Artículo de método

Un modelo murino de hipertrofia ventricular derecha inducida por sobrecarga de presión y fallo por bandas del tronco pulmonar

DOI:

10.3791/66851

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14 de junio de 2024

 ,  ,  , 
1Department of Clinical Medicine, Aarhus University, 2Department of Cardiology, Aarhus University Hospital

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Describimos un modelo murino de sobrecarga de presión ventricular derecha inducida por bandas del tronco pulmonar. En el documento se incluyen protocolos detallados para la intubación, la cirugía y el fenotipado por ecocardiografía. Para la intubación y la cirugía se utilizan instrumentos hechos a medida, lo que permite una reproducción rápida y económica del modelo.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La insuficiencia del ventrículo derecho (VD) causada por sobrecarga de presión está fuertemente asociada con la morbilidad y mortalidad en una serie de enfermedades cardiovasculares y pulmonares. La patogenia del fracaso del VD es compleja y sigue siendo inadecuada. Para identificar nuevas estrategias terapéuticas para el tratamiento del fracaso del VD, son esenciales modelos animales robustos y reproducibles. Los modelos de bandas del tronco pulmonar (PTB) han ganado popularidad, ya que la función del VD se puede evaluar independientemente de los cambios en la vasculatura pulmonar.

En este artículo, presentamos un modelo murino de sobrecarga de presión RV inducida por PTB en ratones de 5 semanas de edad. El modelo se puede utilizar para inducir diferentes grados de patología del VD, que van desde la hipertrofia leve del VD hasta el fracaso descompensado del VD. En el documento se incluyen protocolos detallados para la intubación, la cirugía PTB y el fenotipado por ecocardiografía. Además, se proporcionan instrucciones para personalizar los instrumentos de intubación y cirugía de PTB, lo que permite una reproducción rápida y económica del modelo de PTB.

Se utilizaron clips de ligadura de titanio para constreñir el tronco pulmonar, lo que garantizó un grado de constricción del tronco pulmonar altamente reproducible e independiente del operador. La severidad del TBP se clasificó mediante el uso de diferentes diámetros de clip de ligadura interna (leve: 450 μm y grave: 250 μm). Esto dio lugar a una patología del VD que va desde la hipertrofia con la función del VD preservada hasta la insuficiencia descompensada del VD con gasto cardíaco reducido y manifestaciones extracardíacas. La función del VD se evaluó mediante ecocardiografía a la 1 semana y a las 3 semanas después de la cirugía. Aquí se presentan ejemplos de imágenes ecocardiográficas y resultados. Además, se muestran los resultados del cateterismo cardíaco derecho y los análisis histológicos del tejido cardíaco.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La insuficiencia ventricular derecha (VD) es un síndrome clínico con síntomas de insuficiencia cardíaca y signos de congestión sistémica resultante de la disfunción del VD1. La disfunción del VD está fuertemente asociada con la morbilidad y mortalidad en una serie de enfermedades cardiovasculares y pulmonares2. La etiología de la disfunción del VD es compleja y sus vías de señalización y regulación subyacentes siguen sin estar adecuadamente dilucidadas.

Las observaciones de las terapias actuales muestran que la mejora de la función del VD se correlaciona estrechamente con la reducción de la poscarga, lo que sugiere que la vasculatura pulmonar es el objetivo principal del tratamiento3. Esto indica que las terapias actuales solo tienen un efecto directo mínimo sobre la función del VD, que puede deteriorarse incluso después de la mejoría de la resistencia vascular pulmonar3. Por lo tanto, es muy necesario seguir investigando para mejorar la función del RV independientemente de la reducción de la poscarga.

Los modelos animales robustos y reproducibles son esenciales en la búsqueda de nuevos agentes terapéuticos. En la mayoría de los modelos de fracaso crónico del VD, la causa subyacente es la hipertensión pulmonar inducida por la alteración estructural de la vasculatura pulmonar 4,5,6. Los modelos bien caracterizados incluyen el modelo de hipoxia crónica 7,8, el modelo de hipoxia de Sugen 9,10,11 y el modelo de monocrotalina 12,13. Debido a que el fracaso del VD es secundario a la hipertensión pulmonar en estos modelos, es imposible diferenciar los efectos de las intervenciones sobre la vasculatura pulmonar de los efectos directos sobre el VD6.

Para estudiar el VD independientemente de la vasculatura pulmonar, el modelo de bandas del tronco pulmonar (PTB) ha ganado popularidad y se ha descrito en varias especies animales, incluyendo ratones, ratas, conejos, perros, ovejas y cerdos 6,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23, 24,25,26,27. En los modelos de PTB, la constricción del tronco pulmonar se logra quirúrgicamente, lo que provoca un aumento de la presión del VD6. Existen diferentes enfoques para la aplicación de la PTB, incluyendo la constricción del vaso con una ligadura o con un clip de ligadura metálico18,28. En los modelos que usan ligaduras, el tronco pulmonar se ata a una aguja y la aguja se retrae, dejando la ligadura en su lugar. Esto da lugar a una constricción del vaso que depende del tamaño de la aguja y de la tensión del nudo18,29. En los modelos que emplean clips de ligadura metálicos, el grado de constricción del tronco pulmonar puede ser más reproducible. Los aplicadores de clips de ligadura modificados se utilizan para cerrar los clips de ligadura a un diámetro predefinido y constante. Esto hace que el método sea independiente del operador y reduce la variabilidad relacionada con el PTB en el fenotipo de la enfermedad 15,27,28.

Se ha demostrado que los modelos murinos de PTB inducen hipertrofia y fallo del VD18,28. Uno de los principales retos a la hora de utilizar el modelo PTB es elegir el diámetro adecuado de PTB para lograr el grado deseado de patología del VD. Esto es especialmente desafiante cuando se intenta modelar la falla descompensada de RV. Para esto, la constricción debe ser lo suficientemente estricta como para inducir una falla crónica del VD sin provocar una falla aguda del VD y la muerte poco después de la cirugía6. Un enfoque para resolver este desafío es el uso de animales destetados o juveniles 6,15. Un modelo PTB ha sido utilizado con éxito para estudiar diferentes etapas de fracaso de RV utilizando ratas destetadas Wistar15,30. Para lograr esto, las ratas juveniles con potencial de crecimiento restante se sometieron a una cirugía de PTB con la aplicación de clips de ligadura de titanio. Cuando las ratas crecieron, la estenosis pulmonar se agravó gradualmente y resultó en hipertrofia del VD o fracaso crónico del VD, dependiendo de la gravedad del PTB15,30. Inspirados en este modelo, planteamos la hipótesis de que se podrían producir diferentes etapas de la patología del RV en un modelo murino de PTB utilizando ratones juveniles. El estudio de un amplio espectro de la patología del VD, desde la enfermedad leve hasta la grave, puede ayudar a dilucidar nuestra comprensión de la progresión de la enfermedad y la transición de la hipertrofia del VD al fracaso del VD.

Aquí, presentamos un modelo murino de sobrecarga de presión RV inducida por PTB en ratones jóvenes. Con este modelo, se pueden producir diferentes grados de patología del VD, que van desde la hipertrofia del VD hasta el fallo descompensado del VD. Este estudio incluye protocolos detallados para la intubación, la cirugía PTB y el fenotipado por ecocardiografía.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El estudio fue aprobado por la Inspección Danesa de Experimentos con Animales (número de autorización: 2021-15-0201-00928) y se realizó de acuerdo con la legislación nacional sobre animales de laboratorio. En este estudio se utilizaron ratones machos C57BL/6N de 5 semanas de edad.

1. Personalización de instrumental para intubación y cirugía (Figura 1)

NOTA: Esta sección detalla los pasos más importantes en la preparación de instrumentos hechos a medida para la intubación y la cirugía de PTB a partir de materiales económicos y fácilmente disponibles.

  1. Prepare el tubo endotraqueal (Figura 1A).
    Los catéteres intravenosos (IV) comunes se pueden usar para la intubación y ventilación de ratones.
    1. Elegir el tamaño adecuado de catéter intravascular correspondiente al tamaño de los ratones. Se recomienda un catéter de 22G para ratones de 5 semanas de edad (17-20 g) y un catéter de 23G para ratones más grandes (>20 g).
    2. Saque la aguja y separe el mecanismo de bloqueo. Vuelva a insertar la aguja en el catéter y corte la punta de la aguja en un ángulo de 45°, aproximadamente a 2 mm de la punta del catéter.
    3. Use papel de lija para desafilar la punta y evitar lesiones en las cuerdas vocales de los ratones.
    4. Corte un ala del catéter para una mejor visión durante la intubación.
  2. Prepare el retractor torácico (Figura 1B).
    1. Utilice un portaagujas para doblar un trozo de alambre metálico flexible de aproximadamente 10 cm en el centro en un ángulo de 30°.
    2. Utilice el portaagujas para crear cuidadosamente ganchos atrauónicos de 5 mm de ancho en ambos extremos del alambre.
  3. Prepare el soporte de intubación (Figura 1C).
    NOTA: El uso de un soporte de intubación permite la administración continua de anestesia a través de un tubo nasal durante la intubación. Esto permite una intubación controlada y segura bajo guía visual, lo que reduce el riesgo de lesiones en las cuerdas vocales y la tráquea, así como el riesgo de extravío del tubo en el esófago. Cualquier marco de metal o plástico se puede utilizar como marco para el soporte de intubación. En este estudio se utilizó un soporte de cocina ligeramente doblado.
    1. Corte un trozo de tubo de goma de 3 cm que se ajuste al hocico de un ratón y conéctelo a una válvula de catéter intravenoso. La anestesia inhalante se puede conectar a través de la válvula antes de la intubación.
    2. Haga un bucle con una sutura trenzada 1-0 aproximadamente a 5 mm de la abertura del tubo. Esto se usará para asegurar el hocico murino en el tubo.
    3. Corta un agujero cerca de la parte superior de una lámina de plástico flexible y coloca el tubo en el agujero. La sábana se utiliza para apoyar el ratón en el soporte de intubación.
    4. Use cinta adhesiva para mantener unidas las partes individuales como se muestra en la Figura 1C.
  4. Prepare la cánula de guía (Figura 1D, E).
    1. Tire de una sutura de monofilamento 6-0 a través de una cánula roma de 27G y haga un nudo en la sutura. Utilice este nudo más tarde para agarrar la sutura durante la cirugía de PTB.
    2. Utilice un soporte de aguja para doblar la punta de la cánula en un ángulo de 80°.
  5. Prepare el aplicador de clips de ligadura.
    NOTA: Un aplicador de clip de ligadura con mandíbulas en ángulo se modifica con un mecanismo de parada ajustable (Figura 1F), que detiene la compresión del clip de ligadura cuando las mandíbulas están a una distancia predeterminada con precisión entre sí. El aplicador de clips de ligadura modificado se utiliza para la aplicación de clips de ligadura de titanio en el tronco pulmonar.
    1. Fije una pieza de latón cortada a medida a los mangos del aplicador de clips de ligadura con dos tornillos. Monte un tornillo ajustable en el centro (Figura 1F, flecha blanca) que determina la distancia exacta entre los mangos comprimidos del aplicador de clip de ligadura, que corresponde a una distancia precisa entre las mordazas.

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Figura 1: Instrumentos para la intubación y la cirugía PTB. (A) Tubo endotraqueal hecho de un catéter intravenoso. (B) Retractor torácico. (C) Soporte de intubación y ratón colocado en soporte de intubación recibiendo anestesia en un tubo nasal. (D) Instrumentos quirúrgicos y aplicador de clip de ligadura modificado utilizados para la cirugía de PTB. (E) Cánula de guía. (F) Mecanismo de parada ajustable hecho a medida. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

2. Ajuste del aplicador de clip de ligadura

  1. Elija el diámetro interno del clip de ligadura en función de la gravedad deseada de la falla del RV. Para ratones machos C57BL/6N de 5 semanas de edad (17-20 g), use un diámetro de clip de 250 μm para sobrecarga de presión VD severa y de 450 μm para sobrecarga de presión VD leve. Utilice diámetros de clip intermedios para inducir una sobrecarga de presión moderada.
  2. Use alambre metálico o agujas para ajustar el aplicador del clip de ligadura. Asegúrese de que el diámetro del alambre corresponda al diámetro de clip deseado.
  3. Cargue el aplicador de clips con un clip de ligadura y coloque el cable de ajuste en el centro del clip de ligadura. Mientras comprime el aplicador de clip, gire el tornillo hasta que las mordazas del clip encajen firmemente alrededor del cable. Asegúrese de que el clip permanezca en su lugar en el cable de ajuste una vez que se suelte el aplicador de clip.
  4. Con el aplicador de clip ajustado, coloque otro clip de ligadura en el cable de ajuste para validar el diámetro establecido.

3. Preparativos para la cirugía

  1. Inducir la anestesia en una cámara de inducción utilizando sevoflurano al 7% en 0,6 L/min de oxígeno al 100%. Confirme la administración de suficiente anestesia mediante un pellizco en el dedo del pie antes de la intubación.
    NOTA: También se puede usar isoflurano. Tenga en cuenta que se deben utilizar diferentes concentraciones.
  2. Intubar el ratón con un catéter intravenoso de 22 G. Realice la intubación bajo guía visual, utilizando un microscopio quirúrgico y un soporte de intubación, lo que permite una alineación adecuada para la visualización de las cuerdas vocales y la administración continua de anestésicos inhalantes en un tubo nasal (Figura 1C).
  3. Ventile el ratón a 175 brazadas/min y un volumen corriente de 300 μL/brazada.
    NOTA: También se recomiendan volúmenes corrientes de 8-10 μL/g, y el volumen corriente ideal depende de las posibles fugas y espacios muertos en el sistema de ventilación.
  4. Coloque el ratón intubado sobre una almohadilla térmica cubierta (37 °C) y aplique una pomada hidratante en los ojos del ratón.
  5. Mantener la anestesia (3,5% de sevoflurano en 0,6 L/min de oxígeno 100%) y administrar 0,1 mg/kg de buprenorfina y 5 mg/kg de carprofeno por vía subcutánea para la analgesia perioperatoria. Eliminar todo el vello del pecho con crema depilatoria y desinfectar la piel con toallitas desinfectantes.

4. Cirugía PTB

  1. Realizar una incisión de 10 mm en la piel por encima del segundo espacio intercostal desde el ángulo esternal hasta la línea axilar anterior izquierda. Divida los músculos pectorales mayores y menores mediante disección roma.
  2. Cortar los músculos intercostales en el segundo espacio intercostal y diseccionar sin rodeos el timo para exponer el corazón, el tronco pulmonar y la aorta. Coloque un retractor torácico en el espacio intercostal para mantener accesible el campo operatorio.
    NOTA: Se debe tener mucha precaución al cortar los músculos intercostales, ya que la arteria mamaria interna izquierda corre solo 1-2 mm lateralmente del esternón. La lesión de esta arteria puede provocar una pérdida significativa de sangre.
  3. Separe el tronco pulmonar de la aorta ascendente mediante la extracción roma del tejido conectivo entre los vasos mediante pinzas microscópicas. Mejore aún más la exposición del tronco pulmonar girando la parte inferior del cuerpo del ratón (pierna izquierda sobre pierna derecha).
  4. Pasar la cánula guía a través del seno pericárdico transverso posterior del tronco pulmonar. Use pinzas para agarrar el nudo en la punta de la cánula guía y tire de la sutura a través de la cánula guía. Retire con cuidado la cánula guía mientras la sutura permanece en su lugar alrededor del tronco pulmonar.
  5. Cargue el aplicador de pinza de ligadura y utilice la sutura para guiar el tronco pulmonar hacia las mandíbulas de la pinza de ligadura y comprima la pinza. Suelte la sutura inmediatamente después de la colocación del clip y observe el llenado del tronco pulmonar.
    NOTA: Se puede observar bradicardia en los primeros segundos después de la aplicación del clip de ligadura.
  6. Coloque una sutura absorbible monofilamento 6-0 alrededor de la segunda y tercera costae y cierre el espacio intercostal. Evacúe la mayor cantidad de aire posible de la cavidad torácica aplicando una presión suave sobre el tórax mientras aprieta la sutura.
  7. Por último, sutura la piel con una sutura reabsorbible monofilamento 6-0.
  8. Realice el mismo procedimiento, excepto para colocar el clip de ligadura (paso 4.5), durante la cirugía simulada.

5. Ecocardiografía

  1. Después de la inducción de la anestesia en una cámara de inducción (1-2 min, 6% de sevoflurano en oxígeno al 100%), mantenga la anestesia con un tubo nasal (sevoflurano al 3,5% en oxígeno al 100%). Retire todo el vello del pecho y el abdomen con una crema depilatoria y coloque el mouse sobre una almohadilla térmica. Aplica ungüento hidratante en los ojos y gel de ultrasonido en el pecho del ratón.
    NOTA: Ajuste la ganancia 2D, la profundidad de enfoque y la profundidad de la imagen para mejorar la calidad de la imagen en todas las mediciones ecocardiográficas.
  2. Ajuste la sonda ultrasónica para encontrar la vista del eje largo paraesternal (PLAX) (Figura 2). En PLAX, mida el diámetro interno del tronco pulmonar y la integral de tiempo de velocidad (VTI) en el tronco pulmonar.
    1. Seleccione el modo B y mueva con cuidado la almohadilla térmica en los ejes x, y y z para identificar el tronco pulmonar en el centro de la imagen. Use el color para identificar el diámetro más grande del tronco pulmonar. Utilice la tienda de cine para capturar una secuencia para la medición del diámetro del tronco pulmonar.
    2. Seleccione el color y la onda de pulso (PW) Doppler y coloque el cursor en el centro del tronco pulmonar. Ajuste el ángulo PW hasta que las líneas punteadas sean paralelas al flujo sanguíneo en el vaso.
    3. Presione cine store para medir VTI. Coloque el cursor cerca de ambas paredes del tronco pulmonar y vuelva a pulsar cine store para adquirir flujo cerca de la pared del vaso.
      NOTA: El diámetro interno del ventrículo derecho (RV) y el grosor de la pared libre del VD también se pueden evaluar en la vista PLAX.
  3. Encuentre la vista del eje corto paraesternal (PSAX) (Figura 3) para medir los diámetros internos del ventrículo izquierdo (VI), que se puede utilizar para evaluar el abultamiento septal (configuración D).
    1. Seleccione el modo B y gire la sonda 90° en sentido contrario a las agujas del reloj. Incline la sonda 20-30 grados lateralmente para evitar la sombra del VD por el esternón, e incline la sonda 20-30 grados cranealmente hasta que el ventrículo izquierdo sea lo más redondo posible. A continuación, deslice la sonda en dirección craneocaudal para identificar el nivel de los músculos papilares con los diámetros ventriculares más grandes y presione el cin-store.
      NOTA: El PSAX a nivel papilar medio también se puede utilizar para evaluar el cambio en el área fraccional del VD. El PSAX a nivel de la válvula aórtica se puede utilizar para medir el acortamiento fraccional del VD o el espesor de la pared libre del VD.
  4. Utilice la vista apical de 4 cámaras (A4CH) (Figura 4) para medir la excursión sistólica del plano anular tricuspídeo (TAPSE) y evaluar la insuficiencia tricuspídea.
    1. Coloque la sonda como se muestra en la Figura 4. Una vez que se haya identificado el corazón, haga pequeños ajustes en la sonda usando solo la muñeca y los dedos para identificar las cuatro cámaras del corazón y la válvula tricúspide.
      1. Identificar y mantener una buena vista de A4CH es un desafío. Permita que la mano que opera la sonda descanse sobre la almohadilla térmica para mayor estabilidad. Delice, incline y gire ligeramente la sonda hasta que encuentre la imagen adecuada.
      2. Solo mueva la sonda en una dimensión a la vez: por ejemplo, deslice la craneocaudal para encontrar el corazón, luego incline la sonda para identificar las cuatro cámaras y finalmente gire la sonda hasta que las cuatro cámaras y la válvula tricúspide estén en el marco. Si es necesario, repita los tres pasos varias veces antes de obtener la imagen ideal.
    2. Una vez identificada la válvula tricúspide, seleccione el modo M y coloque la línea punteada en el anillo tricúspide de la pared libre. Presione cine store para guardar las mediciones.
    3. Seleccione el color para evaluar la insuficiencia de la válvula tricúspide. Si hay regurgitación, se observará un chorro de flujo retrógrado desde el VD hasta la aurícula derecha (AR) en sístole (Figura 5).
      NOTA: En la vista A4CH, también se puede medir el Doppler tisular en la pared libre del VD y la velocidad de entrada del VD.

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Figura 2: Vista del eje largo paraesternal (PLAX). (A-D) Posicionamiento de la sonda ultrasónica. (E, F) El corazón murino normal en PLAX. (G, H) Dilatación e hipertrofia del VD después de la PTB. Abreviaturas: VI: ventrículo izquierdo, VD: ventrículo derecho, VP: válvula pulmonar, PT: tronco pulmonar, Ao: aorta. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Vista del eje corto paraesternal (PSAX). (A-D) Posicionamiento de la sonda ultrasónica. (E, F) El corazón murino normal en PSAX. (G, H) PSAX después de PTB. Abreviaturas: VI: ventrículo izquierdo, VD: ventrículo derecho, PM: músculo papilar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: Vista apical de 4 cámaras (A4CH). (A-D) Posicionamiento de la sonda ultrasónica. (E, F) El corazón murino normal en la vista A4CH. (G, H) Dilatación del VD y de la AR después de la PTB. Abreviaturas: VI: ventrículo izquierdo, VD: ventrículo derecho, AR: aurícula derecha, LA: aurícula izquierda. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 5: Regurgitación tricuspídea visualizada por Doppler color en la vista A4CH. (A) En la diástole, se observa el flujo desde la AR hasta el VD (flecha). (B) Durante la sístole, es visible un delgado chorro de flujo desde el RV hasta el RA (flecha). Abreviaturas: VI: ventrículo izquierdo, VD: ventrículo derecho, AR: aurícula derecha, LA: aurícula izquierda. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

6. Análisis de datos

  1. Mida el diámetro del tronco pulmonar en tres ciclos cardíacos en PLAX y utilice el diámetro medio del tronco pulmonar para análisis de datos adicionales. Mida el VTI en tres ciclos cardíacos en PLAX para cada uno de los tres bucles de cine almacenados (en el centro del tronco pulmonar y cerca de las paredes del vaso). Utilice el VTI medio de todas las mediciones de VTI para un análisis posterior. Utilice la siguiente fórmula para calcular el CO:
    figure-protocol-6
    figure-protocol-7 : radio del tronco pulmonar, FC: frecuencia cardíaca
  2. Medir el LVEI en PSAX a nivel papilar medio. Utilice una herramienta de medición para medir el diámetro interno más grande del VI (LVid1) desde la mitad del tabique hasta la pared libre. A continuación, mida el diámetro interior del VI ortogonal a la primera medición (LVid2). Repita estas mediciones en tres ciclos cardíacos y calcule el VI utilizando los diámetros internos medios del VI y la siguiente fórmula:
    figure-protocol-8
  3. Mida el TAPSE en tres ciclos cardíacos en la vista A4CH y utilice el TAPSE medio para análisis de datos posteriores.

7. Cateterismo cardíaco derecho

  1. Mida la presión y el volumen del ventrículo derecho (VD) mediante un cateterismo cardíaco derecho con un catéter de micropunta de 1,4 F 3 semanas después de la cirugía de PTB.
  2. Anestesiar e intubar al ratón como se describe en los pasos 3.1-3.4. Coloque el ratón sobre una almohadilla térmica cubierta (37 °C) y mantenga la anestesia (3,5% de sevoflurano en 0,6 L/min 100% de oxígeno).
  3. Administrar 2000 UI de heparina (intramuscular [i.m.]) y 0,5 mL de NaCl (subcutáneo [s.c.]).
  4. Con unas tijeras quirúrgicas, corte la pared abdominal solo caudalmente hasta la apófisis xifoides y acceda a la cavidad torácica cortando cuidadosamente el diafragma a lo largo de su incisión en la pared torácica. Corte el diafragma y las costas hasta que se haya obtenido suficiente acceso al corazón.
  5. Colocar una ligadura alrededor de la vena cava inferior. Utilícelo para ocluir el recipiente para reducir la precarga para el registro de mediciones de presión-volumen más adelante en el protocolo.
  6. Use una aguja de 26G para hacer con cuidado un pequeño orificio en el tubo recreativo. Asegúrese de que esté lo más cerca posible del ápice y que la aguja no penetre completamente en el ventrículo, sino que simplemente actúe como una guía para la inserción del catéter de conductancia. Si se produce sangrado, aplique una presión suave con un pequeño hisopo de algodón para minimizar la pérdida de sangre.
  7. Identifique el pequeño orificio en la pared ventricular e inserte el catéter penetrando en el tejido.
    NOTA: Al insertar el catéter, tenga cuidado de no dañar la pared ventricular interna.
  8. A menudo se observan cambios en la presión ventricular derecha (RVP) durante varios minutos después de la inserción del catéter. Espere hasta que el RVP se estabilice para obtener mediciones representativas de estado estacionario.
  9. Para obtener asas de presión-volumen, utilice la ligadura previamente colocada alrededor de la vena cava inferior. Tire con cuidado de la ligadura para ocluir el vaso, reduciendo así gradualmente la precarga.
  10. Una vez que se hayan registrado los bucles representativos de presión-volumen, extraiga el catéter y eutanasione al ratón mediante la extirpación del corazón. En este momento, recoja muestras de sangre y tejido para su posterior análisis.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los ratones C57BL/6N (machos, 5 semanas de edad, 17-20 g) fueron aleatorizados a PTB grave (sPTB, 250 μm, n = 12), PTB leve (mPTB, 450 μm, n = 9) o cirugía simulada (simulada, n = 15). La evaluación de la función cardíaca se realizó mediante ecocardiografía 1 semana y 3 semanas después de la cirugía. El cateterismo cardíaco derecho con eutanasia posterior se realizó 3 semanas después de la cirugía. Se pesaron los órganos y se preparó el tejido cardíaco para los análisis histológicos.

La ecocardiografía 1 semana después de la cirugía reveló signos de presión VD elevada y disfunción VD en los grupos de PTB en comparación con los grupos de PTB y simulados. La disfunción del VD fue evidente por la disminución del gasto cardíaco (GC) y del TAPSE (Figura 6A,B). La disminución del índice de excentricidad del ventrículo izquierdo (VIVI) indicó un aumento de la presión del VD (Figura 6C). Por lo tanto, las intervenciones de reversión pueden investigarse ya después de 1 semana en modelos de PTB grave. El grupo de mPTB mostró signos ecocardiográficos de presión VD elevada en comparación con la simulación (disminución de la VI) después de 1 semana, pero no signos de disfunción del VD evaluados por ecocardiografía (Figura 6).

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Figura 6: Mediciones ecocardiográficas 1 semana después de la cirugía. (A) Gasto cardíaco (GC). (B) Excursión sistólica del plano anular tricuspídeo (TAPSE). (C) Índice de excentricidad ventricular izquierda (IPVI). Abreviaturas: mPTB: bandas leves del tronco pulmonar (PTB); sPTB: PTB grave. Los datos se presentan mediante diagramas de dispersión con medias ± DE. *p < 0,05, **p < 0,001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

A las 3 semanas, los efectos de la cirugía de PTB se acentuaron en el sPTB con una mayor reducción del gasto cardíaco y una disminución constante del TAPSE en comparación con el simulado (Figura 7A,B). No se observaron diferencias en los parámetros ecocardiográficos entre los grupos de PTPm y los grupos simulados después de 3 semanas (Figura 7A,B).

El cateterismo cardíaco derecho reveló un aumento de la presión sistólica del VD (RVSP) en ambos grupos de PTB en comparación con la cirugía simulada 3 semanas después de la cirugía (Figura 7C). La función diastólica del VD se vio afectada en el grupo de sPTB, lo que se indica por un aumento de la elastancia diastólica final del VD, una medida independiente de la carga de la rigidez del VD (Figura 7D). La contractilidad del VD, evaluada por la elastancia telesistólica (Ees), también aumentó en el grupo de sPTB en comparación con el grupo simulado, mientras que el grupo de mPTB mostró un aumento no significativo (Figura 7E).

Las mediciones anatómicas revelaron un aumento de la hipertrofia del VD con un aumento de la gravedad del PTB expresado por un aumento gradual en la relación entre el peso del VD y el peso corporal (RV/PN) (Figura 7F). La RVSP fue linealmente proporcional al grado de hipertrofia del RV (Figura 7G). El área transversal de los cardiomiocitos del VD confirmó un aumento del 40% en la hipertrofia del VD en la PBPs en comparación con la simulación, mientras que hubo un aumento no significativo en la PTBm en comparación con la simulada (Figura 8A-D). El grado de fibrosis en el VD y la aurícula derecha (AR) fue siete veces mayor en la sPTB en comparación con la simulada. No se observó un aumento de la fibrosis del VD en la MBPm (Figura 8E-H).

Se observó insuficiencia tricuspídea (TR) en el 64% en el grupo de sPTB después de 1 semana y en el 91% a las 3 semanas, mientras que no se encontró TR en los grupos simulado y mPTB (datos no mostrados). Se observaron diversos grados de decoloración hepática, un signo de descompensación extracardíaca, en el grupo de sPTB (Figura 9). No se observó decoloración en los grupos de mPTB y simulado.

En resumen, mostramos una correlación entre el diámetro de las bandas y la gravedad de la enfermedad. El grupo de mPTB imita una etapa temprana de la enfermedad con hipertrofia leve del VD sin disfunción del VD, mientras que el grupo de sPTB muestra signos de disfunción e insuficiencia del VD.

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Figura 7: Medición ecocardiográfica, volumen de presión invasiva y anatómicas 3 semanas después de la cirugía. (A) Gasto cardíaco (GC). (B) Excursión sistólica del plano anular tricuspídeo (TAPSE). (C) Presión sistólica del ventrículo derecho (RVSP). (D) Elastancia diastólica final (Eed). (E) Elastancia telesistólica (Ees). (F) Relación entre el peso del ventrículo derecho y el peso corporal (VD/PC). (G) Correlación entre la presión sistólica del ventrículo derecho (RVSP) y el peso del VD/PCN a las 3 semanas postoperatorias. Se realizó un análisis de regresión lineal que se presenta en el gráfico. R2 ajustado = 0,75, p < 0,001. Abreviaturas: mPTB: bandas leves del tronco pulmonar (PTB); sPTB: PTB grave. Los datos distribuidos normalmente se presentan mediante diagramas de dispersión con medias ± DE. Los datos no distribuidos normalmente se presentan mediante diagramas de caja con medianas con IQR y con bigotes que representan valores dentro de 1,5 x IQR de Q1 y Q3, respectivamente *p < 0,05, **p < 0,001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 8: Análisis histológico del tejido del VD. (A) Área transversal del VD. (B-D) HE tiñó tejido RV de (B) simulado, (C) mPTB y (D) sPTB. (E) Porcentaje de fibrosis intersticial en relación con el tejido sano en el VD. (F-H) Picrosirius tiñó el tejido del VD de (F) simulación, (G) mPTB y (H) sPTB. Barras de escala: (B-D) = 50 μm, (F-H) = 250 μm. Los datos se presentan mediante diagramas de caja con medianas, IQR y bigotes que representan valores dentro de 1,5 x IQR de Q1 y Q3, respectivamente. *p < 0,05, **p < 0,001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 9: Diferentes grados de decoloración del hígado. La decoloración se calificó de 0 a 3. La calificación se basó en el grado de apariencia moteada y el color del tejido hepático. Las imágenes se tomaron a través de un microscopio, lo que hizo que el tejido pareciera más claro que con la luz ambiental. (A) 0: hígado normal. (B) 1: Motas ligeras sin decoloración. (C) 2: motas moderadas y decoloración ligera. (D) 3: Manchas severas y decoloración (hígado de nuez moscada). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

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En este artículo, presentamos un modelo murino de hipertrofia y falla del VD inducida por sobrecarga de presión. Demostramos que: (i) el PTB en ratones juveniles puede inducir diversos grados de patología del VD, que van desde una hipertrofia leve del VD hasta un fallo del VD con signos extracardíacos de descompensación y fibrosis del VD confirmada histológicamente. (ii) Los signos de disfunción del VD pueden observarse y cuantificarse mediante ecocardiografía a las 1 y 3 semanas después de la cirugía de PTB. (iii) El grado de hipertrofia del VD es proporcional a la gravedad del PTB y al aumento resultante de la presión del VD. Este modelo puede ayudar a dilucidar la patogenia del fracaso del VD secundario a la sobrecarga de presión del VD, ya que demostramos que el modelo PTB es adecuado para estudiar diferentes estadios de la patología del VD.

Para garantizar el éxito y la reproducibilidad del modelo murino de PTB, se debe prestar gran atención a los siguientes pasos. (i) Elección del diámetro adecuado de la pinza de ligadura. El diámetro correcto del clip depende de varios factores, como el grado deseado de sobrecarga de presión RV y el tiempo de seguimiento. La edad y el peso corporal de los ratones también son factores importantes a tener en cuenta. En consecuencia, el protocolo puede ajustarse en función de la cuestión científica actual. Por esta razón, recomendamos realizar cirugías piloto y ecocardiografía en los momentos relevantes después de la cirugía para evaluar la idoneidad de los diámetros de clip seleccionados. (ii) El ajuste preciso del aplicador de clips es esencial para garantizar una patología reproducible. Recomendamos utilizar alambre metálico o cánulas con un diámetro exterior bien definido como guía para ajustar el aplicador de la pinza de ligadura. (iii) La pérdida de sangre fue la complicación grave más frecuente durante la cirugía de TBP y la causa más común de mortalidad perioperatoria y postoperatoria. Para limitar la pérdida de sangre, use instrumentos microquirúrgicos sin filo y disección roma siempre que sea posible. Utilice tijeras quirúrgicas únicamente cuando esté indicado en el protocolo. (iv) Otra causa de mortalidad perioperatoria son las arritmias cardíacas. Pueden ocurrir episodios cortos de bradicardia durante la disección del tronco pulmonar y la aplicación del clip de ligadura. Para reducir el riesgo de paro cardíaco, se debe limitar el tiempo de manipulación del tronco pulmonar. Cuando se observa bradicardia, se pausa la manipulación del tronco pulmonar hasta que la frecuencia cardíaca se haya normalizado. (v) La evaluación ecocardiográfica reproducible puede ser un desafío y requiere capacitación antes de que se logren resultados reproducibles. Debido al pequeño tamaño del RV, es especialmente difícil lograr una buena visualización del RV en ratones operados simuladamente en la vista PLAX y A4CH. (vi) La frecuencia cardíaca puede variar significativamente durante la evaluación ecocardiográfica. Para reducir la variabilidad, controle de cerca la frecuencia cardíaca y use dosis bajas de anestesia mientras garantiza una anestesia suficiente.

Una limitación del modelo murino de PTB es la necesidad de equipo quirúrgico y capacitación. Las cirugías piloto siempre deben realizarse para el entrenamiento, y los métodos deben ajustarse a los equipos disponibles localmente. Se utilizaron clips de ligadura de titanio, que se ha demostrado que son un método altamente reproducible para la inducción de la sobrecarga de presión del VD15. Además, se ha demostrado que el uso de clips de ligadura resulta en una menor mortalidad periquirúrgica y una mejor recuperación postquirúrgica en comparación con las ligaduras quirúrgicas31.

La ecocardiografía para la evaluación de la función del VD tiene algunas limitaciones, ya que depende del operador y la variabilidad inter e intraoperatoria puede influir en los resultados de la ecocardiografía. En el presente estudio, la ecocardiografía fue realizada por dos operadores. Para evitar el sesgo de la variación interobservador, ambos operadores realizaron ecocardiografía en un número igual de ratones de todos los grupos. Además, la ecocardiografía en ratones tiene sus desafíos. Esto es especialmente cierto en ratones pequeños y relativamente sanos, como lo demuestra la mayor variación de las mediciones de CO y TAPSE a 1 semana (Figura 5) en comparación con 3 semanas (Figura 6). Para lograr una medición más precisa del CO, el VTI en el tronco pulmonar se midió en tres ciclos cardíacos en tres ubicaciones diferentes (en el centro del tronco pulmonar y cerca de las paredes del vaso). Además, se ha demostrado que la ecocardiografía sobreestima el CO en comparación con la resonancia magnética en ratas sometidas a PTB32. La resonancia magnética es el estándar de oro para medir el CO en ratones y, por lo tanto, puede tenerse en cuenta cuando se utiliza el modelo actual32. Otro desafío en ratones con poca o ninguna elevación de la presión del VD es el pequeño tamaño del VD, lo que complica una buena vista de A4CH para medir, por ejemplo, TAPSE. Esto puede dar lugar a una subestimación de TAPSE en algunos ratones de los grupos simulado y mPTB. A pesar de estos desafíos, se lograron resultados estadísticamente significativos para CO y TAPSE en sPTB en comparación con sPTB simulado y mPTB. Esto demuestra que el CO y el TAPSE son marcadores útiles de la función del VD en el modelo actual, pero también pone de manifiesto la necesidad de una amplia formación de los investigadores antes de la evaluación ecocardiográfica de los ratones.

Una limitación inherente a todos los modelos animales es que los resultados no se pueden extrapolar directamente a los humanos debido a las diferencias genéticas y fisiológicas.

Hasta donde sabemos, este es el único modelo de PTB en ratones jóvenes. Este enfoque se ha utilizado en ratas, donde se desarrolla un aumento gradual y lento en la poscarga a medida que las ratas crecen. Esta inducción más lenta de la enfermedad imita mejor el desarrollo de la insuficiencia crónica del VD15.

El protocolo actual incluye dos grupos distintos de ratones con diferentes grados de disfunción del RV. Hasta donde sabemos, ningún otro modelo murino de PTB publicado incluye un grupo con solo una hipertrofia leve del VD sin signos de disfunción del VD, deterioro hemodinámico o fibrosis. Por lo tanto, esta etapa temprana de la enfermedad se pasa por alto en gran medida. El estudio de esta etapa temprana del desarrollo de la enfermedad puede aumentar nuestra comprensión de la progresión gradual de la hipertrofia del VD al fracaso del VD que se observa en pacientes con HAP crónica17.

En este modelo, la patología del fracaso crónico del VD se desarrolla dentro de las 3 semanas posteriores a la cirugía, lo que lo convierte en uno de los modelos más eficientes en el tiempo para el fracaso crónico delVD 6. Otros modelos murinos de PTB reportan duraciones de estudio de 1 a 8 semanas 17,18,33,34,35. Observamos signos de disfunción del VD ya 1 semana después de la cirugía en el sPTB. Sin embargo, este enfoque eficiente en el tiempo con un seguimiento de 3 semanas tiene limitaciones. Los ratones no están completamente desarrollados a las 8 semanas y un seguimiento más prolongado podría resultar en una estenosis del tronco pulmonar cada vez más grave y una falla del VD aún más grave.

Los ratones modificados genéticamente están fácilmente disponibles, y las nuevas cepas modificadas genéticamente se pueden producir en ratones de manera relativamente rápida y eficiente en el tiempo36. Esto constituye una gran ventaja de los modelos murinos de PTB en contraste con los modelos que utilizan ratas o mamíferos más grandes.

En conclusión, presentamos un modelo murino reproducible de hipertrofia y fracaso del RV inducida por sobrecarga de presión en ratones juveniles. En el documento se incluyen protocolos detallados para la intubación, la cirugía y el fenotipado por ecocardiografía. Para la intubación y la cirugía se utilizan instrumentos hechos a medida, lo que permite una reproducción rápida y económica del modelo. El modelo se puede utilizar para identificar los mecanismos que gobiernan la adaptación del VD a la sobrecarga de presión, así como los procesos subyacentes a la patología del VD que en última instancia resultan en el fracaso del VD. Por último, el modelo se puede utilizar para probar nuevas dianas terapéuticas para el tratamiento del fracaso del VD.

Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Este trabajo fue apoyado por Snedkermester Sophus Jacobsen og Hustru Astrid Jacobsens Fond, Helge Peetz og Verner Peetz og hustru Vilma Peetz Legat, Grosserer A.V. Lykfeldt og Hustrus Legat. Además, los autores desean agradecer al personal de las instalaciones de animales del Departamento de Medicina Clínica de la Universidad de Aarhus por su apoyo durante la ejecución del trabajo experimental.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Biosyn 6-0, monofilamento, sutura reabsorbibleCovidienUM-986
Cánula roma, 27G 0.4x0.25, Sterican292832
Bupaq Multidosis vet 0,3 mg/ml (Buprenorphinum)Salfarm DanmarkVNR 472318
C57BL/6NTac ratonesTaconic BiosciencesC57BL/6NTac
Dagrofil 1, trenzado, sutura no absorbibleB BraunC0842273
Crema depilatoria Veet 3132000
Hisopos de desinfección (82% Etanol + 0,5% Clorhexidina)Mediq3340122
Bisturíes desechables, tamaño 11Swann-Morton11708353
Drä ger Vapor 2000 SevofluranoDrä gerM35054
Ungüento para los ojos neutro, "Ophta"ActavisNúmero de referencia: 07586 Número de referencia: 53 96 68
Pinzas de ligadura HorizonTeleflex Medical5200 (IPN914931)
Aplicador de clips de ligadura abierto Horizon, curvo, 6" (15 cm)Teleflex Medical537061
Portarrollos de cocinan.a.n.a.Alambre
metálico de diferentes espesoresn.a.n.a.Juego
instrumentos microquirúrgicosThompsonn.a.Ventilador
MiniVent HugoSachsTipo 845
MS505S transductor Visual sonicsn.a.Rimadyl
Bovis vet. 50 mg/ml (Carprofeno)ZoetisMTnr: 34547, Vnr: 10 27 99,Sevoflurano
Baxter 100 %Baxter MedicalMTnr: 35015
Tubo de siliconan.a.n.a.Lámina
de plástico blando
estereoscópico, "Opmi Pico"Carl Zeiss Surgicals GmbHn.a.Soporte
/carril de sonda ultrasónicaVisual Sonics11277
Placa de varado Visual sonics11437
Venflon ProSafety, 22G, 0,9 x 25mmBecton Dickinson393222
de n.a.n.a.Microscopio

Referencias

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