta en tubos de centrifugación en gradiente de densidad. Estos tubos contienen un medio de gradiente de densidad preenvasado que tiene una densidad de 1,077 g/mL. Después de la centrifugación, las células más densas, incluidos los glóbulos blancos multinucleados y los eritrocitos, se separan de las PBMC y las plaquetas por el medio de gradiente de densidad (Figura 1A)6,7. A continuación, se recoge, se lava y se centrifuga la PBMC y la fracción plaquetaria para eliminar las plaquetas. Los PBMC purificados resultantes se recogen y almacenan a -80 °C o en nitrógeno líquido. Las PBMC criopreservadas pueden descongelarse de forma viable y utilizarse directamente en análisis posteriores o procesarse adicionalmente para aislar tipos de células componentes específicas.

Este protocolo se ha optimizado para la secuenciación de ARN de alta calidad a partir de PBMC altamente viables. En este artículo, se aislaron y criopreservaron PBMC de pacientes en una clínica ambulatoria. Posteriormente, los monocitos se aislaron de PBMC mediante FACS y se analizaron mediante secuenciación de ARN. Sin embargo, el protocolo puede adaptarse ampliamente a otras necesidades experimentales como el cultivo celular, la edición de genes, los estudios funcionales ex-vivo, los análisis de células individuales, el fenotipado por citometría de flujo o citometría por tiempo de vuelo, el aislamiento de ADN/ARN o proteínas, los portaobjetos para inmunohistoquímica, entre otros 8,9,10,11,12,13,14,15, 16,17,18.

Además de la recolección de PBMC de los tubos de centrifugación en gradiente de densidad, este protocolo revisa cómo recolectar plasma y capa leucocitaria mediante centrifugación usando un tubo de EDTA. Después de la centrifugación, la sangre entera se separa en plasma, eritrocitos y una fina capa de interfaz denominada capa leucocitaria que contiene leucocitos (Figura 1B)6. El pelaje leucocitario se utiliza habitualmente para la extracción de ADN y los posteriores análisis genómicos19,20. La capa de plasma contiene los componentes libres de células de la sangre total y puede utilizarse para ensayos de biomarcadores 21,22.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El protocolo del estudio fue aprobado por el Programa de Protección Humana de UCSD y KUMC y se ajusta a la Declaración de Helsinki. Todas las personas dieron su consentimiento informado para la participación y la recolección de sangre.

1. Procesamiento y criopreservación de PBMC

  1. Un día antes de la recolección de sangre, imprima la lista de verificación de materiales y reactivos enumerados en la Tabla 2 y prepare y etiquete en consecuencia.
    NOTA: Este protocolo fue diseñado para la recolección de tubos de centrifugación de gradiente de 6 densidades. Cada tubo produce aproximadamente 12 millones de PBMC, de los cuales aproximadamente el 50% y el 20% serán linfocitos vivos y monocitos respectivamente. Escale en consecuencia para las necesidades experimentales. Tenga en cuenta que el número absoluto de células puede diferir significativamente entre pacientes o condiciones de tratamiento.
  2. Utilizando la técnica de flebotomía estándar, recoja sangre completa en 6 tubos de centrifugación en gradiente de densidad y 1 tubo de EDTA hasta que se llene, aproximadamente 6 mL de volumen.
    NOTA: Si se requieren muestras de varios pacientes o condiciones de tratamiento, los tubos recolectados pueden almacenarse hasta 4 horas y luego procesarse simultáneamente.
  3. Después de la recolección, centrifugar todos los tubos a 1.800 x g durante 20 minutos a temperatura ambiente.
    NOTA: Consulte el Video Suplementario 1 para obtener una demostración de cómo operar una centrífuga.
  4. Después de la centrifugación, abra con cuidado el tubo de centrifugación de gradiente de densidad. Utilice una pipeta de transferencia para eliminar y desechar la capa amarilla translúcida que contiene plasma. No moleste la capa nebulosa de células directamente sobre el medio de gradiente de densidad. Peca de precavido, dejando el exceso de plasma en lugar de desechar las PBMC. Repita para todos los tubos.
    NOTA: Después de la centrifugación del tubo que contiene el medio de gradiente de densidad, el plasma y los PBMC estarán por encima del medio de gradiente de densidad; Los eritrocitos y granulocitos se asentarán en el fondo. Consulte la Figura 1A para obtener una visualización.
  5. Con una nueva pipeta de transferencia, pipetee suavemente el volumen restante que contiene células y plasma residual en cada tubo varias veces por encima del medio de gradiente de densidad.
  6. Después de la resuspensión, pipetee el contenido resuspendido del tubo en un tubo cónico de 50 ml etiquetado. Repita para todos los tubos.
  7. Vierta la solución 1 (medio RPMI) en el tubo de 50 mL hasta que alcance la línea de 50 mL.
  8. Repita los pasos 1.4 a 1.7 para cada paciente o condición de tratamiento según sea necesario.
    NOTA: Asegúrese de que no se mezclen diferentes muestras y utilice una pipeta de transferencia nueva para evitar la contaminación.
  9. Centrifugar el tubo de 50 ml a 300 x g durante 10 min a temperatura ambiente.
    NOTA: El protocolo de recolección de plasma y leucemia detallado en la Sección 2 puede completarse durante este tiempo.
  10. Deseche la mayor cantidad posible de sobrenadante. Golpee según sea necesario para eliminar las gotas residuales.
    NOTA: Después de la centrifugación, el pellet contiene PBMC y el sobrenadante contiene plaquetas y plasma residual.
  11. Vierta un tubo de 15 mL de solución 2 (medio RPMI + 12,5% de albúmina sérica humana + 1 μM de flavopiridol) en el tubo cónico de 50 mL que contiene el pellet de PBMC. Invierta suavemente el tubo para volver a suspender el pellet de celda.
  12. Aspirar 15 mL de solución 3 (medio RPMI + 11,25% albúmina sérica humana + 1 μM de flavopiridol + 10% DMSO) con una pipeta de transferencia. Agregue gota a gota al tubo de 50 ml.
    NOTA: La solución 3 contiene DMSO, que es tóxico para las células a temperatura ambiente. No agregue la Solución 3 hasta que esté lista para ser procesada inmediatamente.
  13. Invierta el tubo suavemente 3 veces para mezclar.
  14. Llene cada criovial preetiquetado y preenfriado con 1 mL de PBMC utilizando una pipeta de dispensación múltiple.
    NOTA: Consulte el Video complementario 2 para ver una demostración de cómo operar una pipeta multidosificación.
  15. Coloque los crioviales dentro de un recipiente de congelación preenfriado. A continuación, coloque el recipiente en un congelador a -80 °C.
  16. Repita los pasos 1.9 a 1.13 para cada paciente o condición de tratamiento según sea necesario.
  17. Mantenga los crioviales dentro del recipiente de congelación durante un mínimo de 12 h, luego transfiéralos a una caja de almacenamiento etiquetada a -80 °C.
    NOTA: Alternativamente, transfiera los crioviales congelados a nitrógeno líquido (<-135 °C) para su almacenamiento a largo plazo.

2. Procesamiento de plasma y capa leucocitaria de tubos de EDTA

  1. Centrifugar a 1.800 x g durante 10 min a temperatura ambiente.
    NOTA: Después de la centrifugación, la capa superior consta de plasma, la inferior contiene eritrocitos y la interfaz será la capa leucocitaria. Consulte la Figura 1B para ver una visualización.
  2. Con una pipeta de transferencia nueva, extraiga la mayor cantidad de plasma posible sin alterar la capa de capa leucocitaria. A continuación, dispense alícuotas de 0,5 ml en crioviales premarcados. Aspire la capa de capa leucocitaria y transfiérala al criovial debidamente etiquetado.
    NOTA: Algunos plasmas y eritrocitos pueden contaminar la colección de pelaje leucitario.
  3. Repita el paso 2.2 para cada paciente o condición de tratamiento según sea necesario.
  4. Después de la recolección, almacene los crioviales en un congelador a -80 °C.
    NOTA: Alternativamente, almacene en nitrógeno líquido (<-135 °C) para almacenamiento a largo plazo.

3. Descongelación de PBMC

  1. Un día antes de descongelar, imprima una lista de verificación de los materiales y reactivos enumerados en la Tabla 3 y prepare y etiquete en consecuencia.
    NOTA: Este protocolo fue diseñado para la descongelación de 1 tubo de 1,5 mL que contiene 1 mL de PBMC. Cada tubo produce aproximadamente 2 millones de PBMC, de los cuales aproximadamente el 50% y el 20% serán linfocitos vivos y monocitos, respectivamente. Escale en consecuencia para las necesidades experimentales. Tenga en cuenta que el número absoluto de células puede diferir significativamente entre pacientes o condiciones de tratamiento.
  2. Transfiera los PBMC congelados del almacenamiento con hielo seco y descongele en una incubadora a 37 °C durante 4 minutos, o justo antes de la descongelación del último cristal de hielo.
    NOTA: Si se desea, se puede tomar una alícuota para el recuento de células y las mediciones de viabilidad, como se detalla en la Sección 4.
  3. Después de descongelar, agregue 1 mL de Solución 4 (PBS + 2 mM EDTA) a cada criovial. Luego, vierta el contenido en un tubo preetiquetado de 50 mL que contenga 10 mL de Solución 4 por cada tubo de PBMC descongelado. Toque para eliminar las gotas residuales.
  4. Coloque el filtro de células en el tubo vacío de 50 ml y luego vierta la suspensión de células a través del filtro de células.
    NOTA: Si es necesario, golpee ligeramente para romper la tensión superficial.
  5. Centrifugar cada tubo que contiene las células filtradas a 400 x g durante 7 min a temperatura ambiente.
  6. Después de la centrifugación, vierta el sobrenadante que contiene DMSO. Golpee según sea necesario para eliminar las gotas residuales.
  7. Vuelva a suspender el gránulo celular en el medio deseado apropiado para las necesidades experimentales posteriores (p. ej., medios de cultivo celular, cóctel de anticuerpos por citometría de flujo, etc.).

4. Recuento celular y viabilidad

  1. Inmediatamente después de descongelar las PBMC congeladas en el paso 3.2, pipetee 20 μL de células en un tubo de 1,5 mL. Agregue un volumen igual de solución de Trypan Blue al 0,4% y pipetee hacia arriba y hacia abajo suavemente 3-4 veces para mezclar.
  2. Con un contador de células automatizado, siga el protocolo del fabricante para contar las células y evaluar la viabilidad. Asegúrese de tener en cuenta el factor de dilución de 2.
    NOTA: Como se ha descrito en otro lugar, un hemocitómetro puede utilizarse como método alternativo para evaluar el recuento de células y su viabilidad23.

Resultados

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Después de la recolección y criopreservación de PBMC, se evaluó la viabilidad de PBMC, monocitos y linfocitos descongelados de 56 muestras únicas mediante citometría de flujo utilizando los reactivos enumerados en la Tabla 4 siguiendo las instrucciones del fabricante (Figura 2A-F). Se logró una viabilidad media ± SD de PBMCs, monocitos y linfocitos de 94 ± 4,0%, 98 ± 1,1% y 93 ± 5,6%, respectivamente (Figura 2G). La medición de la viabilidad por exclusión de azul de tripano arrojó una viabilidad media de 88 ± 7,5% y un recuento de células de 2,3 x 106 ± 1,9 x 106. El análisis de citometría de flujo también demostró que los monocitos vivos constituían el 17 ± el 5,9% y los linfocitos el 53 ± el 13,0% del total de PBMC.

Posteriormente, los monocitos se clasificaron a partir de PBMC descongelados de 59 muestras únicas mediante citometría de flujo y se enviaron para su preparación en la biblioteca y secuenciación del ARN, como se describe en otra parte24. Se logró un recuento medio ± secuencia total de SD de 18,0 ± 16,3 millones con un contenido de lectura del 93 ± 6,3% y un contenido de GC del 49,6 ± 1,4% (Figura 3A-B). Se encontró un porcentaje medio de lecturas mapeadas de ± SD de 88 ± 3,6% con un subconjunto de 56 muestras únicas. Estos parámetros demuestran que los operadores con cualquier nivel de formación en laboratorio pueden obtener PBMC altamente viables y adecuados para aplicaciones posteriores, incluida la secuenciación de ARN de alta calidad, utilizando este protocolo.

ComponenteDensidadCita
PlasmaDe 1,022 g/mL a 1,026 g/mL1
Plaquetas<1,061 g/mL a >1,070 g/mL2
PBMC (en inglés)<1.077 g/mL6
Neutrófilos de baja densidad*<1.077 g/mL3
Granulocitos (neutrófilos*, basófilos y eosinófilos)>1.077 g/mL6
Eritrocitos1,11 g/mL4

Tabla 1: Componentes de la sangre total listados por orden decreciente de densidad.

Reagant/MaterialCantidad (por 6 tubos CPT y 1 tubo EDTA)PropinaDeclaraciones de precaución
Tubos CPT6Etiqueta de acuerdo con la identificación del paciente o de la muestra.
Tubo de EDTA1Etiqueta de acuerdo con la identificación del paciente o de la muestra.
Tubo cónico de 50 mL2Además de la identificación del paciente o de la muestra, etiquete 1 tubo para PBMC y 1 para desechos.
Crioviales39Etiquete 30 para PBMC, 8 para plasma EDTA y 1 para pelaje leuco. Es posible que no se utilicen todos los crioviales.
Sr. Frosty2Llene hasta la mitad con isopropanol y enfríe previamente durante la noche a -20 ° C.El isopropanol es un irritante inflamable. Manténgalo alejado de chispas / llamas. Evite inhalar y manipule con guantes y cuidado.
Flavopiridol100 μL de culata 1000XPara preparar un caldo de flavopiridol 1000X, suspenda 5 mg de flavopiridol en 1,14 mL de DMSO para una concentración de 10 mM. Alícuota 200 μL en recipientes individuales y luego congelar. Para usar, descongele las alícuotas individuales y diluya 1:10 en agua destilada libre de DNasa/RNasa, y luego úselo como una solución 1000X.El flavopiridol es un irritante. Manéjelo con guantes y cuidados.
Solución 150 mLRPMI Medio.
Para hacer 50 mL de solución madre, use 50 mL de RPMI Medium.
Solución 215 mLRPMI Medio + 12,5% Albúmina sérica humana + 1 μM de flavopiridol.
Para hacer 50 mL de solución madre, use 25 mL de medio RPMI + 25 mL de albúmina sérica humana + 50 μL de flavopiridol 1000X.		El flavopiridol es un irritante. Manéjelo con guantes y cuidados.
Solución 315 mLRPMI Medio + 11,25% Albúmina sérica humana + 1 μM de flavopiridol + 10% DMSO.
Para producir 50 mL de solución madre, use 22.5 mL de medio RPMI + 22.5 mL de HSA + 5 mL de DMSO + 50 μL de Flavopiridol 1000X.		El flavopiridol es un irritante y el DMSO es tóxico y se absorbe fácilmente a través de la piel. Manéjelo con guantes y cuidados.

Tabla 2: Lista de verificación de reactivos y materiales para preparar y etiquetar para la recolección y criopreservación de PBMC.

Reagant/MaterialCantidad (por alícuota de 1 mL de PBMC congelados)PropinaDeclaraciones de precaución
Solución 410 mLPBS + 2 mM EDTA

Para hacer 50 mL de solución madre, use 5 mL 10X PBS + 200 μL 0.5M EDTA + 44.8 mL de agua destilada sin DNasa/RNasa
Tubo cónico de 50 mL3Además de la identificación del paciente o de la muestra, etiquete 1 tubo para PBMC pre-filtrados, 1 para PBMC post-tensados y 1 para desechos. Llene el tubo etiquetado para PBMC previamente teñidas con 9 ml de solución, 4 ml de PBMC congeladas
Tubo de 1,5 ml1Para el recuento de células; etiqueta con el paciente o la identificación de la muestra
Solución de azul de tripano al 0,4%20 μLPara el recuento de células; se puede agregar al tubo de 1.5 mL antes de tiempo el día anterior.El azul de tripano es un carcinógeno. Manéjelo con guantes y cuidados.

Tabla 3: Lista de verificación de reactivos y materiales para preparar y etiquetar para descongelar y contar PBMC.

Reactivo/MaterialCantidad (por millón de celdas)
Mancha de vivo-muerto5 μL
Confianza Humana FcX5 μL
Anticuerpo CD35 μL
Anticuerpo CD195 μL
Anticuerpo CD565 μL
Anticuerpo CD66b5 μL
Anticuerpo HLA-DR5 μL
Anticuerpo CD145 μL
Anticuerpo CD162,5 μL
ARNina100 Unidades

Tabla 4: Tabla de reactivos para el aislamiento de monocitos de PBMCs por citometría de flujo.

Separación de componentes sanguíneos en diagrama de centrifugación en gradiente de densidad; plasma, PBMC, capas de capa leucocitaria.
Figura 1: Componentes de la sangre total separados por centrifugación en tubos de centrifugación en gradiente de densidad o EDTA. (A) La centrifugación de sangre total en tubos de centrifugación en gradiente de densidad da como resultado la separación de plasma, plaquetas y PBMC por encima del medio de gradiente de densidad con eritrocitos multinucleados y eritrocitos por debajo del medio de gradiente de densidad. (B) La centrifugación de sangre completa en tubos de EDTA da como resultado la separación del plasma en la capa superior, los eritrocitos en la capa inferior y la capa leucocitaria en la interfaz. Creado con Biorender.com. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Diagramas de dispersión de citometría de flujo; PBMC, monocitos, linfocitos; análisis de viabilidad, gráfico de tipo de celda.
Figura 2: Se evaluó la viabilidad de las PBMC criopreservadas descongeladas mediante tinción de flujo vivo/muerto y citometría de flujo. (A) Los desechos, marcados con un asterisco *, se excluyen de los PBMC mediante compuertas de dispersión frontal y lateral. (B) Análisis representativo vivo/muerto de PBMCs enteros (C) Los panmonocitos están clasificados como HLA-DR positivo y negativo para los siguientes antígenos de superficie marcados con FITC: CD3, CD19, CD56 y CD66b. (D) Análisis representativo vivo/muerto de monocitos. (E) Linfocitos activados por los siguientes antígenos de superficie marcados con FITC: CD3, CD19, CD56 y CD 66b. (F) Análisis representativo de linfocitos vivos/muertos. (G) Porcentaje de viabilidad de cada tipo de célula cuantificado a partir de 56 muestras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Gráficos de análisis de datos FastQC; Millones de secuencias frente a distribución de contenido GC alineable.
Figura 3: Calidad de secuenciación de ARN de monocitos clasificados a partir de PBMC criopreservadas. Se secuenciaron 56 muestras únicas y se generó una media ± 18,0 ± 16,3 millones de secuencias totales. (A) La alineación fue alta, con un 92,5% ± un 6,3% de las secuencias alineadas con el genoma de referencia. (B) El contenido de GC de estas secuencias fue de 49,6 ± 1,4%. Creado con FastQC25. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Vídeo complementario 1: Demostración de cómo utilizar la centrífuga Haga clic aquí para descargar este archivo.

Vídeo complementario 2: Demostración del funcionamiento de una pipeta multidosificador. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo para la recolección y criopreservación de PBMC ha sido implementado con éxito por personas con y sin capacitación previa en laboratorio de investigación. En nuestra aplicación, la secuenciación de FACS y ARN de monocitos altamente viables purificados a partir de PBMC almacenados dio como resultado secuencias de alta calidad.

Una de las principales fortalezas de este protocolo es su accesibilidad. La técnica presentada en el protocolo utiliza tubos preenvasados con un medio de gradiente de densidad sólida. Como resultado, la sangre entera se puede recolectar directamente en el tubo y luego procesarse inmediatamente para aislar las PBMC. Se necesita un número relativamente pequeño de soluciones prefabricadas y equipos especializados, lo que facilita la colaboración entre el laboratorio de investigación, donde se pueden preparar los reactivos, y el laboratorio clínico, donde se recogen y procesan las muestras. Los protocolos escritos y de vídeo están orientados a operadores de cualquier nivel de formación.

Si bien este protocolo utiliza sangre entera fresca para aislar PBMC y, por lo tanto, tiene un rendimiento esperado relativamente alto y una pureza del >90%, puede no ser adecuado para aplicaciones que requieren purezas excepcionalmente altas de >98%26,27. Además, los tubos de centrifugación en gradiente de densidad pueden ser costosos de obtener, especialmente si es necesario recolectar una gran cantidad de muestras.

Los métodos alternativos de recolección de PBMC incluyen el uso de un medio de gradiente de densidad líquida o la depleción inmunomagnética28,29. Brevemente, el primero implica la superposición de un medio de gradiente de densidad prefabricado bajo sangre entera heparinizada seguida de centrifugación. Este último utiliza anticuerpos marcados magnéticamente para marcar a los no PBMC, que luego se retienen en una columna magnética mientras que los PBMC no marcados pasan sin verse afectados.

En relación con el protocolo presentado, el uso de un medio de gradiente de densidad líquido es menos costoso y requiere mucho menos material debido a la falta de tubos de centrifugación en gradiente de densidad; El aislamiento de PBMC se puede realizar en un tubo estándar de 50 mL8. Sin embargo, esta técnica es más elaborada, tiene un tiempo de procesamiento más largo y puede estar sujeta a un mayor riesgo de error del usuario. La heparina debe añadirse con precisión para evitar la dilución excesiva y el medio de gradiente de densidad debe estratificarse cuidadosamente en las cantidades correctas para garantizar una buena separación de PBMC26.

En relación con el protocolo presentado, el uso de la depleción inmunomagnética ofrece un mayor rendimiento y pureza, un manejo reducido debido a la falta de centrifugación, un tiempo de procesamiento más rápido y requiere mucho menos material 30,31,32. Sin embargo, el principal inconveniente es que este método es el más costoso de los tres métodos descritos, especialmente a escala.

Si bien este protocolo es sólido, ciertos pasos críticos pueden requerir atención adicional. A lo largo del protocolo, asegúrese de que las muestras no se mezclen y se coloquen en los tubos debidamente etiquetados, especialmente cuando se trabaje con varios pacientes o afecciones simultáneamente. Para el paso 1.4, asegúrese de que no se descarte ningún PBMC; el exceso de plasma solo disminuirá la concentración de PBMC, que es menos crítica para mantener la viabilidad y la calidad de la muestra. Por otra parte, la presencia de precipitados en las PBMC recolectadas sugiere que se desprendieron piezas del medio del gradiente de densidad. Pipetea con más suavidad en el paso 1.5 para evitar este problema. En los pasos 1.10 y 3.6, asegúrese de que el pellet de celda centrífuga no se deseche. Trabajar rápidamente es crítico para los pasos 1.12 y 3.3, ya que la solución 3 contiene DMSO, que es tóxico para las células a temperatura ambiente33. También es importante tener en cuenta que se recomienda el almacenamiento de PBMC en nitrógeno líquido en lugar de almacenarlo a -80 °C. El almacenamiento a largo plazo a -80 °C se ha asociado con una disminución de la viabilidad celular y una expresión génica alterada34,35.

Este protocolo puede ser adaptado de acuerdo a las necesidades experimentales. La adición de flavopiridol, un inhibidor de la síntesis de ARN polimerasa y ARNm, en las soluciones 2 y 3 tiene como objetivo prevenir cualquier artefacto inducido por la manipulación y el estrés con la secuenciación de ARN36. Sin embargo, se puede omitir el flavopiridol si se desean estudios funcionales o ex vivo que utilicen PBMC.

El plasma recolectado de los tubos de EDTA se contaminará con EDTA, un agente quelante. Como resultado, el plasma de EDTA no es adecuado para ensayos que involucren coagulación o iones de calcio37,38. Si se desea, la capa de plasma en los tubos de medio de gradiente de densidad después de la centrifugación se puede recoger en el paso 1.4. Estos tubos contienen heparina sódica como anticoagulante, que puede eliminarse con la adición de heparinasa39. En particular, la heparina inhibe la transcriptasa inversa y la amplificación de la PCR, lo que hace que el plasma recolectado no sea adecuado para experimentos de PCR sin la adición de un agente bloqueante de la heparina40.

La capa leucocitaria recolectada de los tubos de EDTA no se almacena en una solución que contenga DMSO o flavopiridol. El DMSO es importante para reducir la formación de cristales de hielo y la muerte celular41. El flavopiridol es importante para la inhibición de la síntesis de ARN36. Por lo tanto, el pelaje leucocitario no es adecuado para análisis ex vivo y transcriptómicos. Si se desea, los pasos 1.6 a 1.15 se pueden realizar utilizando una capa de leucocitaria recolectada para maximizar la viabilidad celular e inhibir la síntesis de ARN.

Si bien este protocolo fue diseñado para la secuenciación de ARN, las posibles aplicaciones adicionales de las PBMC recolectadas y criopreservadas utilizando este protocolo incluyen cultivo celular, edición de genes, estudios funcionales ex vivo, análisis de células individuales, fenotipado por citometría de flujo o citometría por tiempo de vuelo, aislamiento de ADN/ARN o proteínas, portaobjetos para inmunohistoquímica, entre otros.

Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen intereses financieros o no financieros relevantes que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nos gustaría agradecer a los pacientes que ofrecieron voluntariamente su consentimiento, tiempo y donación de muestras de sangre. También agradecemos al Dr. Patrick Moriarty, Julie-Ann Dutton y Mark McClellen del Centro Médico de la Universidad de Kansas por su colaboración y por implementar este protocolo en un sitio remoto. CY ha recibido apoyo de investigación de la subvención 1K08HL150271 de los NIH.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
1000 y micro; L TipsGilson F174501Se necesitan aproximadamente 3 puntas por paciente/condición de tratamiento para PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Tubo de 15 mLBiopioneeerCNT-15Para contener Soluciones 2/3
2 necesarias por paciente/condición de tratamiento para PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
2 mL Cryovials GlobeScientific3012Se necesitan aproximadamente 40 crioviales por paciente/condición de tratamiento para PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
20 µ L ConsejosGilson F174201Para su uso en el conteo de células; el volumen necesario depende del método de conteo de células utilizado. Se necesita 1 punta por cada 1 mL de PBMC congelados no agrupados para descongelar
50 mL Tubo cónicoCEM Corporation50-187-7683Se necesitan 2 por paciente/condición de tratamiento para PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Se necesitan 3 por cada 1 mL de PBMC congelados no agrupados para descongelar
Anticuerpo CD14Biolegend325621
Anticuerpo CD16Biolegend360723
Anticuerpo CD19Biolegend363007
Anticuerpo CD3Biolegend300405
Anticuerpo CD56Biolegend318303
CD66b AnticuerpoBiolegend305103
Filtro de célulasBiolegend BiopioneeerDGN258367Se necesita 1 mL por 1 mL de PBMC congeladas no agrupadas para descongelar Tubo de
preparación de células mononucleares CPTBD Biosciences362753Se necesitan 6 tubos por paciente/condición de tratamiento para PBMC/Plasma/Buffy Coat
Collection Cryo Freezer BoxSouthern LabwareSB2CC-81Tiene capacidad para 81 tubos
1 necesario por paciente/condición de tratamiento para PBMC/Plasma/Buffy Coat
Collection Cryotube RackFisherbrand05-669-45Capacidad para 50 crioviales
DMSOInvitrogen15575020Se necesitan aproximadamente 2,5 mL por paciente/condición de tratamiento para PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Agua destilada sin DNasa/RNasaInvitrogen10977015Se necesitan aproximadamente 2 mL por paciente/condición de tratamiento para PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Se necesitan aproximadamente 9 mL por cada 1 mL de PBMC congelados que se van a descongelar
Tubos de EDTABD Biosciences366643Se necesita 1 tubo por paciente/condición de tratamiento para PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
FlavopiridolSigma-AldrichF3055-5MG
HLA-DR AnticuerpoBiolegend307609
Albúmina sérica humanaGeminiBio800-120Se necesitan aproximadamente 25 ml por paciente o condición de tratamiento para PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Human Trustain FcXBiolegend422301
IsopropanolSigma-AldrichW292912-1KG-KPara uso en la impresora de etiquetas Mr. Frosty
PhomemoM110-WH
Mancha de muertos vivosBiolegend423105
Mr. FrostyThermo Scientific5100-0001Tiene capacidad para 18 tubos.
Se necesitan 2 Mr. Frostys por paciente/condición de tratamiento para PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Pipeta MultidoseBrandtech705110
Puntas de pipeta multidosisBrandtech705744Se necesitan aproximadamente 3 puntas por paciente/condición de tratamiento para PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
P1000 PipetaGilsonF144059M
Pipeta P20Gilson F144056MPara su uso en el recuento de células; el volumen necesario depende del método de recuento de células utilizado.
Etiquetas de impresoraPhomemoPM-M110-3020Se necesitan aproximadamente 45 etiquetas por paciente/condición de tratamiento para PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Se necesitan aproximadamente 5 etiquetas por 1 mL de PBMC congelados sin agrupar para descongelar
EDTA sin ARNasa (0.5 M)InvitrogenAM9260GAproximadamente 40 µ Se necesita L por 1 mL de PBMC congeladas para descongelar
PBS sin RNasa (10X)InvitrogenAM9625Se necesita aproximadamente 1 mL por 1 mL de PBMC congeladas para descongelar
RNasinPromegaN2111
RPMI Corning10-040-CVSe necesitan aproximadamente 80 mL por paciente o condición de tratamiento para PBMC/Plasma/Buffy Coat
Collection Pipetas de transferenciaFisherbrand13-711-7MSe necesitan aproximadamente 5 por paciente/condición de tratamiento para PBMC/Plasma/Buffy Coat
Collection Soporte de tuboEndicott-Seymour14-781-15Tiene capacidad para hasta 80 tubos CPT/EDTA

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Physiology, Blood Plasma. , StatPearls Pubs. Treasure Island, Florida. (2018).">Mathew, J., Sankar, P., Varacallo, M. Physiology, Blood Plasma. , StatPearls Pubs. Treasure Island, Florida. (2018).
  2. The effect of thrombin on the density distribution of blood platelets: Detection of activated platelets in the circulation. Blood. 62 (2), 433-438 (1983).">Van Oost, B., Van Hien-Hagg, I. H., Timmermans, A. P., Sixma, J. J. The effect of thrombin on the density distribution of blood platelets: Detection of activated platelets in the circulation. Blood. 62 (2), 433-438 (1983).
  3. On the origin of low-density neutrophils. Journal of Leukocyte Biology. 107 (5), 809-818 (2020).">Hassani, M., et al. On the origin of low-density neutrophils. Journal of Leukocyte Biology. 107 (5), 809-818 (2020).
  4. Sorting cells by their density. PLOS ONE. 12 (7), e0180520(2017).">Norouzi, N., Bhakta, H. C., Grover, W. H. Sorting cells by their density. PLOS ONE. 12 (7), e0180520(2017).
  5. Blood volume analysis: A new technique and new clinical interest reinvigorate a classic study. JNMT. 35 (2), 55-63 (2007).">Manzone, T. A., Dam, H. Q., Soltis, D., Sagar, V. V. Blood volume analysis: A new technique and new clinical interest reinvigorate a classic study. JNMT. 35 (2), 55-63 (2007).
  6. The impact of food bioactives on health: In vitro and ex vivo models. , Springer. Cham. 161-167 (2015).">Kleiveland, C. R. The impact of food bioactives on health: In vitro and ex vivo models. , Springer. Cham. 161-167 (2015).
  7. Advances in biomarker detection: Alternative approaches for blood-based biomarker detection. Adv Clin Chem. 92, 141-199 (2019).">Rosado, M., et al. Advances in biomarker detection: Alternative approaches for blood-based biomarker detection. Adv Clin Chem. 92, 141-199 (2019).
  8. Multiple sclerosis: Methods and Protocols. 1304, Humana Press. New York, NY. 53-61 (2016).">Riedhammer, C., Halbritter, D., Weissert, R. Multiple sclerosis: Methods and Protocols. 1304, Humana Press. New York, NY. 53-61 (2016).
  9. In vitro Culture of Human PBMCs. Bio Protoc. 3 (3), e322(2013).">Panda, S. K., Ravindran, B. In vitro Culture of Human PBMCs. Bio Protoc. 3 (3), e322(2013).
  10. Whole blood vs PBMC: Compartmental differences in gene expression profiling exemplified in asthma. Allergy Asthma Clinic Immol. 15, 67(2019).">He, D., et al. Whole blood vs PBMC: Compartmental differences in gene expression profiling exemplified in asthma. Allergy Asthma Clinic Immol. 15, 67(2019).
  11. Lymphocyte enrichment using CD81-targeted immunoaffinity matrix. Cytometry Part A. 91 (1), 62-72 (2017).">Pelák, O., et al. Lymphocyte enrichment using CD81-targeted immunoaffinity matrix. Cytometry Part A. 91 (1), 62-72 (2017).
  12. Impact on in-depth immunophenotyping of delay to peripheral blood processing. Clin Exp Immunol. 217 (2), 119-132 (2024).">Higdon, L. E., et al. Impact on in-depth immunophenotyping of delay to peripheral blood processing. Clin Exp Immunol. 217 (2), 119-132 (2024).
  13. Photoactivatable aptamer-CRISPR nanodevice enables precise profiling of interferon-gamma release in humanized mice. ACS Nano. 18 (4), 3826-3838 (2024).">Liu, Z., et al. Photoactivatable aptamer-CRISPR nanodevice enables precise profiling of interferon-gamma release in humanized mice. ACS Nano. 18 (4), 3826-3838 (2024).
  14. Single-cell transcriptome revealed dysregulated RNA-binding protein expression patterns and functions in human ankylosing spondylitis. Front Med. 11, 1369341(2024).">Ren, Z., Li, C., Wang, J., Sui, J., Ma, Y. Single-cell transcriptome revealed dysregulated RNA-binding protein expression patterns and functions in human ankylosing spondylitis. Front Med. 11, 1369341(2024).
  15. Systematic immune cell dysregulation and molecular subtypes revealed by single-cell-RNA-seq of subjects with type 1 diabetes. Genome Med. 16, 45(2024).">Honardoost, M. A., et al. Systematic immune cell dysregulation and molecular subtypes revealed by single-cell-RNA-seq of subjects with type 1 diabetes. Genome Med. 16, 45(2024).
  16. Possible role of lncRNAs in amelioration of Parkinson's disease symptoms by transplantation of dopaminergic cells. NPJ Parkinsons Dis. 10, 56(2024).">Amini, A., Esmaeili, F., Golpich, M. Possible role of lncRNAs in amelioration of Parkinson's disease symptoms by transplantation of dopaminergic cells. NPJ Parkinsons Dis. 10, 56(2024).
  17. Sars-Cov-2 spike induces intestinal barrier dysfunction through the interaction between CEACAM5 and Galectin-9. Front Immunol. 15, e1303356(2024).">Luo, Y., et al. Sars-Cov-2 spike induces intestinal barrier dysfunction through the interaction between CEACAM5 and Galectin-9. Front Immunol. 15, e1303356(2024).
  18. Immune cell alterations and PI3k-PKB pathway suppression in patients with allergic rhinitis undergoing sublingual immunotherapy. Adv Ther. 41 (2), 777-791 (2024).">Zhang, X., Wu, G., Ma, X., Cheng, L. Immune cell alterations and PI3k-PKB pathway suppression in patients with allergic rhinitis undergoing sublingual immunotherapy. Adv Ther. 41 (2), 777-791 (2024).
  19. Exploring mitochondrial DNA copy number in circulating cell-free DNA and extracellular vesicles across cardiovascular health status: A prospective case-control pilot study. FASEB J. 38 (10), e23672(2024).">Rucci, C., et al. Exploring mitochondrial DNA copy number in circulating cell-free DNA and extracellular vesicles across cardiovascular health status: A prospective case-control pilot study. FASEB J. 38 (10), e23672(2024).
  20. Buffy coat DNA Methylation Profile is Representative of Methylation Patterns in White Blood Cell Types in Normal Pregnancy. Front Bioeng Biotechnol. 9, e782843(2022).">Ghamrawi, R., et al. Buffy coat DNA Methylation Profile is Representative of Methylation Patterns in White Blood Cell Types in Normal Pregnancy. Front Bioeng Biotechnol. 9, e782843(2022).
  21. Plasma biomarker profiles in autosomal dominant Alzheimer's disease. Brain. 146 (3), 1132-1140 (2023).">Johansson, C., et al. Plasma biomarker profiles in autosomal dominant Alzheimer's disease. Brain. 146 (3), 1132-1140 (2023).
  22. Comparison of plasma lipoprotein composition and function in cerebral amyloid angiopathy and Alzheimer's disease. Biomedicines. 9 (1), 72(2021).">Bonaterra-Pastra, A., et al. Comparison of plasma lipoprotein composition and function in cerebral amyloid angiopathy and Alzheimer's disease. Biomedicines. 9 (1), 72(2021).
  23. Estimation of cell number by hemocytometry counting. Cold Spring Harb Protoc. (11), prot097980(2019).">Green, M. R., Sambrook, J. Estimation of cell number by hemocytometry counting. Cold Spring Harb Protoc. (11), prot097980(2019).
  24. Monosodium urate crystals regulate a unique JNK-dependent macrophage metabolic and inflammatory response. Cell Rep. 38 (10), e110489(2022).">Cobo, I., et al. Monosodium urate crystals regulate a unique JNK-dependent macrophage metabolic and inflammatory response. Cell Rep. 38 (10), e110489(2022).
  25. http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2015).">Andrews, S. Fastqc: A quality control tool for high throughput sequence data. , http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2015).
  26. Immune cell subsets and their gene expression profiles from human PBMC isolated by Vacutainer Cell Preparation Tube (CPT™) and standard density gradient. BMC Immunology. 16, 48(2015).">Corkum, C. P., et al. Immune cell subsets and their gene expression profiles from human PBMC isolated by Vacutainer Cell Preparation Tube (CPT™) and standard density gradient. BMC Immunology. 16, 48(2015).
  27. Delays during PBMC isolation have a moderate effect on yield but severely compromise cell viability. Clin Chem Lab Med. 60 (5), 701-706 (2022).">Golke, T., et al. Delays during PBMC isolation have a moderate effect on yield but severely compromise cell viability. Clin Chem Lab Med. 60 (5), 701-706 (2022).
  28. Isolation of whole mononuclear cells from peripheral blood and cord blood. Curr Protoc Immunol. 85 (1), 7.1.1-7.1.8 (2009).">Fuss, I. J., Kanof, M. E., Smith, P. D., Zola, H. Isolation of whole mononuclear cells from peripheral blood and cord blood. Curr Protoc Immunol. 85 (1), 7.1.1-7.1.8 (2009).
  29. Contribution of heptose metabolites and the cag pathogenicity island to the activation of monocytes/macrophages by Helicobacter Pylori. Front Immunol. 12, e632154(2021).">Faass, L., et al. Contribution of heptose metabolites and the cag pathogenicity island to the activation of monocytes/macrophages by Helicobacter Pylori. Front Immunol. 12, e632154(2021).
  30. Immunomagnetic bead separation of mononuclear cells from contaminating granulocytes in cryopreserved blood samples. Cryobiology. 59 (3), 366-368 (2009).">Preobrazhensky, S. N., Bahler, D. W. Immunomagnetic bead separation of mononuclear cells from contaminating granulocytes in cryopreserved blood samples. Cryobiology. 59 (3), 366-368 (2009).
  31. Low-density granulocyte contamination from peripheral blood mononuclear cells of patients with sepsis and how to remove it - A technical report. Front Immunol. 12, e684119(2021).">Schenz, J., Obermaier, M., Uhle, S., Weigand, M. A., Uhle, F. Low-density granulocyte contamination from peripheral blood mononuclear cells of patients with sepsis and how to remove it - A technical report. Front Immunol. 12, e684119(2021).
  32. Cellular stress assay in peripheral blood mononuclear cells: factors influencing its results. Int J Mol Sci. 23 (21), 13118(2022).">Tessema, B., Riemer, J., Sack, U., König, B. Cellular stress assay in peripheral blood mononuclear cells: factors influencing its results. Int J Mol Sci. 23 (21), 13118(2022).
  33. abc. Chen, X., Thibeault, S. 2013 35th Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society (EMBC), , IEEE. 6228-6231 (2013).
  34. The effects of storage temperature on PBMC gene expression. BMC Immunol. 17, 6(2016).">Yang, J., et al. The effects of storage temperature on PBMC gene expression. BMC Immunol. 17, 6(2016).
  35. Effects of long-term cryopreservation of PBMC on recovery of B cell subpopulations. J Immunol Methods. 495, e113081(2021).">Ticha, O., Moos, L., Bekeredjian-Ding, I. Effects of long-term cryopreservation of PBMC on recovery of B cell subpopulations. J Immunol Methods. 495, e113081(2021).
  36. Flavopiridol inactivates P-TEFb and blocks most RNA polymerase II transcription in vivo. J of Biol Chem. 276 (34), 31793-31799 (2001).">Chao, S. -H., Price, D. H. Flavopiridol inactivates P-TEFb and blocks most RNA polymerase II transcription in vivo. J of Biol Chem. 276 (34), 31793-31799 (2001).
  37. The role of ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) as in vitro anticoagulant for diagnostic purposes. Clin Chem Lab Med. 45 (5), 565-576 (2007).">Banfi, G., Salvagno, G. L., Lippi, G. The role of ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) as in vitro anticoagulant for diagnostic purposes. Clin Chem Lab Med. 45 (5), 565-576 (2007).
  38. Effects of heparin, citrate, and EDTA on plasma biochemistry of sheep: Comparison with serum. Res Vet Sci. 86 (1), 111-114 (2009).">Mohri, M., Rezapoor, H. Effects of heparin, citrate, and EDTA on plasma biochemistry of sheep: Comparison with serum. Res Vet Sci. 86 (1), 111-114 (2009).
  39. Heparin-mediated PCR interference in SARS-CoV-2 assays and subsequent reversal with heparinase I. J Virol Methods. 327, 114944(2024).">Edwards, K., et al. Heparin-mediated PCR interference in SARS-CoV-2 assays and subsequent reversal with heparinase I. J Virol Methods. 327, 114944(2024).
  40. Effects of heparin on polymerase chain reaction for blood white cells. J Clin Lab Anal. 13 (3), 133-140 (1999).">Yokota, M., Tatsumi, N., Nathalang, O., Yamada, T., Tsuda, I. Effects of heparin on polymerase chain reaction for blood white cells. J Clin Lab Anal. 13 (3), 133-140 (1999).
  41. Efficient long-term cryopreservation of pluripotent stem cells at -80  °C. Sci Rep. 6 (1), 34476(2016).">Yuan, Y., et al. Efficient long-term cryopreservation of pluripotent stem cells at -80  °C. Sci Rep. 6 (1), 34476(2016).

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