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Investigación de la angiogénesis a nivel funcional y molecular mediante el uso del ensayo de migración de heridas por arañazo y el ensayo de germinación de esferoides.

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DOI:

10.3791/66954

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31 de mayo de 2024

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1Eye Center, Medical Center - University of Freiburg, Faculty of Medicine, University of Freiburg, 2Department of Medicine I, Medical Center - University of Freiburg, Faculty of Medicine, University of Freiburg, 3Institute of Pharmaceutical Sciences, Faculty of Chemistry and Pharmacy, University of Freiburg, 4Pharmacy, Medical Center - University of Freiburg, Faculty of Medicine, University of Freiburg, 5Ophtha-Lab, Department of Ophthalmology, St. Franziskus Hospital Muenster

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Este estudio presenta el ensayo bidimensional (2D) de migración de heridas por arañazo y el ensayo tridimensional (3D) de brotes esferoides, junto con sus respectivos métodos de análisis posteriores, incluida la extracción de ARN y la inmunocitoquímica, como ensayos adecuados para estudiar la angiogénesis in vitro.

Resumen

La angiogénesis desempeña un papel crucial en los procesos fisiológicos y patológicos del organismo, como el crecimiento tumoral o la enfermedad ocular neovascular. Una comprensión detallada de los mecanismos moleculares subyacentes y modelos de cribado fiables son esenciales para atacar las enfermedades de forma eficaz y desarrollar nuevas opciones terapéuticas. Se han desarrollado varios ensayos in vitro para modelar la angiogénesis, aprovechando las oportunidades que ofrece un entorno controlado para dilucidar los impulsores angiogénicos a nivel molecular y detectar dianas terapéuticas.

Este estudio presenta flujos de trabajo para investigar la angiogénesis in vitro utilizando células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVECs). Detallamos un ensayo de migración de heridas por arañazo que utiliza un sistema de imágenes de células vivas que mide la migración de células endoteliales en un entorno 2D y el ensayo de germinación de esferoides que evalúa la germinación de células endoteliales en un entorno 3D proporcionado por una matriz de colágeno. Además, describimos estrategias para la preparación de muestras que permitan análisis moleculares adicionales, como la transcriptómica, particularmente en el entorno 3D, incluida la extracción de ARN y la inmunocitoquímica. En conjunto, este marco ofrece a los científicos un conjunto de herramientas fiables y versátiles para llevar a cabo sus investigaciones científicas en ensayos de angiogénesis in vitro .

Introducción

La angiogénesis, que se refiere a la formación de nuevos vasos sanguíneos a partir de los preexistentes1, es un proceso crucial durante el desarrollo fisiológico y las condiciones patológicas. Es indispensable para proporcionar energía a tejidos altamente activos metabólicamente como la retina2 o el sistema nervioso central en desarrollo3 y durante la curación de tejidos dañados4. La angiogénesis anormal, por otro lado, es la base de numerosas enfermedades. Los tumores sólidos, como el cáncer colorrectal o el cáncer de pulmón de células no pequeñas, facilitan su crecimiento y el suministro energético necesario al promover la angiogénesis5. Además del cáncer, las enfermedades neovasculares del ojo como la retinopatía diabética o la degeneración macular asociada a la edad, que representan las principales causas de ceguera en el mundo desarrollado, son el resultado de un crecimiento aberrante de los vasossanguíneos 6,7. Una comprensión detallada del mecanismo patológico subyacente es crucial para comprender cómo se puede mejorar la angiogénesis fisiológica, por ejemplo, en la cicatrización de heridas, al tiempo que se controlan mejor las condiciones patológicas como las enfermedades oculares vasoproliferativas.

A nivel celular, las células endoteliales vasculares son activadas por diversas moléculas señalizadoras en la angiogénesis, iniciando la proliferación y migración celular8. Posteriormente, las células se organizan en una jerarquía, con células de punta no proliferantes que forman filopodios en el borde delantero de la rama del vasoen desarrollo 8. Al lado, las células del tallo que proliferan rápidamente siguen a las células de la punta, lo que contribuye a la formación del vaso emergente. Posteriormente, se reclutan otros tipos de células, como los pericitos o las células musculares lisas, para estabilizar aún más la rama naciente9.

Para explorar los procesos moleculares a nivel de las células endoteliales vasculares, se han desarrollado numerosos protocolos in vitro y recientemente se han revisado10. Estos ensayos suelen dividirse en dos categorías: enfoques 2D más simplistas pero escalables y protocolos 3D más elaborados. En un proyecto reciente, llevamos a cabo un análisis comparativo exhaustivo entre el ensayo 2D de migración de heridas por arañazo y el ensayo 3D de brotes esferoidales11 para evaluar el alcance de sus diferencias y su capacidad para modelar varios aspectos de la angiogénesis12.

Si bien ambos ofrecen las ventajas de ser confiables y fáciles de implementar, a nivel molecular, el ensayo de brote de esferoides en 3D fue favorable para abordar aspectos clave de la angiogénesis en comparación con los datos in vivo, como los interruptores metabólicos o las interacciones célula-matriz. Dado que los ensayos de angiogénesis in vitro se utilizan para evaluar el potencial angiomodulador de las vías de señalización13 y para detectar agentes terapéuticos, la transferibilidad de los resultados in vitro a entornos in vivo es esencial. Además, la oportunidad de que los análisis basados en ómicas de los niveles de ARN y proteínas caractericen los cambios moleculares en respuesta a la modulación dirigida de procesos angiogénicos en condiciones controladas sigue siendo un beneficio importante en comparación con los entornos in vivo 14,15.

En esta publicación, presentamos ensayos clave para explorar cuestiones relacionadas con la angiogénesis mediante la utilización de un ensayo de migración de imágenes de células vivas y un ensayo de brote de esferoides, incluidos análisis moleculares posteriores como la secuenciación de ARN para el análisis transcriptómico y la inmunohistoquímica a nivel de proteínas.

Protocolo

1. Cultivo celular HUVEC

NOTA: Realice todos los pasos siguientes en condiciones de trabajo estériles (banco de trabajo estéril).

  1. Expansión de los HUVC
    1. Para ambos ensayos de angiogénesis, utilice células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) agrupadas o células endoteliales microvasculares humanas (HMVEC).
    2. Cultive las células hasta que alcancen el 90% de confluencia en un matraz T75 sin recubrimiento con medio de crecimiento de células endoteliales (EGM) antes de realizar una división. Realizar cambio de medio 3 veces por semana.
      NOTA: Para acelerar el crecimiento, el medio se puede cambiar a diario. No use HUVEC más allá del sexto pasaje. El estudio recibió los resultados más consistentes al ejecutar todos los experimentos con HUVEC del mismo pasaje.
  2. División de HUVEC
    1. Cuando los HUVEC alcancen la confluencia deseada en el matraz T75, enjuáguelos una vez con 5 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS), seguido de una incubación de las células con tripsina al 0,5% durante 2 min en la incubadora.
      NOTA: La exposición prolongada a la tripsina puede dañar la función de HUVEC.
    2. Separe suavemente las células golpeando el matraz. Confirme el desprendimiento exitoso bajo un microscopio de contraste de fase invertida.
    3. Añadir 8 mL de EGM, transferir la solución a un tubo y granular las células por centrifugación a 250 x g durante 3 min.
    4. Si es necesario el recuento de células, vuelva a suspender las células en 5 mL de EGM y utilice una cámara de Neubauer. De lo contrario, añadir 40 mL de EGM y distribuirlo en 4 matraces de cultivo celular T75 frescos.

2. Ensayo de migración de heridas por rasguño

NOTA: El ensayo de migración de la herida por rasguño requiere una duración de 3 días para completarse (Figura 1). Realice todos los pasos siguientes en condiciones de trabajo estériles (banco de trabajo estéril).

  1. Siembra y hambruna de células (día 1)
    1. Utilizando una placa especializada de 96 pocillos para la obtención de imágenes de células vivas, siembre 20.000 HUVEC en 100 μL de EGM por pocillo. Deje que las células se asienten durante 6 h en la incubadora.
      NOTA: Es aconsejable optimizar el número de células teniendo en cuenta la velocidad variable de crecimiento de las células endoteliales vasculares entre los proveedores y los laboratorios. El objetivo es conseguir una monocapa perfecta al día siguiente antes de iniciar el rasguño. Los pocillos superpoblados pueden alterar el comportamiento de las células endoteliales, por ejemplo, por inhibición de contacto16, mientras que una monocapa incompleta dificulta drásticamente el análisis.
    2. Prive a todos los pozos durante la noche con 100 μL de EBM por pocillo suplementado con 2% de FBS.
      NOTA: Tenga cuidado de no dañar la monocapa de la célula, especialmente cuando utilice una pipeta multicanal.
  2. Preparación de soluciones de estimulación (día 2)
    1. Diluir las sustancias deseadas y los controles en el medio basal de crecimiento de células endoteliales (MBE) suplementado con FBS al 2%. Para cada pocillo, use 100 μL de solución.
      NOTA: La MBE suplementada con FBS al 2% sirve como control negativo, mientras que el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) recombinante humano a 25 ng/mL puede utilizarse como control positivo. Utilizando placas de 96 pocillos, se recomienda que los experimentos se diseñen con un mínimo de réplicas técnicas (4 pocillos con condiciones idénticas), aunque se sugiere utilizar 8 para obtener resultados óptimos. Esfuércese por minimizar los posibles efectos de borde o esquina al planificar el diseño.
  3. Creando el rasguño (día 2)
    1. Revise las células bajo un microscopio para verificar una monocapa de célula confluente y la viabilidad celular. Coloque la placa de 96 pocillos en una herramienta de fabricación enrollada de 96 pocillos y genere el rasguño presionando la palanca del dispositivo. Levante con cuidado la tapa de la herramienta para hacer heridas antes de soltar la palanca para evitar rascarse dos veces.
    2. Lave todos los pocillos dos veces usando 200 μL de EBM por pocillo suplementado con 2% de FBS. Confirme bajo un microscopio que los escombros se eliminaron con éxito.
  4. Estimulación celular (día 2)
    1. Añadir 100 μL de las soluciones de estimulación o control preparadas por pocillo.
  5. Diagnóstico por imágenes (día 2-3)
    1. Adquiera imágenes una vez por hora durante un período de hasta 24 horas utilizando un horario automatizado proporcionado por el microscopio de imágenes de células vivas.
      NOTA: Para garantizar una buena calidad de imagen, escanee cada pocillo inmediatamente después de transferirlo a la incubadora que alberga el sistema de imágenes de células vivas. Un tiempo de aclimatación de 30 minutos en la incubadora ayuda a obtener una mejor calidad de imagen. El software del microscopio está programado para adquirir una imagen por hora para cada pocillo en la línea media del rayado definido.
  6. En ausencia de una herramienta para hacer heridas y un generador de imágenes de células vivas, siga los pasos que se describen a continuación.
    1. Use una punta de pipeta en una placa de 24 pocillos para inducir un rasguño. Tome imágenes con un microscopio de cultivo celular clásico a intervalos específicos. Para este propósito, utilice un microscopio motorizado equipado con capacidades precisas de seguimiento x e y. Esto permite el posicionamiento automático, lo que garantiza una captura de imágenes consistente en ubicaciones predefinidas.
      NOTA: Cuando es necesario obtener imágenes manuales, es una opción viable obtener imágenes solo T0, así como un punto de tiempo 'x' horas después del tratamiento. En el protocolo descrito, utilizando HUVECs, el punto de tiempo T12 (12 h post-estimulación) fue un punto de tiempo atractivo con una clara separación entre el control negativo y el positivo estimulado por VEGF. Sin embargo, se recomienda realizar experimentos de curso de tiempo inicial con imágenes cada 2 h o 1 h para determinar el punto de tiempo óptimo para los entornos experimentales específicos en cada laboratorio.
  7. Análisis (día 3)
    1. El software del microscopio de imágenes de células vivas puede permitir el análisis directo de las imágenes adquiridas. Defina máscaras que delimiten el césped de la celda, el rasguño inicial y las regiones de densidad relativa de la herida. Determine los límites de las celdas en función de las diferencias de contraste.
      NOTA: Para los experimentos realizados con HUVEC se utilizó un ajuste de segmentación de 1,6, un archivo de agujeros de 500 μm2, un tamaño ajustado de 1 píxel, un área >500 μm y una excentricidad >0,6. Es esencial una revisión visual exhaustiva de los parámetros de detección de células en relación con las imágenes reales. Con configuraciones optimizadas, el software calcula automáticamente la densidad relativa de heridas (RWD) a lo largo del tiempo y genera los gráficos temporales correspondientes con la desviación estándar (SD) de las réplicas técnicas. Estos datos se pueden utilizar para el análisis estadístico.

3. Extracción de ARN con células cultivadas en 2D

NOTA: Realice todos los pasos siguientes hasta el paso 3.3 en condiciones de trabajo estériles (banco de trabajo estéril).

  1. Celdas de recubrimiento (día 1)
    1. Desconecte los HUVEC según el paso 1.2 del protocolo de cultivo celular HUVEC.
    2. Siembre 50,000 células por pocillo en una placa de 12 pocillos con 2 mL de EGM por pocillo.
    3. Cambie el medio después de 6 h a EBM que contenga 2% de FBS (medios hambrientos) para morir de hambre durante la noche.
  2. Tratamiento de las células (día 2)
    1. Agentes diluidos de interés en EBM suplementados con 2% de FBS. Reemplace los medios de inanición con la dilución preparada e incube las células durante el tiempo deseado en una incubadora.
  3. Extracción de ARN (día 2-3)
    1. Lisar las células con 750 μL de Trizol por pocillo e incubar durante 10 min en un agitador orbital.
    2. Vuelva a suspender las muestras con una pipeta de 1000 μL varias veces y, a continuación, guárdelas en tubos específicos de ARN de baja unión (volumen 1,5 mL). Conservar a -80 °C.

4. Inmunocitoquímica con células cultivadas en 2D

NOTA: Realice todos los pasos siguientes hasta el paso 4.4 en condiciones de trabajo estériles (banco de trabajo estéril).

  1. Preparación de cubreobjetos
    1. Incubar 100 cubreobjetos de 12 mm de diámetro en hidróxido de potasio al 5% en metanol en un tubo de 50 ml durante 30 min mientras se agita la solución aplicada.
      NOTA: Este es un paso muy importante en la desprotonación de la superficie de los cubreobjetos y en la mejora de las condiciones para el recubrimiento y el cultivo. En este punto, se recomienda encarecidamente asegurarse de que los cubreobjetos estén bien distribuidos dentro del medio y no se sequen y peguen entre sí.
    2. Lave los cubreobjetos durante 30 min 4 veces con agua desmineralizada.
    3. Después del lavado, transfiéralos a una solución de isopropilo al 70% para su almacenamiento.
  2. Recubrimiento de cubreobjetos
    1. Apoye los cubreobjetos individualmente contra la pared de una placa de Petri cuadrada para permitir la evaporación del alcohol isopropílico.
    2. Después de 5 minutos, transfiera los cubreobjetos a una placa de 24 pocillos (un cubreobjetos por pocillo). Aplicar 1 mL de una solución de 10 mg/mL de colágeno I en PBS a cada pocillo e incubar durante 60 min a 37 °C.
    3. A continuación, lave los cubreobjetos 4-5 veces durante 5 minutos con PBS.
  3. Cultivo de células
    1. Separe los HUVEC siguiendo los procedimientos descritos en el paso 1.2 del protocolo de cultivo celular HUVEC.
    2. Siembre 50,000 células por pocillo en una placa de 24 pocillos con 2 mL de EGM por pocillo.
    3. Después de 6 h, cambie el medio a EBM que contenga 2% de FBS para permitir que las células se adhieran al pocillo y maten de hambre a las células durante la noche.
    4. Al día siguiente, diluyó los agentes de interés en EBM suplementados con un 2% de FBS. Reemplace la solución hambrienta en los pocillos con la dilución preparada e incube las células durante el tiempo deseado en una incubadora.
  4. Fijación y bloqueo
    1. Cultive las células durante el tiempo deseado, luego lave las células con PBS durante 5 minutos.
    2. Fije las celdas con paraformaldehído (PFA) al 2% en PBS durante 20 min a temperatura ambiente (RT).
    3. Lavar con PBS 3-4 veces durante 5 min.
    4. Incubar muestras con tampón de bloqueo que contenga 5% de suero normal de cabra (NGS), 0,1% de Triton-X-100 en PBS durante 1 h a RT.
      NOTA: En este paso, es importante lavar las muestras para garantizar que el PFA se elimine por completo. Elija la especie del suero en función del origen del anticuerpo secundario.
  5. Tinción
    1. Incubar las muestras durante la noche a 4 °C en el tampón de bloqueo con el anticuerpo primario.
    2. Al día siguiente, para eliminar cualquier anticuerpo primario no unido, lave las muestras 3-4 veces con PBS durante 5 minutos cada una.
    3. Posteriormente, incubar las muestras durante 1 h en RT con el anticuerpo secundario correspondiente y Faloidina-FITC, diluidos juntos en el tampón de bloqueo.
    4. Lavar 3-4 veces más.
    5. Invierta los cubreobjetos en portaobjetos con una pequeña gota de medio de montaje que contenga DAPI, deje secar en la oscuridad y selle con esmalte de uñas. Almacene las muestras en la oscuridad a 4 °C.

5. Ensayo de germinación de esferoides

NOTA: El ensayo de germinación de esferoides requiere 3 días para completarse (Figura 2). Realice todos los pasos siguientes hasta el paso 5.7 en condiciones de trabajo estériles (banco de trabajo estéril).

  1. Generación de esferoides en gotas colgantes (día 1)
    1. Separe los HUVEC siguiendo los procedimientos descritos en el paso 1.2 del protocolo de cultivo celular HUVEC.
    2. Combine 200.000 células con 8 mL de EGM y 2 mL de solución madre de methocel, asegurando una mezcla completa. Consulte el Archivo Complementario 1 para obtener instrucciones sobre cómo preparar la solución madre de methocel.
    3. Dispense 25 μL de gotas de la solución en la superficie interna invertida de una placa de Petri grande y cuadrada. Gire suavemente la tapa 180° y colóquela en el fondo del recipiente de cultivo celular para que las gotas queden colgando. Coloque el recipiente en una incubadora de cultivos celulares durante la noche.
  2. Preparar el gel de colágeno (día 2)
    1. Mezcle bien 2,3 mL de colágeno de cola de rata tipo I con 0,280 mL de 10x Medium 199 hasta que la mezcla logre un tono amarillo uniforme y consistente. Mantenga esta mezcla en hielo durante todo el proceso.
  3. Titula el gel de colágeno (día 2)
    1. Titule la mezcla para lograr un pH fisiológico, indicado por un color naranja, utilizando NaOH (2 N).
    2. Añadir 50 μL de tampón HEPES al producto final.
      NOTA: Para garantizar un rango dinámico óptimo para el ensayo, es imperativo acercarse lo más posible a un pH fisiológico. Varios lotes de colágeno pueden requerir diferentes cantidades de NaOH. Mantenga la mezcla estrictamente en hielo durante todo el proceso y mezclada homogéneamente todo el tiempo.
  4. Cosecha de esferoides (día 2)
    1. Enjuague las gotas colgantes de las tapas de los cultivos celulares con 20 mL de PBS.
    2. Centrifugar la solución durante 7 min a 250 x g. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender los esferoides en 0,1 mL de FBS y 0,4 mL de EGM golpeando suavemente el tubo.
    3. Añadir 2 mL de solución madre de methocel y mezclar bien. Utilice una pipeta con una capacidad mínima de 5 mL para evitar dañar los esferoides.
  5. Adición de esferoides a la matriz de colágeno 3D (día 2)
    1. Agregue 2 ml de la mezcla de colágeno preparada a los esferoides resuspendidos y mezcle bien.
    2. Dispense 0,5 ml de la mezcla resultante en los pocillos de una placa de 24 pocillos e incube en una incubadora de celdas durante 30 minutos.
  6. Esferoides estimulantes en una matriz de colágeno 3D (día 2)
    1. Prepare una dilución de las sustancias deseadas en EBM. Para cada pocillo, use 100 μL de solución.
      NOTA: La MBE sirve como control negativo, mientras que el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) a 25 ng/mL (concentración final en 500 μL de matriz de colágeno y 100 μL de capa de MBE ) puede utilizarse como control positivo.
    2. Incubar durante el tiempo deseado.
      NOTA: En un ensayo estándar, se recomiendan de 18 a 24 horas, pero el tiempo debe optimizarse cuidadosamente en cada laboratorio.
  7. Obtención de imágenes de esferoides (día 3)
    1. Utilice un microscopio invertido y una plataforma de imágenes para capturar imágenes de todos los esferoides que no están en contacto con el borde del pozo, entre sí o que muestran signos de daño. Mantenga una configuración y niveles de zoom coherentes en todas las condiciones.
  8. Análisis (día 3)
    1. Utilice la herramienta de medición en ImageJ Fiji para determinar la longitud de todos los brotes de cada esferoide en cada imagen.
      NOTA: Utilice el complemento proporcionado en el Archivo complementario 2, que hace que el análisis sea más eficiente y genera un archivo .txt de salida.
    2. Importe los datos a una hoja de cálculo, R o cualquier otro software preferido, y utilice la longitud acumulada media de todos los brotes por esferoide como lectura para cada condición.
      NOTA: Los resultados de diferentes geles no se pueden combinar en forma de longitudes absolutas de brotación. Los datos de cada grupo de tratamiento deben normalizarse al grupo de control de EBM o VEGF (longitud relativa de brotación) antes de que se puedan fusionar los datos.

6. Extracción de ARN con células cultivadas en 3D

  1. Ensayo de germinación de esferoides
    1. Realice el ensayo de germinación de esferoides como se describe en la sección 5.
  2. Lisis del gel de colágeno
    1. Lave los geles esferoides con PBS tibio durante 5 min.
    2. Corte los geles esferoides en cuartos y transfiera los 4 cuartos a un tubo de 50 ml. Utilice un bisturí para la disección mecánica de los geles.
    3. Tratar las muestras de gel con solución de lisis (que contiene 2 mg/mL de colagenasa D en PBS) e incubar durante 45 min a 37 °C en un agitador.
    4. Lave los geles suavemente con PBS suplementado con 2 mM de EDTA para detener la reacción del tampón de lisis.
  3. Extracción de ARN
    1. Vuelva a suspender los geles lisados en 750 μL de Trizol e incube durante 10 minutos para garantizar una extracción suficiente de ARN, tal como se describe en el paso 3.3.
    2. Vuelva a suspender las muestras con una pipeta de 1000 μL varias veces y transfiera las muestras a tubos específicos de ARN de baja unión (volumen 1,5 mL). Almacene las muestras a -80 °C.

7. Inmunocitoquímica de esferoides en una matriz de colágeno 3D

  1. Ensayo de germinación de esferoides
    1. Realice el ensayo de germinación de esferoides como se describe en la sección 5.
  2. Fijación y bloqueo
    1. Fijar los geles con 4% de PFA en PBS durante 1 h.
      NOTA: Para asegurar una buena fijación de las células en el gel, los geles deben desprenderse cuidadosamente en los lados de los pocillos con un bisturí y pinzas después del enjuague con PBS.
    2. Lave los geles suavemente 3-4 veces con PBS y luego sepárelos completamente de la superficie de los pocillos y transfiéralos a nuevas placas de 24 pocillos.
    3. Incubar geles durante 1 h en RT con la solución de bloqueo (que contiene 5% de NGS y 0,1% de Triton-X-100 en PBS) en un agitador orbital.
  3. Tinción
    1. Incubar las muestras durante la noche a 4 °C en un agitador orbital con el anticuerpo primario diluido en tampón de bloqueo.
      NOTA: Voltear los geles durante esta incubación no mejoró la calidad de la tinción.
    2. Al día siguiente, lave los geles suavemente 4-5 veces con PBS durante 5 minutos cada uno.
    3. Incubar el anticuerpo secundario correspondiente, diluido con faloidina-FITC en tampón de bloqueo durante la noche a 4 °C en un agitador orbital.
    4. Realice 4-5 pasos de lavado adicionales con PBS.
    5. Transfiera los geles a portaobjetos de microscopio y móntelos con dos gotas de medio de montaje que contenga DAPI en un cubreobjetos colocado en cada gel. Deje que las muestras se sequen antes de sellarlas con esmalte de uñas y guárdelas en la oscuridad a 4 °C.
  4. Microscopia
    1. Tome imágenes de todas las muestras en un microscopio confocal. Utilice el objetivo 20x y concéntrese en la región de interés. Adquiera imágenes como pilas Z, así como imágenes de plano focal individuales.
      NOTA: La adquisición de imágenes de pila Z y plano focal en varias secciones a lo largo de la muestra 3D es esencial para capturar la representación completa, especialmente para muestras 3D gruesas.

8. Células endoteliales microvasculares de la retina humana (HRMVEC)

NOTA: Todos los pasos descritos también se pueden realizar con células endoteliales microvasculares, por ejemplo, células endoteliales microvasculares de la retina humana (HRMVEC). En ese caso, el medio debe cambiarse a un medio de células endoteliales microvasculares específico que contenga un 10% de suero fetal bovino (FBS) para el cultivo, así como pasos específicos en cada ensayo. A continuación se describen las diferencias específicas de HRMVEC con respecto a los protocolos de ensayo:

  1. Ensayo de herida por rasguño
    1. Cultive células en medio de células endoteliales microvasculares FBS al 10% en lugar de EGM.
    2. Siembra 20.000 células/pocillo.
    3. No prive a las células de la noche a la mañana.
    4. Después de realizar el raspado, cambie el medio a medio de células endoteliales basales que contenga 5% de FBS en lugar de EBM con 2% de FBS.
  2. Inmunocitoquímica de HRMVECs cultivadas en 2D
    1. Cultive las células en un medio de células endoteliales microvasculares al 10% en lugar de EGM.
    2. No prive a las células de la noche a la mañana.
    3. Cambie el medio justo antes del tratamiento a EBM + 5% FBS en lugar de EBM+2% FBS.
  3. Ensayo de germinación de esferoides
    1. Siembre las células en forma de gotas colgantes con medio de células endoteliales microvasculares que contenga un 10% de FBS en lugar de EGM.
  4. Inmunocitoquímica de esferoides en una matriz de colágeno 3D
    1. Siembre las células en forma de gotas colgantes con medio de células endoteliales microvasculares que contenga un 10% de FBS en lugar de EGM.

Resultados

Para el ensayo de migración, es crucial examinar minuciosamente las imágenes capturadas en el punto de tiempo t = 0 h para garantizar que el sistema detecte con precisión la presencia de una monocapa celular completamente formada (Figura 1B). Además, se debe confirmar la claridad y rectitud del borde rayado (Figura 1B). El área libre de celdas debe estar en gran parte libre de escombros. Al final del ensayo, un grupo estimulado con, por ejemplo, 25 ng/mL de VEGF como control positivo debería mostrar una migración exitosa en el área original rayada (Figura 1B). Un caso de problemas técnicos puede manifestarse como crecimiento celular irregular, doble rascado o ondulación en los bordes de rasguño (Figura 1C). Además, es importante establecer un rango dinámico sustancial entre el control negativo (muestras estimuladas por EBM) y el control positivo (muestras de VEGF) (Figura 1D). En nuestra configuración experimental, consideramos un aumento del 25% en RWD después de 12 h como un rango óptimo (Figura 1D). En un ensayo técnico problemático, los controles positivos y negativos no se separan correctamente, lo que indica un rango dinámico bajo (Figura 1E).

Tinción inmunocitoquímica de HUVECs en cubreobjetos, visualizada bajo un microscopio de fluorescencia para validar el éxito de la tinción (Figura 1F). Es importante examinar la mayoría de las células e identificar una región característica del portaobjetos. La especificidad de la tinción se evalúa utilizando un portaobjetos de control tratado solo con un anticuerpo secundario para excluir la unión inespecífica (Figura 1F). Las señales de tinción específicas deben examinarse críticamente de acuerdo con la localización subcelular conocida de la proteína diana. Utilizamos patrones de localización subcelular junto con la ausencia de señal en la muestra de control como índices de un protocolo de inmunotinción exitoso.

Del mismo modo, se deben tener en cuenta ciertos aspectos para los ensayos de germinación de esferoides de alta calidad. En este caso, la calidad debe evaluarse al final del ensayo, por ejemplo, t = 24 h. La matriz de colágeno observada bajo el microscopio debe exhibir homogeneidad y no debe parecer friable o rugosa (Figura 2B). Los esferoides estimulados con solo medio basal como control negativo y 25 ng/mL de VEGF como control positivo deben distinguirse claramente (Figura 2B). Además, los esferoides deben flotar en el gel y no caer al suelo, donde se dispersan, lo que indica una baja calidad (Figura 2C). Este problema a menudo surge de un enfriamiento inadecuado del colágeno durante la titulación de la mezcla o de una titulación excesiva o insuficiente del pH (Figura 2C). Un mínimo de 10 esferoides por pocillo deben ser imagenables para cada pocillo. El control negativo (muestras estimuladas por MBE) debe demostrar una tasa de brotación basal moderada, mientras que el VEGF, que actúa como control positivo, idealmente duplica o, preferiblemente, triplica la RSL en comparación con los controles (Figura 2D, gráfico de la izquierda). El número de brotes también debe mostrar un rango dinámico similar (Figura 2D, gráfico de la derecha). Un ensayo técnico subóptimo no mostrará este rango dinámico entre controles y, por lo tanto, podría conducir a una interpretación falsa de los datos (Figura 2E).

Las tinciones análogas a 2D, el examen de los portaobjetos bajo un microscopio de fluorescencia y la evaluación crítica de las estructuras teñidas son de gran importancia para el éxito de la tinción (Figura 2F). Si la localización celular de las estructuras y la intensidad de la señal en comparación con el control son comprensibles, se puede suponer que la tinción fue exitosa.

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Figura 1: Ensayo de migración de la herida por arañazo con células vivas. (A) Esquema del ensayo de migración de la herida por arañazo. (B) Imágenes que muestran una réplica técnica de alta calidad a t = 0 h y t = 12 h. Las células han sido estimuladas con 25 ng/mL de VEGF para que sirvan como control positivo. (C) Ejemplos de dos réplicas técnicas de baja calidad a t = 0 h debido a un rascado inadecuado o doble rayado. (D) Resultados de un ensayo exitoso de migración de heridas por rasguño. La correcta separación entre el control positivo estimulado con 25 ng/mL de VEGF y el control negativo recién tratado con medio basal se visualizó mediante un diagrama de violín a t = 12 h. Los datos incluyen 7-8 réplicas técnicas por grupo. (E) Resultados ejemplares que destacan un ensayo de migración de heridas por rasguño fallido. La separación subóptima del control positivo estimulado con 25 ng/mL de VEGF y el control negativo recién tratado con medio basal se visualizó mediante un diagrama de violín a t = 12 h. Los datos incluyen 7-8 réplicas técnicas por grupo. (F) Imágenes ejemplares de HUVECs sembrados en cubreobjetos y teñidos para DAPI, faloidina y VEGF-R2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Ensayo de germinación de esferoides. (A) Esquema del ensayo de germinación de esferoides. (B) Imágenes que muestran el control negativo (esferoides estimulados por medio basal) y el control positivo (esferoides estimulados por VEGF 25 ng/mL) de un ensayo técnico ideal al final a t = 24 h. (C) Ejemplos de dos esferoides de baja calidad a t = 24 h. Las imágenes de la izquierda visualizan un esferoide dañado que cayó al fondo de la placa, lo que da como resultado un cuerpo esferoide aflojado y una tasa de brote anormalmente mejorada. La imagen de la derecha visualiza el colágeno con parches de color notables, lo que crea un entorno muy heterogéneo que compromete significativamente la calidad del ensayo. (D) Análisis de la RSL (gráfico de la izquierda) y del número de brotes (gráfico de la derecha) de un ensayo exitoso con un buen rango dinámico entre el control negativo y el positivo. Los datos se visualizan utilizando un diagrama de violín e incluyen de 10 a 25 esferoides por grupo. (E) Análisis de la RSL (gráfico de la izquierda) y del número de brotes (gráfico de la derecha) de un ensayo técnico problemático con un rango dinámico subóptimo entre el control negativo y el positivo. Los datos se visualizan utilizando un diagrama de violín e incluyen de 10 a 25 esferoides por grupo. (F) Imágenes ejemplares de HUVECs del ensayo de germinación de esferoides teñidas para DAPI, faloidina y VEGF-R2.c

Ficha complementaria 1: Instrucciones para la preparación de la solución madre de methocel. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 2: Complemento SpheroidCount.ijm. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

En este informe, presentamos un espectro de técnicas con lecturas funcionales y moleculares para estudiar la angiogénesis in vitro.

El ensayo de migración representa una técnica bien establecida que se utiliza en todos los campos del trabajo de laboratorio húmedo. Elegimos el enfoque de imágenes de células vivas disponible en el mercado para aprovechar el formato de 96 pocillos adecuado para experimentos de detección y dosis-respuesta, el tamaño de la herida estandarizado y reproducible creado por la herramienta WoundMaker, la oportunidad de observar la cinética de migración a través de imágenes de lapso de tiempo durante un máximo de 24 horas, así como el software automatizado de cuantificación de imágenes. Sin embargo, se necesita la presencia de un sistema de imágenes de células vivas equipado con software de análisis de angiogénesis en el laboratorio o en una instalación central. Se han establecido numerosas configuraciones experimentales alternativas que no requieren microscopios específicos de imágenes de células vivas u otros equipos especiales10.

Según nuestra experiencia, es crucial optimizar la configuración del analizador, ya que los HUVEC y otros tipos de células endoteliales vasculares pueden tender a proporcionar un contraste deficiente, lo que dificulta la lectura automática por parte del software del microscopio. Para abordar este problema, se puede introducir un paso adicional de tinción con fluorescencia (por ejemplo, tinción con células vivas). Los sistemas de adquisición de imágenes de células vivas admiten este tipo de tinción e incluso la tinción multicolor para rastrear una proteína de interés. Una limitación importante del ensayo es que la diferenciación entre la migración celular y la proliferación no siempre es sencilla y que los resultados del ensayo representan una combinación de ambos procesos. La solución de imagen de células vivas utilizada en este estudio intenta abordar este problema mediante la introducción de la densidad relativa de heridas (RWD). A diferencia de la confluencia utilizada tradicionalmente en el área rayada, el RWD evalúa la confluencia dentro del área rayada en relación con el área rayada exterior. La migración en el área rayada eleva la RWD al aumentar la confluencia dentro de ella, mientras que al mismo tiempo reduce la confluencia fuera del área rayada debido a la migración celular. Por el contrario, la proliferación celular también aumenta la confluencia fuera del área rascada, disminuyendo así la RWD. Es importante reconocer que se trata de un enfoque de análisis estratégico que sólo tiene por objeto atenuar el impacto de la proliferación en la lectura final. Es posible que se necesiten ensayos complementarios sobre la proliferación para abordar esa cuestión. Alternativamente, se pueden agregar inhibidores del ciclo celular como la mitomicina C al ensayo para bloquear la proliferación. La implementación de protocolos con estos inhibidores debe optimizarse cuidadosamente en cada laboratorio para lograr el efecto deseado sin reducir el rango dinámico del ensayo. Además, al aumentar la frecuencia de escaneo de cada pozo, esta configuración ofrece una oportunidad fácilmente implementable para rastrear con precisión las celdas en movimiento a nivel individual si dicho seguimiento detallado es de particular interés.

Si bien el ensayo de migración de imágenes de células vivas demuestra la ventaja de la escalabilidad y los análisis automatizados e imparciales, nuestro estudio anterior destacó la capacidad del ensayo de brote esferoide para capturar detalles más intrincados de la angiogénesis. Esto incluye aspectos fundamentales como la formación de células en la punta y el tallo, la interacción célula-matriz y un interruptor glucolítico12. Para garantizar la reproducibilidad del ensayo, un investigador debe tener experiencia en la preparación de la matriz de colágeno, ya que las variaciones en el pH y la temperatura durante este proceso pueden afectar los resultados. Además, el análisis se realiza manualmente. Por lo tanto, el análisis de imágenes requiere mucho tiempo y conlleva el riesgo de sesgo. El enmascaramiento adecuado de las condiciones durante el análisis es esencial para evitar la introducción de sesgos. Para abordar esta preocupación, recientemente propusimos un enfoque basado en redes neuronales para identificar y mitigar el sesgo potencial en el análisis de los ensayos de brotes, que se puede implementar fácilmente17. En conclusión, el mejor enfoque para validar los resultados es combinar ambos ensayos. Sin embargo, es crucial reconocer que pueden surgir diferencias debido a la naturaleza distinta de los escenarios 2D y 3D12.

Dado que existe una amplia selección de ensayos de angiogénesis in vitro en 2D y 3D, es importante tener en cuenta las ventajas y desventajas de los ensayos presentados en comparación con otros métodos. El ensayo de herida por rasguño, por ejemplo, se centra en la migración horizontal 2D en un plato de plástico, mientras que el ensayo de cámara de Boyden caracteriza la migración vertical a través de un inserto de malla con un quimioatrayente en la "cámara exterior". Basado en su sencilla configuración y lectura, el ensayo de bobinado por rayado permite experimentos de alto rendimiento, especialmente en su formato de 96 pocillos, proporcionando una alta reproducibilidad, así como la posibilidad de visualizar el experimento y realizar un lapso de tiempo. Desafortunadamente, las desventajas del ensayo de heridas por rasguño son la dificultad para diferenciar entre proliferación y migración, la necesidad de células adherentes y, en ausencia de una herramienta para hacer heridas, una mayor variabilidad debido a los rasguños desiguales. La lectura del ensayo de la cámara de Boyden tiene la ventaja de medir el efecto quimiotáctico de las sustancias solubles en las células móviles18 y destaca tanto la invasión como la migración. Desafortunadamente, las desventajas son la escasa reproducibilidad y la alta varianza del ensayo, la incapacidad de visualizar el movimiento de las células, el alto número de células migradas necesarias para obtener una señal, la configuración y lectura bastante largas y elaboradas, así como la falta de la oportunidad de un ajuste de lapso de tiempo19.

El ensayo de germinación de esferoides, cuantifica la germinación de células endoteliales en una matriz de gel 3D, mientras que el ensayo de formación de tubos caracteriza la formación de tubos celulares en la superficie de una matriz de gel20. El ensayo de germinación tiene la ventaja de caracterizar la invasión de células en una matriz, así como la proliferación y la migración. Las desventajas son la mayor varianza del gel de colágeno titulado y, en base a esto, la calidad de los esferoides. La ventaja del ensayo de formación de tubos es la formación de tubos vasculares después de un tiempo distinto (dependiendo de la citocina) y un enfoque fácil. Las desventajas son la falta de invasión de las células y el efecto del propio Matrigel en la formación del tubo21.

Todos los experimentos presentados se realizaron con HUVECs. Es bien sabido que existen diferencias significativas en el comportamiento de las células endoteliales vasculares de diferentes orígenes (e.g., macro-vascular vs. micro-vascular)22,23. Por lo tanto, puede ser necesario validar los resultados experimentales con otras líneas celulares endoteliales vasculares. Los entornos experimentales fueron transferibles para el endotelial microvascular de la retina humana (HRMVECS), excepto por el hecho de que los HRMVEC requieren concentraciones más altas de FBS. Por otro lado, la línea celular endotelial aórtica bovina (BAECs) comúnmente utilizada no pudo ser utilizada en el ensayo de germinación esferoide debido a una tasa de brotación basal excesiva.

Ambos ensayos presentados comparten la limitación de que están confinados a un solo tipo de célula. Dado que la angiogénesis in vivo es un proceso multicelular intrincado, este aspecto crucial no se capta con precisión en ninguno de los ensayos. Se han desarrollado variaciones de cocultivo para ambos ensayos, con un enfoque particular en el ensayo de brote esferoide, y recientemente se discutió10,24. Alternativamente, la validación directa de los datos en modelos de angiogénesis in vivo relevantes representa una opción viable. Los ensayos establecidos para este propósito incluyen el modelo de ratón para la retinopatía inducida por oxígeno (OIR)25, el modelo de neovascularización coroidea inducida por láser (Laser-CNV)26 y el ensayo de tapón27.

En general, tanto el ensayo de migración de imágenes de células vivas en 2D como el ensayo de brote de esferoides en 3D, junto con las herramientas de análisis molecular presentadas, ofrecen una plataforma sólida para la investigación de la angiogénesis y son ampliamente reconocidos dentro de la comunidad de angiogénesis. La combinación de estos ensayos con análisis in vivo posteriores para validar los hallazgos proporciona una base sólida para investigar cuestiones específicas relacionadas con la angiogénesis.

Divulgaciones

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses en este proyecto.

Agradecimientos

Los autores agradecen a Sophie Krüger y Gabriele Prinz por su excelente apoyo técnico. Agradecemos a Sebastian Maier por desarrollar el plugin ImageJ para cuantificar brotes de esferoides y al Lighthouse Core Facility, Zentrum für Translationale Zellforschung (ZTZ), Department of Medicine I, University Hospital Freiburg por el uso del sistema IncuCyte. Los gráficos fueron creados con biorender.com. Este trabajo contó con el apoyo de la Deutsche Forschungsgemeinschaft [Bu3135/3-1 + Bu3135/3-2 a F.B.], la Medizinische Fakultät der Albert-Ludwigs- Universität Freiburg [Berta-Ottenstein-Program for Clinician Scientists and Advanced Clinician Scientists to F.B.], la Else Kröner-Fresenius-Stiftung [2021_EKEA.80 a F.B.], el Consorcio Alemán del Cáncer [beca CORTEX para Científicos Clínicos a J.R.] y la Volker Homann Stiftung [a J.N.+F.B.] y la "Freunde der Universitäts-Augenklinik Freiburg] e.V." [a P.L.]

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
10x Medium 199Sigma-AldrichM0650
Alexa Fluor 647-conjugado AffiniPure F(ab)' 2 fragmentosJackson IR 115-606-072
Axio Vert. A1Zeiss
CapturePro 2.10.0.1JENOTIK Optical Systems
Colágeno Tipo 1 colarata Corning354236
Colagenasa DRoche 
medio basal de células endotelialesLonzaCC-3156EBM
Medio de crecimiento de células endotelialesLonzaCC-3162EGM
Ácido etilendiaminotetraacético Serva11290.02EDTA
Suero fetal bovinoBio& SELLS 0615FBS
Células endoteliales de la vena umbilical humana, placas agrupadasLonzaC2519A
HUVEC IncuCyte ImageLock de 96 pocillos Sartorius4379
Sistema de análisis de células vivas Incucyte S3Sartorius
MethocelSigmam-0512
células endoteliales microvasculares con 10% FBSPB-MH-100-4090-GFPPELOBiotech
NaOHCarl RothP031.2
Isotiocianato de faloidina-fluoresceína marcado (0,5 mg/mL de metanol)Sigma-AldrichP5282-.1MGPhalloidin-FITC
Solución salina tamponada con fosfatoThermo Fisher Scientfic14190-094PBS
Células endoteliales microvasculares de retina humana primariacelularesACBRI 181
ProLong Glass Mountant Antidecoloración con NucBlueInvitrogen de ThermoFisher Reactivo
QIAGEN79306
Factor de crecimiento endotelial vascular humano recombinantePeproTech100-20VEGF
Placa de Petri cuadradaGreiner688102
TrizolQiagen79306
TripsinaPAN-BiotecP10-024100
VEGF-R2 (monoclonal)ThermoFisher Scientific Inc.B.309.4
Fabricante de heridasSartorius4493
de 11088858001 Medio de Sistemas de lisis QIAzol 2260939 Scientific

Referencias

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