Method Article

Aislamiento, caracterización y análisis proteómico de vesículas extracelulares derivadas del plasma para el descubrimiento de biomarcadores cardiovasculares

DOI:

10.3791/67083

⸱

January 31st, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiology, Angiology and Pulmonology, University Hospital Heidelberg, 2Heart and Vascular Center, Semmelweis University, 3Core Facility for Mass Spectrometry and Proteomics, Centre for Molecular Biology at Heidelberg University (ZMBH), 4German Centre for Cardiovascular Research (DZHK), Partner site Heidelberg/Mannheim

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este artículo describe una metodología para el aislamiento, caracterización y cuantificación de vesículas extracelulares (EV) derivadas del plasma humano y presenta un flujo de trabajo para el análisis sin etiquetas del proteoma EV utilizando cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS).

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las vesículas extracelulares (VE) son nanopartículas no replicables derivadas de células, encerradas en bicapas lipídicas. En la actualidad, los VE han llamado la atención en la investigación cardiovascular debido a su papel en la regulación de la comunicación intercelular, lo que podría servir como valiosos biomarcadores de las enfermedades cardiovasculares. Sin embargo, el proteoma EV y su potencial como biomarcador en el diagnóstico cardiovascular siguen siendo poco conocidos. Este protocolo presenta un método estandarizado para el aislamiento y cuantificación de VE derivadas del plasma y el análisis de su carga proteica utilizando muestras de plasma de pacientes que acuden a la Unidad de Dolor Torácico de un gran hospital universitario. Después de la flebotomía de rutina, las EV se aíslan del plasma mediante ultracentrifugación diferencial. El enriquecimiento de proteínas marcadoras específicas de EV en aislados de EV se visualiza mediante inmunotransferencia, y la distribución de tamaño promedio y las concentraciones plasmáticas de EV se cuantifican mediante análisis de seguimiento de nanopartículas. Por último, se emplea la cromatografía líquida de ultra rendimiento-espectrometría de masas en tándem para el análisis sin marcadores del proteoma EV. Por lo tanto, este protocolo proporciona un enfoque integral para estudiar y utilizar los VE derivados del plasma como posibles portadores de información biológica crítica, así como para explorar su potencial como nuevos biomarcadores.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las vesículas extracelulares (VE), por nomenclatura no definida uniformemente, son nanopartículas rodeadas por una bicapa lipídica y liberadas por varios tipos de células, carentes de la capacidad de replicarse1. Este grupo diverso incluye exosomas, una subpoblación de EV de origen endosómico, que suele oscilar entre aproximadamente 40 nm y 160 nm de diámetro2. Detectables en numerosos fluidos corporales3, los VE facilitan la comunicación intercelular mediante la transferencia de varias biomoléculas activas como proteínas, ARNm, microARN y lípidos. Por lo tanto, los EV proporcionan información sobre su célula de origen a través de marcadores de superficie específicos de la célula y biomoléculas, con sus propiedades fuertemente influenciadas por la condición de la célula madre y su entorno4. Estas características han llevado a un creciente interés en el papel potencial de los VE como biomarcadores, particularmente en el contexto de las enfermedades cardiovasculares.

Numerosos estudios in vitro e in vivo han demostrado que el estrés hipóxico miocárdico conduce a una mayor liberación de EV 5,6,7. La investigación contemporánea sobre la carga de vehículos eléctricos se ha centrado en gran medida en el microARN unido a vehículos eléctricos, que tiene el potencial de servir como biomarcador en el diagnóstico de diversas enfermedades cardiovasculares 8,9,10. Por el contrario, la evidencia sobre el proteoma circulante del EV sigue siendo relativamente escasa, con aún menos estudios que investiguen el EV plasmático en pacientes cardiovasculares. En dos estudios exhaustivos sobre la EV derivada del plasma en pacientes que sufrían infarto de miocardio, los autores identificaron un perfil específico del proteoma EV inducido por isquemia con potencial relevancia diagnóstica 6,11.

Históricamente, el procesamiento metodológico de los VE ha demostrado ser un reto y, en la actualidad, no existe una recomendación definitiva para el enfoque óptimo del aislamiento, la caracterización y la cuantificación de los VE. Los métodos comúnmente utilizados para el aislamiento de EV incluyen la ultracentrifugación diferencial, la centrifugación en gradiente de densidad y los métodos de filtración, como la cromatografía de exclusión por tamaño1. De acuerdo con las directrices de consenso actuales, la caracterización de los aislados de EV debe incluir evidencia de al menos tres marcadores típicos de proteínas de superficie de EV, como tetraspaninas o anexinas, combinados con una modalidad de imagen1. Para examinar la carga de VE a nivel de proteína, se utilizan con mayor frecuencia métodos basados en anticuerpos, como Western blot o ELISA.

Dados los desafíos metodológicos asociados con el aislamiento y el procesamiento de EV circulante, este protocolo presenta una vía integral desde el reclutamiento de pacientes y la recolección de muestras hasta el posterior aislamiento, caracterización y cuantificación de EV en plasma. Además, este estudio muestra un flujo de trabajo para el aislamiento inmediato de EV derivado del plasma de pacientes que acuden al servicio de urgencias (Unidad de Dolor Torácico) en un centro de atención terciaria en el suroeste de Alemania, seguido del análisis sin etiquetas del proteoma EV plasmático específico de la enfermedad mediante cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS). El objetivo es facilitar un análisis de alto rendimiento para identificar proteínas unidas a EV enriquecidas diferencialmente en una gran cohorte de pacientes con diversas enfermedades cardiovasculares isquémicas, congénitas o (auto)inmunes en el diagnóstico inicial y a lo largo de la progresión y/o resolución de la enfermedad. Este enfoque de cribado proteómico busca identificar patrones de enriquecimiento de proteínas específicas de EV asociados con distintas vías de la enfermedad, con el objetivo final de descubrir nuevos biomarcadores de proteínas unidos a EV para mejorar el diagnóstico actual y el seguimiento terapéutico en enfermedades cardiovasculares.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Para este protocolo, se reclutó una cohorte de pacientes ejemplar compuesta por tres pacientes control sanos sin signos de enfermedad cardiovascular aparente o subyacente y dos pacientes con infarto de miocardio elevado no ST (IMSEST). La aprobación previa fue otorgada por la Junta de Revisión Institucional de la Facultad de Medicina de la Universidad de Heidelberg (aprobación IRB #S-351/2015), y se obtuvo el consentimiento por escrito de todos los pacientes antes del reclutamiento. Los pacientes fueron reclutados de la Unidad de Dolor Torácico del Departamento de Cardiología del Hospital Universitario de Heidelberg en función de la presentación clínica inicial, la historia clínica y los resultados de las pruebas diagnósticas.

Los criterios de inclusión para los pacientes control sanos incluyeron presentación clínica atípica o inespecífica, niveles de biomarcadores cardíacos dentro de los límites normales, sin antecedentes de enfermedad cardiovascular y hallazgos normales en cualquier prueba diagnóstica adicional. Los criterios de exclusión incluyeron antecedentes de neoplasia maligna o tratamiento citostático en los últimos cinco años, hemodiálisis, síndromes de hiperlipidemia familiar y cualquier antecedente de enfermedad cardiovascular. El diagnóstico de IAMSEST se realizó siguiendo las guías vigentes12, con estenosis coronaria hemodinámicamente relevante confirmada por coronariografía. Para cada paciente, se recolectaron hasta 36 mL de sangre de la vena antecubital en tubos de recolección suplementados con citrato a través de flebotomía estándar13, y las muestras de sangre se transportaron inmediatamente a 4 °C para su posterior procesamiento. Los detalles de los reactivos y equipos utilizados en este estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Aislamiento de vehículos eléctricos mediante centrifugación diferencial

NOTA: Se empleó un protocolo de centrifugación diferencial para aislar EV de muestras de plasma humano. Se llevaron a cabo dos ciclos de ultracentrifugación (UC) con fuerza centrífuga creciente para maximizar la pureza del pellet EV resultante.

  1. Aislamiento de plasma
    1. Comience a procesar muestras de sangre completa, enfriadas a 4 °C, dentro de los 120 minutos posteriores a la recolección para garantizar la integridad del plasma EV. Utilice tubos de extracción de sangre suplementados con citrato (citrato de 0,106 mol/L) para prevenir la coagulación.
    2. Diluya 9 mL de sangre entera cirada 1:1 en solución salina tamponada con fosfato (PBS) helada para reducir la viscosidad. Añadir 5 mL de medio de gradiente de densidad (1,077 g/mL) para la separación durante la centrifugación.
    3. Centrifugar a 600 × g durante 25-30 min a 4 °C. Pipetee cuidadosamente la fracción de plasma desde la parte superior de cada columna en tubos de centrifugación especializados. Continúe con los siguientes pasos o congele a -80 °C.
  2. Eliminación de restos celulares y cuerpos apoptóticos
    1. Centrifugar el plasma a 20.000 × g durante 15 min a 4 °C utilizando una ultracentrífuga con rotor de ángulo fijo, sin freno. En la parte inferior del tubo debe formarse una bolita visible de restos celulares y cuerpos apoptóticos.
  3. Aislamiento de vehículos eléctricos
    1. Transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo. Ultracentrífuga a 100.000 × g durante 2 h a 4 °C, sin frenar, para aislar el EV, que formará un pellet visible en la pared del tubo.
    2. Pipetear cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta electrónica, dejando aproximadamente 1 mL de plasma agotado en EV. Cambie a una pipeta de 1000 μL para el plasma restante, pipeteando lentamente para evitar perturbar el pellet EV. Incline el tubo gradualmente mientras pipetea para asegurarse de que no quede plasma en el tubo.
  4. Preparación para el análisis posterior
    1. Vuelva a suspender el pellet EV aislado de acuerdo con los requisitos de análisis posteriores: para el seguimiento de nanopartículas, vuelva a suspender el pellet EV de 9 mL de sangre total en 200 μL de PBS; para LC-MS/MS, resuspender EV aislado de 36 mL de sangre total en 50 μL de tampón RIPA 1x con inhibidor de proteasa/fosfatasa al 1%
    2. Transfiera el pellet EV resuspendido a un tubo de 1,5-2 ml. Almacenar a -80 °C hasta nuevo análisis o proceder según sea necesario.

2. Análisis de seguimiento de nanopartículas

NOTA: La cuantificación de la distribución del tamaño promedio de EV en muestras de plasma humano se llevó a cabo utilizando el Análisis de Seguimiento de Nanopartículas (NTA), un método de detección basado en láser que analiza el movimiento browniano de las nanopartículas.

  1. Diluciones de trabajo para NTA
    1. Diluya la solución madre de EV (pellet de EV resuspendido en 200 μL de PBS) con PBS helado en proporciones de 1:10, 1:50, 1:100 y 1:200. Cree varias diluciones de trabajo para determinar la dilución más adecuada para lograr un recuento final de 10-100 nanopartículas por fotograma durante el seguimiento de nanopartículas.
  2. Ejecución de NTA
    1. Encienda el instrumento NTA e inicie el software correspondiente en el ordenador conectado. Coloque la cámara dentro del ataúd láser y haga clic en Iniciar cámara para activarla.
    2. Extraiga 1 ml de PBS en una jeringa. Enchufe la jeringa en el tubo delantero y enjuague completamente el sistema de tubos, asegurándose de que no quede aire en la cámara. Supervise la cámara para detectar burbujas de aire o partículas contaminantes.
    3. Extraiga la dilución de trabajo EV preparada en una jeringa de 1 ml e inyéctela en la cámara.
    4. Ajuste la ganancia de pantalla para que coincida con el brillo del monitor en las pestañas Capturar y Procesar . Modifique el nivel de la cámara para diferenciar claramente las nanopartículas en la pantalla.
    5. Establezca un umbral de detección adecuado en la pestaña Proceso para ajustar la sensibilidad para diferenciar las partículas del ruido de fondo. Mantenga este valor constante para todas las mediciones dentro del mismo experimento.
    6. Enfoque la cámara usando la rueda a cada lado del instrumento hasta que las nanopartículas aparezcan nítidas en la pantalla.
    7. Establezca una temperatura constante (idealmente 22 °C) para todas las mediciones en la configuración de hardware , ya que el movimiento browniano depende de la temperatura.
    8. Haga clic en el botón Ejecutar para iniciar la medición. Introduzca el ID de la muestra y el disolvente en la ventana emergente.
    9. Grabe un mínimo de tres vídeos de 30 s para cada ejecución de muestra. Avance la muestra entre mediciones para capturar una muestra representativa de la solución de nanopartículas. Si dispone de una bomba de jeringa, ajústela a una velocidad constante y registre continuamente.
    10. Después del registro, el software calcula automáticamente la concentración y la distribución del tamaño de las nanopartículas. Haga clic en Cambiar para introducir el factor de dilución utilizado para la muestra y, a continuación, guarde los resultados haciendo clic en Exportar.
  3. Análisis de datos
    1. Analice los resultados utilizando los archivos de salida en un programa de software estadístico.

Análisis sin marcadores del proteoma EV mediante cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS)

NOTA: El análisis del proteoma EV sin marcadores se llevó a cabo utilizando la separación inicial de proteínas mediante electroforesis en gel de proteínas EV después de la lisis de membrana. Después de la digestión de proteínas en gel con tripsina, los péptidos se analizaron utilizando LC-MS/MS, con espectros individuales comparados con una base de datos de proteoma humano. En particular, si se desea un análisis no dirigido de los lisados de EV, se recomienda la proteómica de escopeta sin selección previa de un rango de peso molecular específico, lo que hace innecesarios los pasos 3.1.1-3.1.7 de este protocolo.

  1. Digestión de tripsina en gel
    1. Prepare una solución de EV resuspendido en 1x tampón RIPA agregando tampón de carga Laemmli de acuerdo con las instrucciones del fabricante (consulte la Tabla de materiales). Hervir las muestras a 95 °C durante 5 min.
    2. Cargue las muestras de EV, suplementadas con tampón de carga, junto con una escalera de proteínas en geles Bis-Tris al 4%-12% para electroforesis en gel de dodecil sulfato de sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE)14. Tiñe el gel con Coomassie Blue durante 1-4 h para visualizar las bandas de proteínas. Quita las manchas del gel con agua incubándolo durante la noche.
    3. Extirpe las bandas teñidas de Coomassie de las regiones de gel que contienen proteínas de interés con una hoja de bisturí.
    4. Lavar las piezas de gel con 60 μL de tampón de bicarbonato trietilamonio (TEAB) 1:1 (v/v) 50 mM y acetonitrilo (ACN), pH 8,5, durante 10 min. Encoja las piezas de gel tres veces durante 10 minutos cada una en 60 μL de ACN. Lavar de nuevo con 60 μL 50 mM TEAB, pH 8,5.
    5. Reducir las proteínas con 10 mM de ditiotreitol (DTT) en 100 mM de TEAB a 57 °C durante 30 min y deshidratar las piezas de gel.
    6. Alquilar las proteínas con 10 mM de yodoacetamida (IAA) en 100 mM de TEAB a 25 °C durante 20 min en la oscuridad.
    7. Lavar las piezas de gel con 60 μL de TEAB de 100 mM y encogerlas dos veces durante 10 min cada una en 60 μL de ACN.
    8. Añadir 50 mM de solución de tripsina TEAB, concentrada en consecuencia, a las piezas de gel secas. Incubar durante 4 h a 37 °C. Apague la reacción añadiendo 20 μL de ácido trifluoroacético (TFA) al 0,1%.
    9. Extraiga los péptidos resultantes incubando con 30 μL de 1:1 (v/v) 0,1% TFA y ACN durante 30 min. Deshidratar los geles con 20 μL de ACN durante 20 min, luego lavar de nuevo con 30 μL de TEAB de 100 mM durante 20 min.
    10. Encoja el gel dos veces con 20 μL de ACN durante 20 minutos cada una.
    11. Concentrar el sobrenadante recogido de cada paso de extracción en una centrífuga al vacío y disolver la muestra en 15 μL de AGT al 0,1%.
  2. Análisis LC-MS/MS
    1. Realice análisis LC-MS/MS de nanoflujo utilizando un espectrómetro de masas de cromatografía líquida de alta resolución acoplado a un analizador de trampas de iones electrostáticos.
    2. Utilice ácido fórmico (FA) al 0,1%/ACN al 1% como disolvente A y FA al 0,1%/ACN al 89,9% como disolvente B.
    3. Separe los péptidos en un gradiente lineal de 25 minutos: comience con un 3% de solvente B, aumente B al 23% durante 21 minutos, luego al 38% durante 4 minutos y proceda con un lavado al 95% B.
    4. Opere el espectrómetro de masas en modo de adquisición dependiente de datos, alternando automáticamente entre MS y MS2. Adquiera espectros MS (m/z 400-1600) con una resolución de 60.000 a m/z 400, generando espectros MS2 para hasta 15 precursores utilizando una energía de colisión normalizada de 27 y un ancho de aislamiento de 1,4 m/z.
  3. Búsqueda en la base de datos de proteínas
    1. Busque en los espectros MS/MS la base de datos de proteínas Swiss-Prot Homo sapiens (UP000005640, junio de 2020) y una base de datos de contaminantes personalizada (parte de MaxQuant, MPI Martinsried15,16) utilizando Proteome Discoverer 2.5 con Sequest HT.
    2. Configure los ajustes del programa de la siguiente manera: establezca la tolerancia de masa de iones de fragmentos en 0,02 Da y la tolerancia de masa de iones padre en 5 ppm. Especificar tripsina como la enzima utilizada para la digestión, y establecer el carbamidometilo como una modificación fija para la cisteína, con oxidación (metionina) y desamidación (asparagina, glutamina) como modificaciones variables. Incluyen la acetilación, la pérdida de metionina y su combinación como modificaciones variables del extremo proteico.
    3. Cuantificar péptidos utilizando el modo cuantificador de iones precursores, empleando el método Top N Average (n = 3) para el cálculo de la abundancia de proteínas17.

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Results

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Los EV se aislaron de muestras de plasma (n = 3) de pacientes sin enfermedad cardiovascular manifiesta, así como de pacientes con infarto de miocardio sin elevación del segmento ST (IMSEST; n = 2), utilizando el protocolo de ultracentrifugación diferencial establecido. La separación adecuada de la EV plasmática se confirmó mediante inmunotransferencia de las proteínas TSG-101, anexina 5 (Anx5) y CD9 enriquecidas con EV en aislados de EV en comparación con el plasma deplecionado con EV de los mismos pacientes (

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Discussion

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Este protocolo proporciona una metodología del mundo real, paso a paso, lista para usar para la separación y caracterización de EV plasmático, así como una introducción a un análisis de proteoma no marcado adecuado para su integración en la práctica clínica habitual. Una descripción detallada y el estricto cumplimiento de una metodología unificada para el aislamiento de VE a partir de muestras de plasma son importantes para garantizar la reproducibilidad de los resultados obtenidos. La l...

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Disclosures

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EG recibió honorarios para profesores de Roche Diagnostics, BRAHMS Thermo Scientific, Bayer Vital GmbH, AstraZeneca, Lilly Deutschland, Boehringer Ingelheim; recibió becas de investigación institucional de Roche Diagnostics y Daiichi Sankyo, y se desempeña como consultor para Roche Diagnostics, BRAHMS Thermo Scientific, Astra Zeneca, Novartis y Boehringer Ingelheim, fuera del trabajo presentado. JBK recibió financiación relacionada con el proyecto del Centro Alemán de Investigación Cardiovascular (DZHK) y Roche Diagnostics. El resto de los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses relacionado con el trabajo presentado.

Acknowledgements

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Los autores agradecen a Heidi Deigentasch, Amélie Werner y Elisabeth Mertz por su apoyo organizativo durante este proyecto.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
4x Bufffer de muestra LaemmliBio-rad1610747
10x RIPA-BufferAbcamab156034
Botella de policarbonato de 26,3 mL con conjunto de tapa para ultracentrifugaciónBeckman Coulter355654
5810R Centrífuga de sobremesaEppendorf5811000015
Acetonitrilo (ACN)Biosolve0001204101BS
Ditiothreitol (DTT)Sigma-Aldrich43816-10ML
Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (PBS)Sigma-AldrichD8537
Ácido fórmico 99% ULC/MS 100Biosolve0006914143BS
Histopaque - 1077Sigma-Aldrich10771
Yodoacetamida (IAA)Sigma-AldrichI6125-5G
Espectrómetro de masas Orbitrap Q Exactive HFThermo Fisher ScientificIQLAAEGAAPFALGMBDK
MOPS SDS búfer de funcionamientoThermo FisherB0001
NanoSight NS300Malvern Panalytical NS300
Nanosight NTA 3.2 SoftwareMalvern Panalytical 
NuPAGE 4  bis 12 %, Bis-Tris geles de proteínaInvitrogenNP0323
Optima XPN-80 ultracentrífuga de pieBeckman Coulter521-4180
PageRuler Plus Escalera de proteínas preteñidaThermo Fisher Scientific26619
Cóctel de inhibidores de proteasa/fosfatasa (100X)Tecnología de señalización celular5872S
Marcador de proteínasThermo Fisher26616
Proteome Discoverer 2.5Thermo Fisher
Q Exactive Plus Espectrómetro de masas híbrido cuadrupolo-orbitrapThermo Fisher ScientificIQLAAEGAAPFALGMBDK
Quick stain coomasssieServa35081.01
ReproSil-Pur 120 C18-AQ, 1.9 µ m 1 gDr. Maischr119.aq.0001
SDS-PAGE gel comercialThermo FisherNW00100BOX
S-Monovette  Citrat 9NC 0,106 mol/l 3,2%Sarstedt02.1067.001
Concentrador de vacío rápidoSavant
Swiss-Prot (Uniprot) Homo sapiens (UP000005640, junio de 2020) Base de datos de proteínasUniProthttps://www.uniprot.org/proteomes/UP000005640
Tampón de bicarbonato de trietilamonio (TEAB)Sigma-AldrichT7408
Ácido trifluoroacético (TFA) para HPLC >99%, 100 mLSigma-Aldrich302031-100ML
Tripsina MS-GradeThermo Fisher90058
Tipo 50.2 Ti Rotor de ángulo fijoBeckman Coulter337901
UHPLC Dionex Ultimate 3000Thermo Fisher Scientific ULTIM3000RSLCNANO
WaterBiosolve0023214102BS

References

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