Artículo de método

Detección eficaz de células poblacionales del lado de Hoechst mediante citometría de flujo

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DOI:

10.3791/67012

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23 de agosto de 2024

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1Institute of Hematology, Department of Hematology, State Key Laboratory of Biotherapy, West China Hospital, Sichuan University, 2The Lab of Aging Research, State Key Laboratory of Biotherapy, National Clinical Research Center for Geriatrics, West China Hospital, Sichuan University, 3Precision Medicine Research Laboratory, West China Hospital, Sichuan University

En este artículo

Resumen

Aquí, demostramos que los láseres de alta potencia de 375 nm y 405 nm pueden excitar eficazmente Hoechst 33342 y servir como una alternativa viable al láser de 355 nm para la detección de células de población lateral (SP), ampliando así la gama de láseres disponibles en aplicaciones de citometría de flujo.

Resumen

Las células de la población lateral (SP) se identifican mediante tinción de Hoechst 33342 y se analizan mediante citometría de flujo (FCM). El método SP de Hoechst se utiliza para el aislamiento de células madre en función de las propiedades de eflujo de colorante de los transportadores de casetes de unión a ATP (ABC). El método se empleó inicialmente para la identificación y el aislamiento de células madre hematopoyéticas (HSC), pero ahora ha evolucionado para centrarse principalmente en la identificación y el aislamiento de células madre cancerosas (CSC). El método de detección tradicional de FCM utiliza un láser de 355 nm para excitar el tinte y detectar células SP. A través de este estudio, hemos identificado con éxito enfoques alternativos para la excitación del colorante que pueden reemplazar eficazmente la detección de células SP utilizando un láser de 355 nm. Esto se logra mediante la utilización de láseres de alta potencia de 375 nm o 405 nm. Esto nos permite ejercer una selectividad mejorada en la detección de células SP en lugar de limitarnos únicamente a la citometría de flujo láser de 355 nm.

Introducción

Las células de la población lateral (SP) se identifican mediante tinción de Hoechst 33342 y se analizan mediante citometría de flujo (FCM). Las células SP se caracterizan por el bombeo del tinte de ADN fluorescente fuera de las células a través de su transportador de casete de unión a ATP (ABC) 1,2. El método se estableció originalmente para aislar células madre hematopoyéticas (HSC) de médula ósea murina1. Las células SP de médula ósea se enriquecieron con una población de HSCs caracterizadas por CD117+Sca-1+Lin-Thy1 de baja expresión 3,4. A partir de entonces, el método se utilizó ampliamente para aislar y enriquecer células madre de otros tejidos, como el músculo cardíaco5, el hígado6, el pulmón7, el riñón8 y el prosencéfalo9. En particular, el método se ha aplicado para aislar células madre cancerosas (CSC) en la última década. Las CSC representan una pequeña población de células que poseen las propiedades de iniciación tumoral, autorrenovación, resistencia a la quimioterapia y potencial metastásico10. Las CSC se identificaron inicialmente en neoplasias malignas hematopoyéticas11 y posteriormente se observaron en varios tumores sólidos como los carcinomas de próstata12, ovario13,14 gástrico,15 de mama y pulmón16. A pesar de la disponibilidad de varias técnicas para la identificación de CSC, la técnica SP sigue siendo una opción preferida debido a su amplia aplicabilidad en diversos tejidos y líneas celulares. Además, es una técnica valiosa que aísla CSCs utilizando la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS)16,17,18. Los hallazgos experimentales demuestran que las células SP exhiben una tumorigénesis pronunciada y muestran niveles elevados de expresión de genes asociados a células madre19,20. Nuestro estudio previo21 también ha demostrado que el análisis transcriptómico de células SP aisladas en mieloma múltiple revela un enriquecimiento de las vías de señalización asociadas con las células madre, como la vía del erizo. Mientras tanto, realizamos análisis de enriquecimiento de vías sobre los genes expresados diferencialmente en las células SP de la leucemia mielógena aguda22. Los genes alterados se enriquecieron en vías relacionadas con las células madre (Wnt/β-catenina, TGF-β, Hedgehog, Notch). Encontramos que las células SP 1 x 105 podían formar tumores en ratones BALB/c nulos22, mientras que las células no SP no podían, lo que indica que las células SP tenían características de células madre de leucemia. La eficacia del método Hoechst SP en la identificación de CSCs es evidente.

El protocolo SP de Hoechst se ha perfeccionado y mejorado a lo largo de la investigación. El protocolo implica un control estricto de la concentración de colorante, la densidad celular, la temperatura y la duración de la incubación, la composición del tampón y el valor de pH. Las muestras de células preparadas de acuerdo con este protocolo se sometieron a análisis de citometría de flujo. Debido a la excitación del colorante de Hoechst con un láser UV a 355 nm y a la detección de su emisión de fluorescencia utilizando un filtro de 690/50 nm (Hoechst Red) y un filtro de 450/50 nm (Hoechst Blue), se requiere un láser de 350 nm para FCM. Sin embargo, los láseres de 350 nm no suelen equiparse en la mayoría de los FCM debido a su alto coste. Por lo tanto, intentamos encontrar un enfoque alternativo para la excitación del colorante para la detección efectiva de células SP mediante citometría de flujo. En este estudio, se evaluó la capacidad de los láseres de 375 nm y 405 nm para detectar células SP y se comparó con la del láser de 355 nm. Nuestros hallazgos demuestran una notable similitud entre las células SP detectadas por los láseres de 355 nm, 375 nm y 405 nm. Estos resultados sugieren que los láseres de alta potencia de 375 nm y 405 nm pueden servir como alternativas viables al láser de 355 nm para la detección de células SP. La inclusión de fuentes de luz de excitación adicionales para Hoechst 33342 facilita el uso de más modelos de citometría de flujo.

Protocolo

Los experimentos de este estudio utilizaron un total de 10 ratones C57BL/6 de entre 8 y 12 semanas de edad. Las operaciones experimentales se llevaron a cabo de acuerdo con un protocolo que fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Sichuan (#201609309). Los materiales experimentales y los parámetros de citometría de flujo utilizados en este artículo se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Aislamiento y recolección de células de médula ósea de ratón

  1. Eutanasia de ratones en estricta conformidad con las directrices institucionales. Para inducir la inconsciencia en el ratón, administre anestésicos inhalatorios comenzando con isoflurano al 2%, seguido de un aumento gradual de la dosis a isoflurano al 5% hasta el cese de la respiración.
  2. Disecciona los ratones en el quirófano o en la vitrina de gases. Limpiar y esterilizar los ratones con etanol al 70%.
  3. Corta completamente la piel y el músculo de la pierna con unas tijeras afiladas y disecciona los fémures.
  4. Triture el fémur suavemente con una varilla de molienda en un mortero y enjuague las células de la médula ósea con medio DMEM hasta que el hueso se vuelva blanco.
  5. Filtre las células de médula ósea obtenidas con un filtro de 100 μm en tubos de 15 mL. Centrifugar a 800 x g durante 5 min a 4 °C.
  6. Deseche el sobrenadante y lise los glóbulos rojos residuales con 1 ml de tampón de lisis de glóbulos rojos durante 1 min a 4 °C. Centrifugar a 800 x g durante 5 min a 4 °C. Después de la centrifugación, lavar de nuevo con medio DMEM.
  7. Vuelva a suspender las células en 2 mL de solución de incubación (medio DMEM + 5% FBS), cuente las células con un contador automático de células y ajuste la concentración celular a 1,0 x 106 células/mL con solución de incubación.

2. Tinción celular

  1. Complemente 2 mL de suspensión de células de médula ósea de cada ratón con 5 μg/mL de Hoechst 33342. A otra alícuota de 1 mL, añadir 100 μM de verapamilo como control negativo.
  2. Incubar en un baño de agua a 37 °C durante 90 min con agitación suave cada 30 min.
  3. Después de la incubación, enfríe las células en hielo durante 5 min y luego centrifuga a 250 x g durante 5 min a 4 °C. Vuelva a suspender las células en una solución de funcionamiento en frío (HBSS + 2% FBS). Centrifugar a 4 °C durante 5 min y desechar el sobrenadante.
  4. Vuelva a suspender el pellet celular resultante en 500 μL de solución corriente por muestra. Antes del análisis de FCM, suplementar las células con 2 μg/mL de yoduro de propidio (PI) y colocarlas en hielo durante aproximadamente 5 min.

3. Citometría de flujo

NOTA: Para obtener un resumen de los diversos sistemas y configuraciones utilizados, consulte la Tabla 1.

  1. Calibrar los valores del coeficiente de variación (CV) de los canales requeridos utilizando fluorosferas de control de calidad (QC) diario en los FCM y realizar pruebas de muestra después de completar con éxito el control de calidad.
    1. Seleccione el acceso directo del software del escritorio e inicie el software.
    2. Seleccione Iniciar control de calidad/estandarización en el menú Control de calidad/Estandarización para acceder al experimento de control de calidad.
    3. Inserte el tubo de muestra de fluorosferas QC en el soporte del tubo.
    4. Seleccione Iniciar para cargar el ejemplo y comenzar a ejecutar el procedimiento de control de calidad. Los FCM están listos para su uso después de que se apruebe el control de calidad.
  2. Excite el colorante Hoechst 33342 de las mismas muestras con un láser de 355 nm, 375 nm y 405 nm, respectivamente, para la detección del rojo de Hoechst en el canal de 690/50 nm y del azul de Hoechst en el canal de 450/50 nm.
    1. Para crear un nuevo experimento, seleccione Nuevo experimento en el menú Archivo, especifique la ruta del archivo y guarde el experimento.
    2. Seleccione Establecer canal en el menú Configuración. Seleccione la casilla de verificación de señal de canal (Y585, V450, V660, NUV450, NUV660, UV450, UV660) y, a continuación, añada el nombre del reactivo en la columna Etiqueta (Y585: PI; V450: Azul Hoechst-405 nm; V660: Hoechst rojo-405 nm; NUV450: Azul Hoechst-375 nm; NUV660: Azul Hoechst-375 nm; UV450: Azul Hoechst-355nm; UV660: Azul Hoechst-355 nm).
    3. Haga clic en los iconos Pseudo Trazados de color en el área de trazado para crear trazados. Seleccione un nombre de eje para cambiar el canal que se muestra.
    4. Haga clic en Agregar tubo en la pantalla Tubo de ensayo para crear nuevos tubos de muestra y cambiar sus nombres.
    5. Seleccione Ejecutar para cargar la muestra, ver las gráficas y establecer las puertas. Ajuste la configuración de ganancia y umbral. Seleccione Grabar para guardar los datos.
  3. Diseñe la lógica de configuración de la puerta.
    1. Para el primer trazado, haga clic en el eje X para seleccionar FSC-W y haga clic en el eje Y para seleccionar FSC-A. Seleccione Puerta poligonal para dibujar la puerta A para rodear la celda individual y excluir las celdas adherentes (Figura 1A).
    2. Para el segundo trazado, haga clic en el eje X para seleccionar FSC-A y haga clic en el eje Y para seleccionar SSC-A. Seleccione Puerta poligonal para dibujar la puerta B para separar las celdas no fragmentarias y excluir los desechos celulares (Figura 1B).
    3. Para el tercer gráfico, haga clic en el eje X para seleccionar PI-A y haga clic en el eje Y para seleccionar SSC-A. Seleccione la puerta del polígono para dibujar la puerta D. Seleccione las células vivas que exhiben PI negativo (Figura 1C) y dibuje la puerta C para obtener células vivas.
    4. Para el cuarto gráfico bidimensional, haga clic en el eje X para seleccionar Hoechst Red y haga clic en el eje Y para seleccionar Hoechst Blue. Haga clic con el botón derecho en el gráfico y seleccione Propiedad en el menú desplegable. Seleccione Formato lineal f o ambosel eje X y el eje Y. Seleccione Puerta poligonal para dibujar la puerta SP para obtener celdas SP (Figura 1D).
  4. Para evaluar la elegibilidad de la muestra, utilice 355 nm de un citómetro de flujoespecífico 23 para la detección de células SP.
  5. Utilice los láseres de 355 nm (potencia del láser: 20 mW) y 405 nm (potencia del láser: 80 mW) simultáneamente para detectar tanto las células de control (con verapamilo añadido) como las células experimentales.
  6. Adquiera señales de fluorescencia en los canales de 690/50 nm y 450/50 nm correspondientes a los dos láseres. Observe la estimulación efectiva del colorante Hoechst 33342 mediante láseres de 355 nm y 405 nm con células SP claras (Figura 2B-C).
  7. Para las mismas muestras, utilice los láseres de 375 nm (potencia del láser: 60 mW) y 405 nm (potencia del láser: 80 mW) para la detección de células.

Resultados

En la Figura 2, el grupo de control fue tratado con verapamilo, que bloquea los transportadores ABC en las células madre para evitar la eliminación de Hoechst 33342. De este modo, las células madre del grupo no verapamilo expulsan Hoechst 33342 y forman una población de células negativas conocidas como células SP. El láser de 355 nm excitó eficazmente el colorante Hoechst 33342, lo que resultó en una observación clara de las células SP de la médula ósea (Figura 2A). Se encontró que las células SP de las mismas muestras detectadas por el láser de 355 nm y el láser de 405 nm eran esencialmente idénticas (Figura 2D).

A partir de la Figura 2 y la Figura 3, vimos que otros modelos de medidores de flujo no tradicionales también pueden identificar celdas SP. Los resultados indican que los láseres de 375 nm y 405 nm excitaron eficazmente Hoechst 33342 para obtener células SP (Figura 3A-B). Cuando sea necesario detectar o aislar CSCs o HSCs, podemos optar por un láser de 375 nm o 405 nm en lugar de un láser de 355nm.

figure-results-1
Figura 1: Lógica de configuración de puerta basada en citometría de flujo para detectar células SP. (A) Se utilizaron FSC-A y FSC-W para excluir las células adherentes. La puerta A representa el clúster de una sola célula. (B) Se emplearon los parámetros de FSC-A y SSC-A para la remoción de desechos celulares. La puerta B representa el grupo de células no fragmentarias. (C) Se seleccionaron células vivas que exhibían yoduro de propidio (PI) negativo. La puerta C representa el grupo de células vivas. (D) Las señales de fluorescencia se adquirieron a través de los canales de 690/50 nm (Hoechst-rojo) y 450/50 nm (Hoechst-azul). La puerta SP representa el grupo de células SP. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: El láser de 405 nm de alta potencia detecta las células SP con la misma eficacia que el láser de 355 nm. (A) El colorante Hoechst 33342 fue excitado por el láser de 355 nm de un citómetro de flujo convencional para detectar las células SP de la médula ósea. (B, C) Las células SP de la médula ósea se identificaron mediante los láseres de 355 nm y 405 nm del mismo FCM. (D) Se encontró que las células SP de las mismas muestras detectadas por el láser de 355 nm y el láser de 405 nm eran esencialmente idénticas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-3
Figura 3: Los láseres de alta potencia de 375 nm y 405 nm son capaces de detectar células SP. (A) El láser de alta potencia de 375 nm puede detectar células SP. (B) Las células SP de la médula ósea también se pueden detectar utilizando los láseres de 405 nm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tipo de láserLongitud de onda del láser (nm)Potencia del láser (mW)Filtro rojo Hoechst (nm)Filtro azul Hoechst (nm)
Ecualizador Moflo AstriosGas argón355100692/75448/59
CytoFLEX LXSemiconductor35520690/50450/50
40580690/50450/50
CytoFLEX SSemiconductor37560690/50450/50
CytoFLEX SRTSemiconductor40580690/50450/50

Tabla 1: Resumen de las configuraciones de los citómetros de flujo.

Discusión

Utilizamos el protocolo descrito para llevar a cabo tres experimentos, con cada ensayo con 3-4 ratones, lo que resultó en un total de 10 ratones. La proporción de células SP osciló entre el 0,05% y el 0,76%. Es importante tener en cuenta que se observaron variaciones individuales entre los ratones. Utilizamos cuatro citómetros de flujo para analizar las muestras de Hoechst. Se observa que la excitación del colorante de Hoechst por un láser de 20 mW a 355 nm en la nueva versión de la citometría de flujo es equivalente a la de un láser de 100 mW a 355 nm en la citometría de flujo antigua. Este fenómeno se puede atribuir a la variación en los tipos de láser empleados en ambos sistemas. La razón potencial del efecto observado de los láseres de 375 nm y 405 nm podría atribuirse a la sustancial potencia de salida de ambos láseres junto con la utilización del detector de fotodiodos de avalancha (APD). El canal Red-A de Hoechst capturó la longitud de onda larga casi roja de 690 nm, donde la eficiencia de conversión fotoeléctrica del tubo fotomultiplicador (PMT) era relativamente baja. Sin embargo, el APD demostró una eficiencia de conversión fotoeléctrica aproximadamente diez veces mayor que la del PMT24. Por lo tanto, cuando se combinan con láseres de alta potencia de 375 nm y 405 nm, los detectores APD distinguen de manera eficiente las celdas SP. El láser de 405 nm no solo detecta eficazmente las células SP, sino que también exhibe una capacidad superior para distinguir un subconjunto de poblaciones débilmente positivas de Hoechst Red en comparación con el láser de 355 nm.

El paso crítico del protocolo es utilizar la citometría de flujo con un láser de 375 nm o un láser de 455 nm para detectar células con canales de 690/50 nm (Hoechst-red) y 450/50 nm (Hoechst-blue). Si bien la técnica detecta células SP con láseres de 375 nm y 405 nm en lugar de láser de 355 nm (láser tradicional para analizar células SP1), que son más comunes en los FCM, se requieren láseres de alta potencia de 375 nm y 405 nm. Esto lleva a las limitaciones de esta tecnología. La importancia del método es ampliar la gama de láseres utilizados para detectar los tintes de Hoechst, de modo que se puedan utilizar otros modelos de citometría de flujo para la detección de células SP.

Divulgaciones

No se declaran conflictos de interés.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por las subvenciones a J.H. de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (No. 81800207). La asistencia de Beckman Coulter, Inc. en la prestación de apoyo para la citometría de flujo y la calibración de parámetros es muy apreciada. Agradecemos a Jiao Chen del Laboratorio Estatal Clave de Enfermedades Orales del Hospital de Estomatología de China Occidental de la Universidad de Sichuan, y a Yu Qi del Centro de Investigación de Medicina Regenerativa del Hospital de China Occidental de la Universidad de Sichuan, por su asistencia en la adquisición de datos de citometría de flujo.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Contador automático de celdasCountstar1M1200
Filtro de celdas (100 y micro; m)BIOFILCSS-013-100
Fluorosferas de control de calidad diario BeckmanCoulterB5230
Modificación de Dulbecco del medio de Eagle con 4,5 g/L de glucosa (medio DEMEM)CORNING10-013-CVRC
Suero fetal bovinoCORNING35-081-CV
HBSSHycloneSH30030.02
Hoechst 33342Sigma-AldrichB2261
Yoduro de propidio (PI)Sigma-AldrichP4170
Tampón de lisis de glóbulos rojosBeyotimeC3702
VerapamiloSigma-AldrichV4629

Referencias

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