Evaluación de la recuperación funcional de la actividad del diafragma eupneico después de la hemisección unilateral de la médula espinal cervical en ratas

Resumen

Las complicaciones respiratorias son la principal causa de muerte en individuos con lesión de la médula espinal cervical (SCI). Los modelos animales de cLME son esenciales para las evaluaciones mecánicas y los estudios preclínicos. Aquí, presentamos un método reproducible para evaluar la recuperación funcional de la actividad del músculo diafragma (DIAm) después de la hemisección espinal unilateral C₂ (C₂SH) en ratas.

Resumen

Después de la lesión de la médula espinal, la activación del DIAm puede verse afectada dependiendo de la extensión de la lesión. El presente manuscrito describe un modelo de hemisección_C2 unilateral (C₂SH) de SCI que interrumpe la actividad electromiográfica (EMG) del diafragma ipsilateral eupneico (iDIAm) durante la respiración en ratas. Para evaluar la recuperación del control motor DIAm, primero se debe establecer claramente el grado de déficit debido a C₂SH. Al verificar una pérdida inicial completa de iDIAm EMG durante la respiración, la recuperación posterior se puede clasificar como ausente o presente, y el grado de recuperación se puede estimar utilizando la amplitud de EMG. Además, al medir la ausencia continuada de actividad EMG de iDIAm durante la respiración después del período de shock espinal agudo después de_C2SH, se puede validar el éxito de la C₂SH inicial. La medición de la actividad EMG del diafragma contralateral (cDIAm) puede proporcionar información sobre los efectos compensatorios de C₂SH, que también refleja la neuroplasticidad. Además, los registros de DIAm EMG de animales despiertos pueden proporcionar información fisiológica vital sobre el control motor del DIAm después de C₂SH. Este artículo describe un método para un modelo de_C2SH riguroso, reproducible y fiable de cSCI en ratas, que es una excelente plataforma para estudiar la neuroplasticidad respiratoria, la actividad compensatoria de cDIAm y las estrategias terapéuticas y farmacéuticas.

Introducción

Hay más de 300,000 personas con lesión de la médula espinal (SCI) en los Estados Unidos, aproximadamente la mitad de las cuales^{tienen lesiones} cervicales. Estas lesiones resultan en una pérdida significativa de bienestar y ejercen una presión financiera sobre las personas, sus familias y el sistema de atención médica. Afortunadamente, la mayoría de las lesiones de la médula espinal son^incompletas, lo que ofrece la posibilidad de fortalecer las vías preservadas. Esta neuroplasticidad puede permitir la recuperación de al menos algunas funciones, incluida la actividad DIAm, que es importante para los comportamientos ventilatorios y no ventilatorios. Por lo tanto, la promoción de la neuroplasticidad es una vía prometedora de investigación para ayudar a las personas con LME².

Los modelos de LME en roedores tienen el potencial de contribuir sustancialmente al descubrimiento de tratamientos para mejorar la salud humana. Uno de los modelos clásicos de LM utilizados para estudiar la neuroplasticidad es la transección unilateral (hemisección) de la médula espinal en_C2 (C₂SH), que deja intacto el lado contralateral 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13. El efecto de_C2SH sobre la producción frénica y la importancia de las vías contralaterales preservadas fue revelado por primera vez hace más de cien años por Porter¹², cuyo artículo seminal sentó las bases para los estudios modernos de la neuroplasticidad respiratoria. El modelo_C2SH interrumpe las entradas descendentes del grupo respiratorio ventral rostral (rVRG) en la médula, que contiene las neuronas premotoras responsables de transmitir la salida de la generación del ritmo respiratorio¹⁴. Estas neuronas premotoras rVRG también transmiten el impulso neuronal excitatorio a las neuronas motoras frénicas (Figura 1). Varios investigadores han adoptado diferentes enfoques para el modelo C₂SH 10,11,15,16, lo que puede explicar en parte parte la variabilidad en la recuperación entre los estudios. Brevemente, los abordajes varían en términos de preservar los funículos dorsales, realizar una hemisección completa o realizar una transección parcial lateral que no interrumpa completamente las entradas descendentes de la rVRG ipsilateral. En general, los modelos de C₂SH son particularmente útiles para estudiar la neuroplasticidad respiratoria debido a las tasas de recuperación espontánea de la actividad electromiográfica (EMG) eupneica iDIAm a lo largo del tiempo, que puede mejorarse mediante varios factores, incluida la señalización neurotrófica 17,18,19,20,21. Sin embargo, primero se debe establecer una pérdida inicial de la función, definida como el silenciamiento de la actividad EMG eupneica de iDIAm, antes de que la recuperación pueda clasificarse claramente. Esta validación de la inactividad en el momento de la C₂SH no se realiza en varios estudios ^{3,4,6,7,11,22,23}.

Las evaluaciones histológicas de la médula espinal extirpada solo proporcionan evidencia de daño en la ubicación apropiada de las vías bulboespinales excitadoras ipsilaterales que inervan las neuronas motoras frénicas en la médula espinal, pero la histología no sustituye la evidencia fisiológica (p. ej., DIAm EMG). Además, las evaluaciones histológicas se realizan ex vivo en puntosterminales (a menudo varias semanas o meses después de la lesión) y no proporcionan información "en tiempo real". Algunos investigadores han observado que la magnitud de la lesión se relaciona con la cantidad de déficit funcional o falta del mismo 5,24,25,26. Es importante tener en cuenta que la validez de tales afirmaciones probablemente depende en gran medida de cómo se clasifique la "función" (es decir, cuáles son las tareas funcionales y cómo se cuantifican), y la variabilidad entre los estudios pone de manifiesto la dificultad de producir lesiones funcionalmente idénticas en todos los animales. De hecho, los investigadores han enfatizado que la relación entre el grado de lesión y la función locomotora de los músculos de las extremidades (cuantificada por la puntuación de Basso, Beattie y Bresnahan (BBB)²⁴) no es lineal^27,28. En estudios previos, no hemos encontrado relación entre la extensión de la C₂SH y el grado de recuperación de la actividad EMG eupneica iDIAm después de la lesión 10,29,30,31, aunque otros investigadores han reportado una relación entre la función ventilatoria y el grado de preservación de la sustancia blanca ⁵. Por lo tanto, en el caso del modelo C₂SH, es beneficioso y necesario un enfoque para la validación funcional de la inactividad de iDIAm en el momento de la cirugía y, preferiblemente, en el curso temprano del curso del tiempo de los experimentos de lesión crónica de la médula espinal.

El presente artículo destaca el uso de DIAm EMG para la confirmación en tiempo real de la pérdida inicial de DIAm EMG durante la respiración después de la C₂SH, así como las evaluaciones confirmatorias posteriores a los 3 días (Día 3) después de la lesión 18,21,31,32,33. En trabajos anteriores con el modelo C₂SH, se realizaron laparotomías repetidas para registrar DIAm EMG 10,13,30,34. Sin embargo, trabajos más recientes han utilizado electrodos de EMG crónicos, que permiten el registro de EMG en ratas anestesiadas y despiertas. Además, los electrodos crónicos reducen el riesgo de neumotórax y no requieren laparotomías repetidas, lo que puede causar inhibición del DIAm^35,36. A pesar de que las versiones del modelo C₂SH han sido utilizadas por muchos investigadores, la confirmación del silenciamiento de la actividad de iDIAm no se realizó en el momento de la cirugía 3,4,6,7,11,22,23. Sin tal confirmación de la inactividad, es difícil saber qué parte de la recuperación posterior atribuir a la neuroplasticidad de las vías ipsilaterales frente a las contralaterales, que pueden tener impactos diferenciales. Esta es una consideración importante porque el impulso neuronal inspiratorio de la rVRG a las motoneuronas frénicas es principalmente ipsilateral, con una pérdida de aproximadamente el 50% de las entradas glutamatérgicas excitatorias a las neuronas motoras frénicas después de C₂SH³³. Sin embargo, quedan entradas excitadoras inspiratorias de la rVRG contralateral que decusan por debajo del sitio de la lesión para inervar las neuronas motoras frénicas ipsilaterales y pueden fortalecerse a través de la neuroplasticidad para promover la recuperación funcional. Al eliminar la entrada excitatoria ipsilateral predominante a las neuronas motoras frénicas, se pierde la actividad EMG eupneica iDIAm (al menos bajo anestesia), mientras que la actividad del cDIAm continúa e incluso se incrementa. La pérdida de la actividad EMG de iDIAm durante la respiración es, por lo tanto, una medida de un C₂SH exitoso (Figura 2).

Algún nivel de actividad de iDIAm EMG está presente tan pronto como 1-4 días después de C₂SH en animales despiertos^23,37. Además, en animales descerebrados, la actividad de iDIAm está presente minutos u horas después de la hemisección cervical superior y es suprimida por la anestesia³⁸. Además, el éxito del C₂SH se valida al confirmar la ausencia de actividad de iDIAm EMG durante la respiración (eupnea) en ratas anestesiadas el día 3 después de la lesión. Los estudios de imagen confocal confirmaron la pérdida de entradas sinápticas glutamatérgicas en las neuronas motoras frénicas durante esta etapa inicial de la lesión³⁷. En el día 3 después de la lesión, si hay alguna actividad eupneica residual de iDIAm EMG, esto se interpreta como evidencia de eliminación incompleta del impulso inspiratorio descendente ipsilateral de la rVRG. El presente artículo se divide en tres secciones: (1) registros crónicos de EMG DIAm, (2) C₂SH y (3) adquisición de datos de EMG en animales despiertos y anestesiados. Este protocolo describe un modelo de_C2SH riguroso, reproducible y fiable de cSCI en ratas, que es una excelente plataforma para estudiar la neuroplasticidad respiratoria, la actividad compensatoria de cDIAm y las estrategias terapéuticas y farmacéuticas.

Protocolo

Este protocolo fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de Mayo Clinic (Número de protocolo: A00003105-17-R23). Los animales del presente estudio fueron una mezcla de ratas Sprague-Dawley macho y hembra de aproximadamente 3 meses de edad y con un peso de entre 200 g y 350 g. Los detalles de los reactivos y el equipo utilizado en el estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Implantación de electrodos

1. Preparación de los electrodos
   1. Asegúrese de que el equipo mencionado esté disponible: (1) alambre de acero inoxidable multifilamento, (2) bisturí con hoja # 11, (3) tijeras, 4) microscopio de disección, (5) regla, (6) pinzas, (7) agujas de 25 g, (8) 2 alicates (al menos uno con zona de engarzado).
   2. Los detalles del proceso para fabricar electrodos se muestran en la Figura 3. Repita este proceso al menos dos veces para los electrodos de registro diferencial emparejados.
   3. Primero, mida y corte 18 cm del alambre de acero inoxidable.
   4. Haga un nudo simple básico a 4 cm de un extremo del alambre, como se muestra en la Figura 3; esto servirá como anclaje cuando el lado corto del alambre se implante y se suture en el DIAm.
   5. Con un bisturí y un endoscopio quirúrgico para disección, pele con cuidado 2 mm de aislamiento inmediatamente adyacente al nudo en el lado más corto del alambre. Tenga mucho cuidado de no cortar las hebras del alambre multihilado.
      NOTA: Esta parte no aislada sirve como superficie conductora del electrodo. Generalmente, la calidad de la señal comienza a degradarse si tres o más hebras se cortan inadvertidamente y, de ser así, se reemplaza el electrodo.
   6. A continuación, pegue ~ 5 mm del extremo del lado corto del alambre, que luego se inserta en el lumen de una aguja de 25 G para hacer una herramienta similar a un hilo de sutura que se utilizará para implantar el electrodo en el DIAm.
      NOTA: También se pueden usar agujas de calibre más alto (por ejemplo, hasta 28 G) según las preferencias personales. Debido al diámetro más delgado de las agujas de mayor calibre, el riesgo de neumotórax puede reducirse. Sin embargo, también puede ser más difícil insertar los cables multihebrados en el lumen más pequeño de la aguja.
   7. Para lograr esto, retire una aguja de 25 G de su empaque y, con ambos alicates, doble con cuidado la aguja a ~ 1 cm del extremo biselado afilado de lado a lado hasta que se rompa.
      NOTA: Este proceso no debe apresurarse; De lo contrario, las fuerzas de cizallamiento pueden hacer que el lumen de la aguja se cierre, lo que requiere que se repita el proceso.
   8. Inserte el extremo pelado del alambre en el lumen de la aguja de 1 cm rota, asegurándose de que la aguja quede inmediatamente adyacente a la parte aislada restante del alambre.
   9. Asegurándose de que no haya ninguna parte sin aislar entre la aguja y el lado más corto restante del alambre, engarce la aguja para unirla al alambre.
   10. A continuación, utilice los dos alicates para doblar con cuidado la aguja adjunta y darle una curvatura similar a la de una aguja de sutura quirúrgica estándar.
   11. Finalmente, pele ~ 5 mm del extremo del lado largo del cable (Figura 3). Después de que los electrodos se suturan en el DIAm, el lado largo del cable se tunelizará para el acceso externo y permitir registros de EMG DIAm.
   12. Repita el proceso para hacer un segundo electrodo para registros diferenciales.
2. Colocación del electrodo EMG de diafragma
   1. Antes de la cirugía, esterilice o autoclave todo el equipo quirúrgico, incluyendo (1) cortapelos para animales pequeños, (2) bisturí con cuchilla #11, (3) tijeras quirúrgicas, (4) pinzas y (5) soporte para microagujas.
   2. Adquiera una jaula limpia y proporcione comida, agua, ropa de cama y enriquecimiento ambiental. Deje a un lado sobre una almohadilla térmica. Esta jaula se utilizará para albergar al animal después de la cirugía.
   3. Esterilizar el campo quirúrgico con desinfectante adecuado y colocarse equipo de protección personal (batas, gorros, mascarilla y guantes quirúrgicos). Coloque los electrodos previamente preparados en una piscina de alcohol isopropílico al 70%.
   4. Coloque una almohadilla térmica en el área quirúrgica para mantener la temperatura corporal de la rata durante la anestesia y la cirugía. Cubra la almohadilla térmica con una toalla quirúrgica esterilizada.
   5. Pesar a la rata y calcular la dosis adecuada de anestésico según las pautas institucionales de cuidado y uso de animales.
   6. Anestesiar a la rata con una inyección intramuscular de ketamina (80 mg/kg) y xilacina (10 mg/kg) en las extremidades traseras u otro anestésico apropiado (siguiendo los protocolos aprobados institucionalmente). Inyectar buprenorfina de liberación prolongada (1 mg/kg) y carprofeno (5 mg/kg) antes de la operación. Proceda una vez que el animal ya no responda al pellizco de los dedos de los pies.
   7. Use tijeras para afeitar a la rata desde el proceso xifoides hasta aproximadamente la mitad de las extremidades traseras. Además, afeita la espalda de la rata, donde los electrodos se externalizarán más allá del alcance del animal (generalmente alrededor de los omóplatos). Limpia el exceso de vello con un trozo de gasa.
   8. Prepare la piel para la incisión limpiándola con una gasa estéril humedecida humedecida en gluconato de clorohexidina (4% en peso por volumen).
   9. Coloque al animal en posición supina sobre la almohadilla térmica esterilizada. A partir del proceso xifoides, utilice el bisturí y una cuchilla limpia #11 para hacer una incisión rostrocaudal de 4-5 cm. Esto debería exponer las capas musculares abdominales subyacentes.
   10. Haga otra incisión (3-4 cm) a lo largo de la línea media en las capas musculares para exponer el contenido abdominal. Tenga cuidado de no cortar los órganos abdominales.
   11. Asegúrese de que la superficie abdominal (es decir, inferior) del DIAm sea visible, aunque el lado derecho del animal quedará oscurecido por el hígado.
   12. Con el mango de un bisturí u otro instrumento contundente, empuje hacia abajo el hígado y otros órganos para exponer el lado abdominal del DIAm.
   13. Prepare el electrodo para su uso retirándolo del charco de alcohol isopropílico y lavándolo con solución salina estéril. A continuación, con un soporte de microagujas, oriente uno de los electrodos previamente preparados perpendicularmente a las fibras musculares de la región costal media del DIAm. Las fibras musculares se extienden radialmente por el DIAm.
       NOTA: El diámetro es delgado (~2 mm) y no debe perforarse. Más bien, el objetivo es incrustar la parte no aislada del cable del electrodo (Figura 3) dentro del DIAm.
   14. Utilice el microscopio quirúrgico para insertar cuidadosamente el alambre de sutura del electrodo (extremo de la aguja) en el DIAm. Permita que la curvatura de la aguja guíe el electrodo hacia adentro y luego hacia afuera de la superficie abdominal del DIAm, asegurándose de que toda la parte no aislada del alambre se incruste completamente en el músculo.
   15. Tire con cuidado de la aguja hasta que el nudo del alambre se ancle en el DIAm. Asegúrese de que la parte no aislada (2 mm) del alambre del electrodo esté completamente dentro del DIAm, con un nudo en el punto donde la aguja entró por primera vez en el DIAm.
   16. A continuación, corte la aguja del alambre del electrodo y deséchela en un recipiente para objetos punzantes.
   17. Con dos pinzas, haga un nudo en el punto donde la aguja de sutura (3-0) salió del DIAm. Para hacer esto, ate un lazo en el lado corto del alambre, deslice el lazo hacia abajo hasta la superficie abdominal del DIAm y apriete cuidadosamente el lazo en un nudo. El electrodo (parte no aislada) ahora debe estar anclado tanto en su punto de entrada como en el de salida.
   18. Corta la parte sobrante del lado más corto del alambre.
   19. Siga los pasos 1.2.14-1.2.18 para suturar en otro electrodo en el mismo lado del DIAm, a ~3 mm del primero.
   20. Realice la implantación del par de electrodos en el hemidiafragma opuesto de la misma manera.
   21. A continuación, asegúrese de que el lado más largo de los cables de los electrodos esté fuera de la cavidad abdominal y comience a suturar (3-0) las capas musculares para cerrar el abdomen. Para cada par de electrodos, haga un lazo y fíjelo.
       NOTA: Asegúrese de que queden 2-3 cm de alambre dentro de la cavidad abdominal para permitir que la rata se estire sin causar tensión en el DIAm.
   22. Limpiar el exceso de sangre con solución salina y luego suturar (3-0) la capa muscular en un patrón continuo para cerrar el peritoneo.
   23. Tuneje un catéter de 16 G desde la piel dorsal medial de la rata a través de la piel abdominal abierta y tire de un par de cables de electrodos hasta la parte posterior de la rata.
   24. Repita el proceso con un segundo catéter en el otro lado y tire del segundo par de cables de electrodos.
   25. Suturar la piel abdominal con una sutura 3-0 en un patrón de sutura interrumpido.
   26. A continuación, para cada par, ate los cables de los electrodos en un nudo y suérelos en su lugar.
   27. Proporcionar al animal una inyección subcutánea de solución salina (~1 ml por 50 g de masa animal). Coloque al animal en una jaula limpia sobre una almohadilla térmica para que se recupere.
       NOTA: La laparotomía puede causar inhibición de la actividad de DIAm^35,36. Espere al menos 72 horas antes del análisis cuantitativo de cualquier medición de EMG.

2. Hemisección espinal cervical

1. Prepare el área quirúrgica estéril como antes.
2. Antes de la cirugía, esterilizar en autoclave o esterilizar todo el equipo quirúrgico. Equipo requerido: (1) cortapelos de animales pequeños, (2) bisturí con cuchilla # 11, (3) tijeras quirúrgicas, (4) fórceps, (5) rongeurs, (6) retractores, (7) cuchillo de disección en ángulo.
3. Aproximadamente 72 h después de la implantación del electrodo DIAm EMG, pesar la rata y calcular la dosis anestésica adecuada según las pautas institucionales de cuidado y uso de animales.
4. Antes de anestesiar a la rata, colóquela en una jaula estilo Bowman y registre la EMG DIAm bilateral como se describe en el paso 3.2.
5. Anestesiar a la rata con una inyección intraperitoneal de ketamina (80 mg/kg) y xilacina (10 mg/kg) u otro anestésico apropiado según el protocolo del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales local. Preoperatoriamente: inyectar buprenorfina de liberación prolongada (1 mg/kg) por vía subcutánea y carprofeno (5 mg/kg) por vía intraperitoneal.
6. Proceda una vez que el animal ya no responda al pellizco de los dedos de los pies. Verifique la profundidad de la anestesia con un pellizco en el dedo del pie aproximadamente cada 15 minutos.
7. Antes de comenzar la cirugía, coloque a la rata en posición prona y registre el EMG en la rata anestesiada como se describe en el paso 3.3.
   NOTA: Asegúrese de que todas las grabaciones se realicen con la rata en la misma posición.
8. Afeita el vello desde el cuello hasta el nivel de las orejas hasta las escápulas y retíralo con una gasa húmeda.
9. Limpiar la piel con gluconato de clorohexidina (4% en peso) y cubrir al animal con fundas quirúrgicas estériles (excepto el dorso superior).
10. Con ayuda de un bisturí, realice una incisión rostro-caudal de 4 cm. Retrae la piel y corta el músculo acromiotrapecio. A continuación, diseccionar el músculo romboidal para exponer los músculos espinales.
    NOTA: El acromiotropecio es el músculo trapecio medio, y sus fibras musculares corren aproximadamente paralelas a la columna vertebral. El músculo romboidal está expuesto en el plano por debajo del acromiotrapecio y sus fibras musculares corren en diagonal.
11. Retrae los músculos de la columna vertebral de C₁ a C₃.
    NOTA: Los músculos de la columna vertebral corren inmediatamente adyacentes a la columna vertebral.
12. Realice cuidadosamente una laminectomía en C₂ con un rongeur mientras observa a través de un microscopio quirúrgico para asegurarse de que no se dañen las arterias o nervios principales.
13. Corte y retraiga la duramadre en C_2.
14. Conecte los cables de los electrodos expuestos desde la espalda de la rata hasta el amplificador mientras realiza la hemisección espinal. Consulte el paso 3 para obtener más detalles.
15. Mientras monitorea DIAm EMG, inserte el bisturí de disección en ángulo justo debajo del punto donde la raíz dorsal ingresa a la médula espinal y corte todo el camino hasta el punto medio de la superficie ventral de la manera que se muestra en la Figura 2A.
    NOTA: Si utiliza una almohadilla térmica electrónica, puede ser necesario apagarla mientras monitorea el EMG para evitar ruido.
16. A los pocos segundos de este seccionamiento, asegúrese de que la actividad eupneica de DIAm EMG ipsilateral a la lesión cese y de que se evidencie un aumento compensatorio de la actividad de cDIAm EMG (Figura 2C).
17. Si persiste la actividad EMG eupneica de iDIAm, realice otro corte con el cuchillo de disección, como se destaca en la Figura 2C. Sin embargo, no corte a través de la línea media; Lo más probable es que el corte hacia el lado contralateral provoque la muerte del animal.
18. Suturar los músculos y luego la piel con suturas estériles (3-0).
19. Para mantener la hidratación, inyecte por vía subcutánea 1 mL de solución salina por cada 50 g de masa animal y coloque al animal en una jaula limpia con una almohadilla térmica para su recuperación. Monitoree al animal a medida que se recupera de la cirugía.
20. Aproximadamente 72 h más tarde (Día 3 Post-C₂SH), registre la actividad de EMG en ratas despiertas según el paso 3.2 del protocolo. Ten cuidado de no dañar los puntos en el dorso de la rata.
21. A continuación, anestesiar a la rata una vez más (siguiendo los protocolos aprobados institucionalmente), utilizando una dosis más ligera de anestésico que la que se requeriría para un avión quirúrgico (entre 1/3 y 1/2 de una dosis normal). Se pueden administrar dosis adicionales siempre y cuando las ratas muestren un reflejo corneal intacto y respondan al pinzamiento de los dedos del pie.
22. Monitoree la actividad de DIAm EMG siguiendo el paso 3 del protocolo.
    NOTA: Coloque la rata en la misma posición que la utilizada para la evaluación inicial de la actividad de iDIAm EMG.
23. Si la actividad EMG eupneica de iDIAm (es decir, actividad en fase con la actividad inspiratoria de cDIAm EMG) está ausente en el día 3, concluya que el C₂SH inicial fue exitoso e incluya al mismo animal para análisis posteriores.

3. Adquisición y análisis de datos

1. Configuración general y extracción de datos
   1. Ajuste los filtros de paso de banda del preamplificador a 100 Hz (paso alto) y 1000 Hz (paso bajo).
      NOTA: Estas configuraciones de filtro eliminan los artefactos de movimiento y reducen notablemente el ruido de 60 Hz y la contaminación del ECG (que tiene una potencia máxima de ~ 75 Hz) mientras conservan la gran mayoría del contenido de frecuencia de la señal EMG DIAm intramuscular. Basado en la teoría de Nyquist, digitalice con una frecuencia de muestreo de 2000 Hz para evitar el aliasing y permitir una resolución adecuada para notar la actividad de la unidad motora en el EMG compuesto. Si se realizan análisis especializados del contenido de frecuencia del rango de frecuencia inferior a 100 Hz, es importante establecer la configuración del filtro del preamplificador para garantizar que las frecuencias de interés no se filtren.
   2. Monitorice dos canales (EMG hemidiafragma izquierdo y derecho) en un software de visualización en un ordenador y guarde los datos en un formato adecuado para análisis posteriores.
   3. Recoja al menos 1-2 minutos de grabaciones eupneicas para tener suficientes datos para los análisis.
   4. Asegúrese de que los datos se recopilan en tres o más puntos temporales:
      1. Antes de_C2SH, establecer un registro eupneico basal en condiciones de vigilia y anestesia.
      2. Durante la cirugía_C2SH para establecer el silenciamiento de la actividad EMG eupneica iDIAm en condiciones anestesiadas.
      3. En el día 3_post-C2SH para confirmar que la ausencia de actividad eupneica de iDIAm EMG persiste y establecer un punto inicial de la extensión del déficit en animales despiertos que no esté tan influenciado por el shock espinal ^2,39 o la administración de depresores respiratorios como la buprenorfina.
   5. Analice las grabaciones DIAm EMG utilizando cualquier software que permita realizar cálculos sobre señales digitalizadas (por ejemplo, Matlab, Python, R). El proceso básico es el siguiente:
      1. Cargue los archivos EMG sin procesar. Dependiendo de la configuración de filtrado, puede ser necesario tener en cuenta un desplazamiento de CC en la señal.
         NOTA: Una solución fácil es restar la media de la señal EMG bruta de sí misma.
      2. Calcule la raíz cuadrada media de la señal EMG con una ventana móvil de 50 ms. Esto se puede hacer moviendo una ventana de cálculo de 50 ms hacia adelante un punto de muestra a la vez hasta que se alcanza el final de la señal.
         NOTA: Los análisis de eventos EMG DIAm individuales proporcionan la mayor potencia estadística y permiten agrupar la actividad eupneica y no eupneica. Por lo tanto, la detección del inicio y la compensación de las respiraciones individuales en el DIAm EMG es primordial, como se destacó en un informe anterior⁴⁰.
   6. Realizar el filtrado de la actividad eupneica mediante la visualización de los histogramas de la frecuencia respiratoria instantánea y la duración de la ráfaga, como se muestra en un informe anterior⁴¹.
2. Grabaciones de Despierto.
   1. Realice grabaciones despiertos colocando ratas en una jaula de roedores estilo Bowman. Una jaula cilíndrica estilo Bowman puede acomodar ratas adultas de hasta 750 g.
   2. Desatornilla las varillas de metal en un lado de la jaula estilo Bowman y persuade suavemente a la rata para que entre. Vuelve a atornillar las varillas de metal, atrapando a la rata en la jaula cilíndrica.
      NOTA: Aclimate a las ratas a la jaula durante al menos 30 minutos antes de continuar con la grabación. Si es posible, es mejor aclimatar a las ratas a la jaula estilo Bowman durante varios días antes de cualquier medición. Es una buena práctica proporcionar golosinas mientras las ratas están en la jaula durante esta fase de aclimatación.
   3. Para minimizar los estímulos visuales externos, usa una toalla de papel u objeto similar para hacer una carpa alrededor de la parte delantera de la jaula donde está la cabeza de la rata. Además, minimice los ruidos fuertes y garantice la comodidad física de la rata en todos los puntos.
      NOTA: Los signos obvios de malestar incluyen inquietud, respiración rápida y lucha contra la jaula. Si se observa alguno de estos signos, puede ser necesario devolver a la rata a la jaula doméstica e intentar grabarla cuando esté más tranquila.
   4. Para ratas más pequeñas (<300 g), inserte materiales de relleno (por ejemplo, toallas de papel, bolas de algodón) en espacios adicionales de la jaula para evitar que la rata gire 180 grados.
   5. Después de que la rata se haya aclimatado, conecte cuidadosamente los cables que salen del dorso de la rata a un preamplificador, que alimenta las señales analógicas a un convertidor de analógico a digital, y siga los procedimientos descritos en el paso 3.1.
3. Grabaciones anestesiadas
   1. Coloque a las ratas en la misma posición cada vez, preferiblemente propensas a imitar más de cerca la postura de la rata despierta.
   2. Conecte los cables que salen del dorso de rata a un preamplificador, que alimenta las señales analógicas a un convertidor de analógico a digital, y siga los procedimientos descritos en el paso 3.1.
4. Recuperación de animales
   1. Coloque a las ratas dentro de una jaula de ratas vacía y limpia sin ropa de cama para su recuperación.
   2. Coloque la jaula sobre una almohadilla térmica.
   3. Monitoree a la rata a intervalos regulares (<15 min) durante las primeras 3 h o hasta que la rata comience a moverse. Vigile a intervalos menos regulares (30 min) hasta que el animal vuelva a estar despierto.
   4. Después de que la rata sea ambulatoria, colóquela en una jaula limpia con ropa de cama, acceso a comida y agua, y enriquecimiento ambiental.
   5. Continúe monitoreando a la rata al menos una vez al día durante el transcurso del experimento. Preste especial atención a los cambios en el peso/capacidad para alimentarse, así como a la integridad de los sitios de incisión y las suturas.

Resultados

El enfoque presentado en este artículo minimiza la variabilidad entre operadores mediante el establecimiento de criterios claros para evaluar DIAm EMG en un modelo de rata de C₂SH. En primer lugar, se debe observar el cese de la actividad EMG eupneica de iDIAm inmediatamente después de C₂SH, como se muestra en la Figura 2. De lo contrario, se puede realizar una transección secundaria hasta que desaparezca la actividad eupneica de iDIAm. En segundo lugar, en el día 3 después de la SH_C2, se debe verificar la ausencia continuada de EMG iDIAm eupneico mientras los animales están anestesiados. La figura 4A muestra un ejemplo de un C₂SH exitoso determinado por la ausencia continua de actividad EMG eupneica iDIAm bajo anestesia el día 3 después de la lesión. La Figura 4B muestra la actividad de DIAm EMG en el mismo animal en condiciones de vigilia no anestesiadas, lo que destaca la reducción, pero no la ausencia, de la actividad de iDIAm en comparación con la línea de base previa a la lesión. En particular, la actividad de la EMG cDIAm aumenta tanto en condiciones de vigilia como de anestesia. Los registros anestesiados del día 3 proporcionan la validación de que el C₂SH inicial fue exitoso, pero se deben realizar análisis cuantitativos en animales despiertos. En animales despiertos, la actividad de DIAm EMG en el día 3 después de C₂SH representa el punto de partida para la recuperación. La Figura 4B muestra que la actividad de iDIAm EMG está reducida, pero no ausente, en el día 3 en ratas despiertas.

En algunos casos, el C₂SH no se acompaña de un cese total de la actividad EMG eupneica de iDIAm (Figura 5A). Un_C2SH inadecuado ocurre en menos del 5% de todos los casos utilizando el enfoque descrito en el presente manuscrito; sin embargo, es esencial que se realice una evaluación de la actividad de DIAm EMG en el día 3 después de la C₂SH en cada rata para validar el éxito de la C₂SH. La figura 5A muestra un ejemplo de la actividad de DIAm EMG de una rata en el día 3 después de la lesión, en la que la C₂SH fue inadecuada para eliminar la actividad eupneica de iDIAm EMG en el día 3. Es importante destacar que la validación de la eficacia del_C2SH se realizó mientras el animal estaba anestesiado. La actividad continua de la EMG eupneica sugiere que al menos una parte de la vía bulboespinal ipsilateral descendente se salvó, lo que puede complicar la interpretación de los resultados. La Figura 5B muestra que la actividad de iDIAm EMG está reducida, pero no ausente, en el día 3 en ratas despiertas. Sin embargo, la preservación de las entradas descendentes ipsilaterales puede disminuir el déficit inicial.

Figura 1: Marco conceptual. El grupo respiratorio ventral rostral (rVRG) envía entradas descendentes a las neuronas motoras frénicas de la médula espinal cervical (C_{3-C 5}). La mayoría de estos axones descendentes inervan el grupo de neuronas motoras frénicas ipsilaterales, pero una pequeña fracción cruza la línea media para activar el grupo de neuronas motoras contralaterales. Inmediatamente después de un C₂SH, se interrumpen las entradas descendentes del rVRG al grupo de neuronas motoras frénicas ipsilaterales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Actividad representativa de C₂SH y DIAm EMG. (A) Se muestra la vista transversal de la médula espinal de la rata y el sitio trans (sombreado en rojo) con estructuras importantes etiquetadas. La lesión espinal se realiza insertando un cuchillo de disección justo debajo del punto donde entra la raíz dorsal y cortando hasta aproximadamente la línea media (área roja translúcida sombreada). Obsérvese el corte de los principales tractos motores en los funículos lateral y ventral, pero la preservación de los funículos dorsales. (B) La vista longitudinal, que representa el silenciamiento de la actividad de las neuronas motoras ipsilaterales, complementa las trazas de EMG en bruto utilizadas para la confirmación en tiempo real de una lesión satisfactoria (C). A medida que la médula espinal se lesiona, cesa la actividad EMG eupneica iDIAm, lo que sugiere que las entradas ipsilaterales a las neuronas motoras frénicas se han cortado; mientras tanto, el cDIAm EMG aumenta inmediatamente su actividad como se muestra. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Fabricación de electrodos. Se muestra el proceso de fabricación de electrodos DIAm EMG. El proceso básico consistía en medir y cortar una longitud adecuada de alambre (Paso 1), atar un nudo de anclaje y pelar el aislamiento de la vía para exponer el electrodo (Paso 2), unir una aguja de calibre 25 al alambre (Pasos 3 y 4), doblar la aguja para darle una curvatura similar a una aguja de sutura quirúrgica (Paso 5), y quitar el aislamiento para exponer una parte del cable que se conectará al amplificador para registrar EMG (Paso 6). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Hemisección espinal exitosa. (A) La actividad de DIAm EMG se muestra en una rata anestesiada antes de_C2SH y en el día 3 después de la lesión. No hay evidencia de actividad eupneica de iDIAm EMG en esta rata en el día 3 después de la lesión, lo que indica que el C₂SH inicial fue exitoso. Obsérvese el aumento compensatorio de la actividad EMG de cDIAm y el aumento de la frecuencia respiratoria en comparación con la afección previa a la lesión. (B) La actividad de DIAm EMG se muestra en la misma rata en condiciones de vigilia no anestesizada en el día 3 después de C₂SH. Existe una clara evidencia de una actividad reducida, aunque no completamente silenciada, de iDIAm EMG. Obsérvese el aumento compensatorio de la actividad EMG de cDIAm y el aumento de la frecuencia respiratoria en comparación con la afección previa a la lesión. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Hemisección espinal fallida. (A) Se muestra la actividad de DIAm EMG en una rata anestesiada antes de C₂SH y en el día 3 después de la lesión. En esta rata, la actividad eupneica de iDIAm EMG persistió en el día 3 después de la lesión, lo que indica que el C₂SH inicial fue inadecuado. En consecuencia, esta rata fue excluida de los análisis posteriores de recuperación funcional. Obsérvese el aumento compensatorio de la actividad EMG de cDIAm a pesar de un C₂SH infructuoso, pero un aumento mínimo de la frecuencia respiratoria. (B) La actividad de DIAm EMG se muestra en la misma corrida en condiciones de vigilia no anestesa en el día 3 después de C₂SH. Existe evidencia de una reducción de la iDIAm EMG, un aumento de la actividad de cDIAm EMG y un ligero aumento de la frecuencia respiratoria. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Hemisección espinal C₂
El procedimiento descrito en este artículo hace hincapié en las evaluaciones de la actividad de DIAm EMG que sirven como validación de una lesión espinal C₂ que atraviesa los funículos lateral y ventral sin afectar los funículos dorsales (Figura 2A). El abordaje quirúrgico propuesto tiene dos beneficios principales. En primer lugar, preserva los funículos dorsales, que preservan la función ambulatoria en las ratas, al tiempo que corta las entradas ipsilaterales a las neuronas motoras frénicas. En segundo lugar, mediante la monitorización de DIAm EMG, podemos validar la eficacia de la lesión C₂ en la eliminación de la actividad eupneica de iDIAm EMG inicialmente durante la cirugía mientras los animales están anestesiados. En el día 3 después de la lesión, mientras los animales están anestesiados, verificamos que efectivamente hay un silenciamiento continuo de la actividad eupneica de iDIAm EMG. Previamente se demostró que las entradas excitadoras de rVRG en las neuronas motoras frénicas y la expresión del receptor NMDA en las neuronas motoras frénicas se reducen a los 3 a 7 días después de la lesión y que tanto la entrada sináptica glutamatérgica como la expresión del receptor NMDA aumentan con el tiempo después de 7 días después de la lesión^33,42. Estos datos, combinados con la confirmación histológica de la lesión_C2 10,13,29,30,33, sugieren que la inactividad continuada bajo anestesia en el día 3 después de la lesión proporciona información sobre la eficacia de la C₂SH inicial. En estudios realizados en varios años, se observaron tasas relativamente estables de recuperación espontánea bajo anestesia entre el 30% y el 40% a los 14 días después de la C 2 SH 18,19,20,29,31,43, lo que sugiere que este método de verificación del éxito del C₂SH es reproducible y confiable.

El procedimiento C₂SH implica varios pasos críticos. Es importante destacar que el modelo C₂SH propuesto aquí preserva los funículos dorsales y, por lo tanto, no conduce a déficits motores en las extremidades. En los modelos de hemisección espinal completa_C2 que involucran los funículos dorsales, los déficits motores de las extremidades son considerablemente mayores 3,4,5,6,7,37. Por lo tanto, un beneficio adicional del modelo C₂SH (Figura 2A) es que, además del silenciamiento de la actividad EMG eupneica iDIAm en ratas C₂ lesionadas anestesiadas, las ratas son funcionalmente similares a las ratas de laminectomía simulada en términos de deambulación y otras funciones. En consecuencia, generalmente son capaces de alimentarse y acicalarse por sí mismos, lo que reduce la carga de cuidados y al mismo tiempo permite estudios del control neuromotor DIAm y la neuroplasticidad respiratoria. Para garantizar que el modelo_C2 se implemente adecuadamente, se debe tener mucho cuidado para evitar lesiones excesivas. Insertar el cuchillo de disección justo debajo de donde la raíz dorsal ingresa a la médula espinal y cortar la porción ventral con moderación son reglas generales útiles. El objetivo es garantizar el cese de la actividad de EMG eupneico iDIAm; Esto se puede hacer con múltiples cortes pequeños si es necesario. De hecho, en la semana siguiente al C₂SH, quedará claro si hubo un daño excesivo en la médula espinal si los animales tienen dificultades para deambular y alcanzar los gránulos de comida.

Colocación de electrodos y registros de EMG
Los electrodos EMG DIAm crónicos tienen varios beneficios claros sobre otros enfoques. Los electrodos pueden (y deben) implantarse varios días antes del procedimiento de_C2SH, permitiendo suficiente tiempo para la recuperación y sin necesidad de una laparotomía y una_C2SH durante la misma sesión quirúrgica. Esto es importante porque está bien aceptado que la laparotomía provoca la inhibición de la DIAm ^35,36. Al implantar electrodos DIAm crónicos, tampoco hay necesidad de laparotomías repetidas, que se realizaron en trabajos anteriores^10,13; también existe un menor riesgo de neumotórax, ya que no se insertan electrodos en el DIAm durante cada sesión. Sin embargo, pueden ocurrir varios eventos adversos potencialmente graves como resultado de la colocación de electrodos. Aunque el riesgo de neumotórax se reduce al evitar las inserciones repetidas de electrodos, no se anula por completo y, de hecho, puede producirse un neumotórax, causando la muerte inmediata o problemas prolongados. Con el fin de reducir este riesgo, es una buena práctica asegurarse de que la aguja que se está enhebrando a través del DIAm no perfore la superficie superior del DIAm. Además, evite el uso de pinzas afiladas que puedan infligir daño al DIAm mientras manipula los alambres de los electrodos. De vez en cuando, las ratas pueden masticar los puntos de sutura en su abdomen, potencialmente destripándose si se les deja a su suerte. Las ratas deben ser observadas a intervalos regulares después de la colocación del electrodo para detectar este tipo de comportamientos a tiempo. En algunos casos, puede ser posible anestesiar a las ratas para reparar el daño de los puntos. Sin embargo, es mejor si este comportamiento se mitiga proporcionando un alivio adecuado del dolor durante y después de la cirugía y asegurándose de que el campo estéril no se rompa durante la cirugía. En casos extremos, puede ser necesario aplicar la eutanasia a las ratas que se quitan repetidamente los puntos de sutura.

El registro y análisis de las señales EMG no es el objetivo principal del presente estudio y depende en gran medida del equipo y el software particulares disponibles en cada laboratorio. Aunque la información sobre el equipo se proporciona en la Tabla de Materiales, existe una amplia variedad de opciones de hardware para amplificar y registrar la actividad de EMG, y los detalles dependerán de una combinación de características, disponibilidad y asequibilidad para cada laboratorio. Sin embargo, hay algunos principios generales de registro de EMG que es importante mencionar. Un problema potencial es el movimiento o la destrucción de los electrodos implantados, lo que puede limitar las evaluaciones cuantitativas de DIAm EMG. Si los electrodos se han desprendido del DIAm, o si las ratas han logrado consumir o dañar los cables externalizados, es posible que no sea posible registrar la actividad de EMG o que el nivel de ruido cambie. Esto se puede evitar confirmando que los electrodos están firmemente asegurados en el DIAm, y se puede registrar una señal con una alta relación señal-ruido (SNR) durante la cirugía de colocación del electrodo DIAm. Además, la externalización de los cables de los electrodos en la parte alta del dorso y el corte del exceso de alambre de modo que las ratas no puedan acceder a los cables de los electrodos son factores que conducen al éxito de los electrodos crónicos. Como alternativa a los cables externalizados, las tapas de cabeza³⁷ o la telemetría^44,45 pueden ser opciones razonables. Ambos enfoques pueden obtener registros en animales despiertos más fácilmente, pero pueden ser un poco más difíciles de implementar que simplemente externalizar los cables multifilamento. Todas las fuentes electrónicas cercanas pueden ser potencialmente fuentes de ruido. Es primordial que todo el equipo esté conectado a tierra adecuadamente, que se utilicen cables blindados y que no se toquen las ratas mientras se realizan las grabaciones activas. Además de apagar las almohadillas térmicas electrónicas durante la grabación, es posible que sea necesario apagar temporalmente las luces, los equipos cercanos, las mesas quirúrgicas eléctricas y otros dispositivos similares para lograr grabaciones de bajo ruido. Para minimizar las influencias ambientales, los equipos electrónicos que no necesitan estar encendidos para las grabaciones DIAm EMG deben apagarse. Cuando sea posible, las grabaciones deben realizarse en una habitación con protección eléctrica. Con el tiempo, la cicatrización del tejido y la fibrosis alrededor de los electrodos DIAm EMG pueden disminuir la conductividad del electrodo, reduciendo la SNR. Además, incluso ligeros cambios en la postura pueden tener un gran impacto en la señal DIAm EMG; por lo tanto, para minimizar estos problemas potencialmente complicados, DIAm EMG debe grabarse con las ratas en la misma postura durante las sesiones de grabación.

Otra consideración importante es la configuración de filtrado y muestreo. El tipo de electrodo (es decir, intramuscular vs. esofágico/de superficie) es extremadamente relevante cuando se trata de determinar el contenido de frecuencia de una señal y, en consecuencia, los filtros de paso alto y bajo apropiados para ella. Se ha realizado un esfuerzo considerable para determinar los filtros óptimos para DIAm EMG⁴⁶ de superficie/esófago. No se han realizado estudios similares en el DIAm de rata, pero previamente demostramos que, efectivamente, la totalidad del contenido de frecuencia del DIAm EMG registrado utilizando electrodos intramusculares crónicos en ratas estaba por debajo de 1000 Hz, con la frecuencia del centroide alrededor de 300 Hz⁴⁷. En una comparación directa de las frecuencias medias y medianas del espectro de potencia de la EMG del bíceps braquial en humanos obtenida a través de electrodos de superficie e intramusculares, Christensen et ^al.48 encontraron que tanto la frecuencia media como la mediana eran aproximadamente 3 veces mayores para los electrodos intramusculares en comparación con los electrodos de superficie. En el DIAm, los investigadores han reportado frecuencias centroides de alrededor de 100 Hz cuando se utilizan electrodos esofágicos bipolares 49,50,51,52,53,54, lo que sugeriría que los 300 Hz, que se determinaron previamente para los electrodos intramusculares, coinciden aproximadamente con la misma tendencia mostrada por Christensen et ^al.48. A pesar de esto, múltiples estudios publicados que utilizan DIAm EMG intramuscular en modelos de roedores han colocado sus filtros de paso alto a 300 Hz 4,37,55,56 y algunos incluso han llegado hasta 500 Hz⁵⁷. Es indiscutible que este enfoque de filtrado reduciría sustancialmente la amplitud de la señal EMG DIAm al menos a la mitad. Proponemos un enfoque mucho menos destructivo: (1) filtrado de paso alto a 100 Hz porque la mayor parte del espectro de potencia del ECG está por debajo de 100 Hz, mientras que comparativamente poco del espectro de potencia del DIAm EMG está por debajo de 100 Hz^51,52, y (2) posteriormente eliminando el ECG sobrante mediante la coincidencia de formas de onda⁵⁸. Por lo tanto, los filtros apropiados para DIAm EMG para la mayoría de los estudios pueden establecerse entre 100 Hz y 1000 Hz, con una frecuencia de muestreo de al menos 2000 Hz para capturar todas las características relevantes dentro de los datos. A continuación, se pueden realizar análisis detallados de la EMG DIAm utilizando las técnicas publicadas en informes anteriores 40,41,47,58.

Animales despiertos y anestesiados
En particular, algunos estudios han destacado que los modelos C₂SH de cSCI no conducen a la inactividad completa de eupneic iDIAm EMG^23,37. En cierto sentido, esto no es sorprendente, ya que se ha observado previamente que la actividad de "avance" ocurre durante comportamientos que requieren un impulso más alto (por ejemplo, respiraciones profundas y la respuesta a la oclusión de las vías respiratorias)4,7,29,42. Estos datos sugieren que probablemente no sea apropiado pensar en el modelo_C2SH como un verdadero modelo de inactividad continua. De hecho, parece que el impulso es lo suficientemente alto en los animales despiertos como para que la actividad EMG eupneica iDIAm esté presente tan pronto como cuatro días después de un C₂SH³⁷ completo, aunque no está presente de manera consistente un día después de la lesión²³. En todos los casos, la anestesia suprime la actividad de iDIAm después de la hemisección espinal cervical superior, como se destacó en informes previos^23,38 y se mostró en la Figura 4 y la Figura 5. No hay datos publicados disponibles sobre la actividad de DIAm EMG en ratas despiertas con el C₂SH con funículos dorsales preservados propuesto en el presente manuscrito (Figura 2A). El trabajo futuro debería proporcionar una caracterización detallada del curso temporal de la actividad de DIAm EMG en animales despiertos con este modelo C₂SH. Dicho esto, sigue siendo prudente realizar la validación de la ausencia continua de inactividad eupneica de iDIAm en el día 3 después de la lesión bajo anestesia para imitar las condiciones experimentales durante las cuales la médula espinal se lesionó/seccionó inicialmente. Cuando puede haber actividad eupneica de iDIAm EMG en animales despiertos en el día 3 después de la lesión, se observa que incluso medias dosis de anestésicos generalmente conducirán a un cese completo de la actividad de eupneic iDIAm EMG. Con estas dosis, los animales están tranquilos y sedados. Además de verificar el silenciamiento de la actividad EMG eupneica de iDIAm durante el_C2SH y en el día 3 post-lesión, se recomienda la extracción de la médula espinal después del experimento terminal para realizar la confirmación histológica del sitio y la extensión del_C2SH ^9,29,59. La confirmación histológica de la lesión, cuando se combina con la confirmación funcional de la actividad EMG eupneica iDIAm silenciada, proporciona una fuerte evidencia de un éxito de_C2SH.

El presente artículo presenta un C₂SH de cSCI en ratas que conduce al silenciamiento inmediato de la actividad EMG eupneica iDIAm con silenciamiento continuo bajo anestesia en el día 3 después de la lesión. Debido a la preservación del funículo dorsal en el modelo C₂SH propuesto en el presente manuscrito, se preserva la función motora de las extremidades, evitando así efectos fuera del objetivo. Esto permite realizar estudios longitudinales de los efectos de una lesión cervical alta en el control neuromotor DIAm en ratas que, por lo demás, están relativamente sanas, lo que añade una carga mínima de cuidados para los investigadores. La validación de la inactividad bajo anestesia en el día 3 después de la lesión garantiza que se establezca una línea de base clara para evaluar el grado posterior de recuperación de la EMG iDIAm eupneica. Este enfoque proporciona un método riguroso, fiable y reproducible para realizar un C₂SH en ratas. Este modelo tiene el potencial de mejorar en gran medida la comprensión del curso temporal de la neuroplasticidad respiratoria y su intersección con posibles estrategias terapéuticas.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Aguja de 25 G	Cardinal Health	1188825100	Covidien Monoject Hypdermic Agujas estándar: 25 g x 1" (0,508 mm x 2,5 cm) A
3-0 Vicryl Violet Trenzado	Ethicon	J774D	3-0 Sutura
Adson-Brown Pinzas	de ciencia fina Fine Science Tools	11627-12 Forma de	la punta: recta, puntas: dientes de tiburón, ancho de la punta: 1,4 mm, dimensiones de la punta: 2 x 1,4 m, aleación / material: acero inoxidable, longitud: Jaula
estilo Bowman	Braintree Scientific	POR-530 Rango de	peso: 250 hasta 750 g; Longitud máxima: 9" (228 mm); La unidad básica está construida de acrílico enjoyado de .5" (123 mm).
Portaagujas Castroviejo	Fine Science Tools	12565-14	Forma de la punta: recta, Ancho de la punta: 1,5 mm, Longitud de sujeción: 10 mm, Bloqueo: Sí, Tijeras: No, Aleación / Material: Acero inoxidable, Longitud: 14 cm, Dentado: Sí, Característica: Cable de clip de carburo de tungsteno
1m TP blindado	Biopac Systems, Inc	LEAD110S	Cables conductores blindados para EMG
Software de adquisición de datos	LabChart LabChart	7.3.8	Software de registro, visualización y análisis de datos para grabaciones multicanal y evaluaciones en tiempo real Software de
análisis de datos - Matlab 2023b	Mathworks, Inc.	Versión 23.2	Lenguaje de programación de propósito general para análisis post hoc
Cuchillo de disección	Fine Science Tools	10056-12	Filo: 4 mm, Grosor: 0,5 mm, Aleación / Material: Acero inoxidable, Longitud: 12,5 cm, Forma de la hoja: Angulado 30 grados;
Pinzas Dumont #3 Fine	Science Tools	11293-00	Estilo: #3, Forma de la punta: recta, Puntas: Estándar, Dimensiones de la punta: 0,17 x 0,1 mm, Longitud: 12 cm, Aleación / Material: Amplificador de
electromiograma	Biopac Systems, Inc	EMG100C	Amplificador EMG
Friedman Rongeur	Fine Science Tools	16000-14 Forma de	la punta: curvada, Tamaño de la copa: 2,5 mm, Aleación / Material: Acero inoxidable, Longitud: 13 cm, Acción conjunta: Aleación simple
Friedman-Pearson Rongeurs	Fine Science Tools	16021-14	/ Material: Acero inoxidable, Longitud: 14 cm, Acción conjunta: Individual, Tamaño de la copa: 1 mm, Forma de la punta:
Módulo de fuente de alimentación aislada	Biopac Systems, Inc	IPS100C	Opera módulos amplificadores de la serie 100 independientes de la serie MP de Biopac Systems, Inc. Sistema de adquisición de datos
Kelly Hemostats	Fine Science Tools	13019-14	Puntas: dentadas, Ancho de la punta: 1,5 mm, Longitud de sujeción: 22 mm, Aleación / Material: acero inoxidable, Longitud: 14 cm, Forma de la punta:
Cureta de cuchillo	V. Mueller	VM101-4414	Punta: Afilada, Diámetro de la punta: 2 mm
Tijeras de microdisección Biomedical	Research Instruments, Inc.	11-2420	Longitud: 4", Ángulo: Recto, Longitud de la hoja: 23 mm
Alambre de acero inoxidable multifilamento	Cooner Wire, Inc.	COMO 631	AWG 40; Diámetro total: 0,011 mm (con aislamiento), 0,008 mm (sin aislamiento).
PowerLab 8/35	ADInstruments	PL3508	Sistema de adquisición
de datos Bisturí Hoja #11	Fine Science Tools	10011-00	Forma de la hoja: Inclinada, Filo: 20 mm, Grosor: 0,4 mm, Aleación / Material: Acero al carbono
Mango de bisturí #3	Fine Science Tools	10003-12	Aleación / Material: Acero inoxidable, Longitud: 12 cm
Sprague Dawley Rat	Inotiv	Código de pedido: 002	Ratas endogámicas Sprague Dawley (hembras y machos)
Microscopio quirúrgico	Olympus	SZ61	Microscopio quirúrgico
Tijeras de corte para suturas	George Tiemann & Co.	110-1250SB	Aleación / Material: Acero inoxidable, Forma de la punta: recta, Puntas: Afiladas/romas, Longitud: 4.5 "
Tijeras de resorte Vannas	Fine Science Tools	15000-08	Puntas: Afiladas, Filo cortante: 2,5 mm, Diámetro de la punta: 0,05 mm, Longitud: 8 cm, Aleación / Material: Acero inoxidable, Dentado: No, Forma de la punta: Recta
Weitlaner Retractor	Codman	50-5647	Puntas: 2 x 3 romas, Longitud: 4.5"