Aquí, demostramos que los láseres de alta potencia de 375 nm y 405 nm pueden excitar eficazmente Hoechst 33342 y servir como una alternativa viable al láser de 355 nm para la detección de células de población lateral (SP), ampliando así la gama de láseres disponibles en aplicaciones de citometría de flujo.
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Artículo de método
Detección eficaz de células poblacionales del lado de Hoechst mediante citometría de flujo
En este artículo
Resumen
Resumen
Las células de la población lateral (SP) se identifican mediante tinción de Hoechst 33342 y se analizan mediante citometría de flujo (FCM). El método SP de Hoechst se utiliza para el aislamiento de células madre en función de las propiedades de eflujo de colorante de los transportadores de casetes de unión a ATP (ABC). El método se empleó inicialmente para la identificación y el aislamiento de células madre hematopoyéticas (HSC), pero ahora ha evolucionado para centrarse principalmente en la identificación y el aislamiento de células madre cancerosas (CSC). El método de detección tradicional de FCM utiliza un láser de 355 nm para excitar el tinte y detectar células SP. A través de este estudio, hemos identificado con éxito enfoques alternativos para la excitación del colorante que pueden reemplazar eficazmente la detección de células SP utilizando un láser de 355 nm. Esto se logra mediante la utilización de láseres de alta potencia de 375 nm o 405 nm. Esto nos permite ejercer una selectividad mejorada en la detección de células SP en lugar de limitarnos únicamente a la citometría de flujo láser de 355 nm.
Introducción
Las células de la población lateral (SP) se identifican mediante tinción de Hoechst 33342 y se analizan mediante citometría de flujo (FCM). Las células SP se caracterizan por el bombeo del tinte de ADN fluorescente fuera de las células a través de su transportador de casete de unión a ATP (ABC) 1,2. El método se estableció originalmente para aislar células madre hematopoyéticas (HSC) de médula ósea murina1. Las células SP de médula ósea se enriquecieron con una población de HSCs caracterizadas por CD117+Sca-1+Lin-Thy1 de baja expresión
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Protocolo
Los experimentos de este estudio utilizaron un total de 10 ratones C57BL/6 de entre 8 y 12 semanas de edad. Las operaciones experimentales se llevaron a cabo de acuerdo con un protocolo que fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Sichuan (#201609309). Los materiales experimentales y los parámetros de citometría de flujo utilizados en este artículo se enumeran en la Tabla de Materiales.
1. Aislamiento y recolección de células de médula ósea de ratón
- Eutanasia de ratones en estricta conformidad con las directrices institucionales. Para inducir la in....
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Resultados
En la Figura 2, el grupo de control fue tratado con verapamilo, que bloquea los transportadores ABC en las células madre para evitar la eliminación de Hoechst 33342. De este modo, las células madre del grupo no verapamilo expulsan Hoechst 33342 y forman una población de células negativas conocidas como células SP. El láser de 355 nm excitó eficazmente el colorante Hoechst 33342, lo que resultó en una observación clara de las células SP de la médula ósea (Figura 2A
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Discusión
Utilizamos el protocolo descrito para llevar a cabo tres experimentos, con cada ensayo con 3-4 ratones, lo que resultó en un total de 10 ratones. La proporción de células SP osciló entre el 0,05% y el 0,76%. Es importante tener en cuenta que se observaron variaciones individuales entre los ratones. Utilizamos cuatro citómetros de flujo para analizar las muestras de Hoechst. Se observa que la excitación del colorante de Hoechst por un láser de 20 mW a 355 nm en la nueva versión de la citometría de flujo es equivalente a l.......
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Divulgaciones
No se declaran conflictos de interés.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por las subvenciones a J.H. de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (No. 81800207). La asistencia de Beckman Coulter, Inc. en la prestación de apoyo para la citometría de flujo y la calibración de parámetros es muy apreciada. Agradecemos a Jiao Chen del Laboratorio Estatal Clave de Enfermedades Orales del Hospital de Estomatología de China Occidental de la Universidad de Sichuan, y a Yu Qi del Centro de Investigación de Medicina Regenerativa del Hospital de China Occidental de la Universidad de Sichuan, por su asistencia en la adquisición de datos de citometría de flujo.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Contador automático de celdas | Countstar | 1M1200 | |
| Filtro de celdas (100 y micro; m) | BIOFIL | CSS-013-100 | |
| Fluorosferas de control de calidad diario Beckman | Coulter | B5230 | |
| Modificación de Dulbecco del medio de Eagle con 4,5 g/L de glucosa (medio DEMEM) | CORNING | 10-013-CVRC | |
| Suero fetal bovino | CORNING | 35-081-CV | |
| HBSS | Hyclone | SH30030.02 | |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | |
| Yoduro de propidio (PI) | Sigma-Aldrich | P4170 | |
| Tampón de lisis de glóbulos rojos | Beyotime | C3702 | |
| Verapamilo | Sigma-Aldrich | V4629 |
Referencias
- Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J Exp Med. 183 (4), 1797-1806 (1996).
- Zhou, S., et al.
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Reimpresiones y permisos
