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Cultivo glial entérico equino y aplicación al estudio de un mecanismo inflamatorio neural en el cólico equino

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DOI:

10.3791/67244

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4 de octubre de 2024

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1Department of Clinical Sciences, College of Veterinary Medicine, NC State University

En este artículo

Resumen

La glía entérica es cada vez más reconocida por su papel en la homeostasis intestinal y los procesos patológicos, incluidas las complicaciones postoperatorias. Los pacientes equinos que se recuperan de una laparotomía exploratoria de emergencia presentan un alto riesgo de afecciones inflamatorias postoperatorias, lo que destaca la importancia de establecer un cultivo primario de células primarias de glía entérica equina repetible para su estudio.

Resumen

Las condiciones inflamatorias postoperatorias del cólico equino (abdomen agudo) contribuyen no solo al aumento del costo del cliente, la incomodidad del paciente y el tiempo de hospitalización, sino que, en muchos casos, resultan potencialmente mortales. Una población única de células intestinales, la glía entérica, es cada vez más reconocida por su papel en la detección del entorno gastrointestinal y la comunicación con los tipos de células circundantes. Las interacciones entre la glía entérica y el epitelio intestinal pueden resultar críticas para establecer cómo la glía entérica equina puede alterar la barrera mucosa para modular la inflamación en la salud y los cólicos.

Para estudiar esta interacción, presentamos un método para establecer cultivos primarios de glías entéricas equinas a partir del yeyuno equino y exponer los cultivos a condiciones inflamatorias que se sabe que están presentes en los cólicos. Los cultivos gliales entéricos primarios se obtuvieron de caballos adultos sacrificados por razones no relacionadas con los cólicos. Las vellosidades intestinales y la lámina propia se microdiseccionaron para exponer la submucosa. La submucosa aislada se sometió a digestión enzimática con colagenasa, proteasa y albúmina sérica bovina durante 2-3 h. A continuación, la digestión mecánica que involucró centrifugación, pipeteo y filtros de celdas (40-100 μm), produjo un pellet utilizado para el recubrimiento en pocillos recubiertos de poli-L-lisina de 0,05 mg/mL a una concentración de ~400.000 células/300 μL de medio.

Después de la confluencia y el primer paso, las células gliales entéricas se expusieron a IL-1β recombinante equina (0, 10, 25 ng) durante 24 h. Para modelar las interacciones epitelio-glial en el momento del cólico, se añadió directamente a las monocapas de yeyuno equino confluentes mientras se medía la resistencia eléctrica transepitelial (TEER) utilizando una cámara EndOhm de doble electrodo. Estos datos demuestran solo una de las muchas aplicaciones potencialmente impactantes del cultivo de glía entérica equina.

Introducción

El cólico equino es la queja médica más prevalente que se presenta para consulta de urgencia1. Con hasta un 17% de esos caballos que requieren corrección quirúrgica, los esfuerzos para aumentar los resultados postoperatorios deben estar a la vanguardia dela investigación médica equina. En la actualidad, los pacientes con cólicos postoperatorios experimentan un alto riesgo de padecer varios trastornos potencialmente mortales, como sepsis/shock endotoxémico (12,3% de los pacientes) y íleo postoperatorio (13,7% de los pacientes)3. A pesar de los avances en el tratamiento de las complicaciones postoperatorias, sigue siendo necesario contar con tratamientos avanzados para prevenir o tratar estas afecciones.

Investigaciones recientes han puesto de manifiesto el estado inflamatorio local y sistémico de los pacientes con cólicos4. Por ejemplo, se ha demostrado que las proteínas proinflamatorias como el factor de necrosis tumoral (TNF) alfa, la interleucina 1β (IL-1β), la interleucina 6 (IL-6) y la proteína quimioatrayente de monocitos 1, aumentan significativamente su expresión en la mucosa intestinal cólica en comparación con el tejido intestinal normal4. Desde el punto de vista sistémico, se ha demostrado que el aumento del TNF alfa en el tejido intestinal se correlaciona con un aumento del riesgo de reflujo nasogástrico postoperatorio superior a 2 L, una medida general de la dismotilidad postoperatoria4. También se sabe que la administración de interleucina IL-1β y TNF alfa es capaz de inducir signos clínicos de shock séptico5.

Una posible explicación para el estado inflamatorio del tejido intestinal cólico y su relación con las complicaciones postoperatorias es la barrera epitelial intestinal. En la salud, los complejos de unión estrecha que unen la capa única de epitelio cilíndrico que recubre el tracto intestinal proporcionan una barrera funcional para limitar el contenido luminal y sus componentes bacterianos para que no lleguen al espacio submucoso y al torrente sanguíneo. Sin embargo, la distensión y el daño causados por la obstrucción intestinal asociada a los cólicos y la manipulación intestinal durante la cirugía pueden alterar esta función de barrera intestinal.

En cuanto a los componentes funcionales de la pared intestinal en su conjunto, se ha demostrado que la red glial entérica submucosa dentro del sistema nervioso entérico es crucial en el desarrollo fisiopatológico de las complicaciones postoperatorias asociadas a las vías inflamatorias y puede proporcionar una diana terapéutica específica 6,7,8,9 . La glía entérica no solo está presente en todo el tracto gastrointestinal, sino que actúa como sensores del entorno intestinal, influye en la señalización con numerosos tipos de células de la pared intestinal y regula directamente la barrera intestinal6. Por lo tanto, es justificable suponer que estos potentes sensores del intestino se activarían por lesión e inflamación y podrían producir una respuesta aguda como alteraciones en la permeabilidad de la barrera.

Este estudio es el primero en describir el cultivo de la glía entérica equina y, más específicamente, el papel de la glía entérica equina inflamatoria en la función de barrera intestinal. Aquí, presentamos métodos de cultivo primario de glía entérica submucosa equina y su respuesta a la exposición a IL-1β inflamatoria, evaluación del efecto de los productos gliales entéricos después de la exposición a IL-1β sobre la permeabilidad de las monocapas de enterocitos equinos y posible bloqueo mediante la aplicación de suero equino.

Protocolo

Se obtuvieron cultivos primarios de glía entérica equina de tres caballos sacrificados humanamente con una sobredosis de un barbitúrico por razones no relacionadas con este estudio. Los caballos seleccionados para los estudios de cultivo eran caballos adultos sin antecedentes actuales de enfermedad gastrointestinal.

1. Cultivo primario de glía entérica equina submucosa

  1. Cultive monocapas epiteliales equinas a partir de criptas yeyunales obtenidas de tres caballos equinos adultos separados.
    1. Cubra las placas de 24 pocillos con solución de recubrimiento durante 2 h a 37 °C o toda la noche a temperatura ambiente, lávelas 2 veces con agua estéril y guárdelas a temperatura ambiente hasta que las celdas estén listas para el recubrimiento.
    2. Después de la eutanasia humanitaria, dentro de los 60 minutos, retire una sección del yeyuno y colóquela en una solución fría de Ringer sobre hielo.
    3. Extraer una porción de 10 cm del yeyuno y abrirla en el borde antimesentérico para mantener las regiones no linfoides en el centro del tejido. Recorta la porción a una sección de aproximadamente 7 cm x 7 cm. Enjuague bien el tejido con una solución de Ringer fresca antes de la disección.
    4. Sujete el tejido con alfileres en una placa de Petri recubierta de elastómero de silicona en solución fría de Ringer o con la mucosa de PBS hacia arriba, estirando el tejido tanto como sea posible (Figura 1A).
    5. Extirpar las vellosidades intestinales con pinzas curvas (Figura 1B) seguidas de la capa de lámina propia de la región no linfoide de aproximadamente 5 cm x 5 cm (Figura 1C).
      NOTA: Estas capas se separan fácilmente de la submucosa (Figura 1B).
    6. Retire la submucosa en una hoja liberándola con tijeras de microdisección en una esquina y observe la separación natural mientras se retira la submucosa de la capa muscular circular interna del yeyuno (Figura 1D).
    7. Picar la capa submucosa recolectada en trozos de 2-5 mm y colocarlos en un tubo cónico de 50 mL que contenga 5 mL de "Organo-FBS" (Tabla 1), 0,825 mg de colagenasa, 5 mg de proteasa y 20 mg de albúmina sérica bovina. Incubar el tejido durante 2-3 h a 37 °C para la digestión enzimática.
    8. Después de la incubación, agregue 10 mL de "Organo + FBS" a temperatura ambiente para detener la acción de la enzima. Pipetear la mezcla de tejido hacia arriba y hacia abajo aproximadamente 15 veces con una pipeta serológica de 10 ml para disociar las células del tejido y, a continuación, centrifugar a 3.000 × g durante 3 min a temperatura ambiente.
    9. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet con PBS a temperatura ambiente de 10 mL pipeteando hacia arriba y hacia abajo aproximadamente 15 veces con una pipeta serológica de 10 mL para disociar las células del tejido.
    10. Centrifugar el tubo cónico a 3.000 × g durante 3 min a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet con 10 mL de temperatura ambiente "Organo + FBS" pipeteando hacia arriba y hacia abajo aproximadamente 15 veces con una pipeta serológica de 10 mL para disociar las células del tejido.
    11. Filtre las células en serie a través de un filtro de células de 100 μm, 70 μm y, a continuación, un filtro de células del tamaño de un poro de 40 μm.
    12. Centrifugar las células y los medios filtrados a 3.000 × g durante 3 minutos a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 1 mL de "Organo + FBS".
    13. Teñir con azul de tripán para identificar las células vivas y contarlas con un hemocitómetro.
    14. Siembre aproximadamente 400,000 células en 300 μL de "Organo + FBS" en cada pocillo de una placa de 24 pocillos y agregue factores de crecimiento a cada pocillo: N2 5 μL/pocillo, G5 5 μL/pocillo y B27 10 μL/pocillo. Coloque la placa de 24 pocillos en una incubadora a 37 °C con 5% de CO2 para permitir que las células se adhieran. Veinticuatro horas después, cambie el medio a "glía media" (Tabla 1) con los factores de crecimiento anteriores y cambie cada 48 h (Figura 2).

2. Citología inmunofluorescente

  1. Cultivar las células gliales entéricas desde el cultivo primario (P0) (paso 2.1.14) hasta un 70-80% de confluencia y hacerlas pasar una vez (P1).
  2. Fije las células de cultivo primario (P0) en los pocillos con paraformaldehído al 4% durante 5 minutos antes de la aplicación de azida PBS al 0,1%.
  3. Prepare una solución de saturación que consista en azida PBS, suero de burro al 4% y Triton-X al 0,5%. Añadir 300 μL de solución de saturación a los pocillos para permeabilizar las células durante 2 h a temperatura ambiente.
  4. Añadir el anticuerpo primario para el marcador glial, la proteína ácida fibrilar glial (GFAP), y el anticuerpo primario para el marcador de fibroblastos, la actina del músculo liso alfa, en diluciones 1:1.000 en solución de saturación para la incubación nocturna a 4 oC.
  5. Lavar 3 veces con PBS antes de añadir el anticuerpo secundario para la IgG anti-conejo de burro Alexa Fluor 594 y la IgG anti-ratón de cabra Alexa Flour 488 a una dilución de 1:500 en solución de saturación durante 2-3 h.
  6. Teñir los núcleos con 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) en una dilución de 1:1.000 en PBS durante 5 min.
  7. Después de tres lavados con PBS, almacene las células en azida de PBS al 0,1%.

3. Exposición a IL-1β de cultivo primario de glía entérica equina submucosa

  1. Cuando las células del primer paso (P1) alcancen el 70-80% de confluencia, realice el experimento de exposición a IL-1β. Exponga los pocillos a 0 ng, 10 ng y 25 ng de IL-1β durante 24 h. Después de 24 horas, almacene y almacene los medios de cada pocillo a -80 °C.

4. Cultivo de organoides equinos para la producción de monocapas de enterocitos

NOTA: Siguiendo el protocolo de Stewart et al. publicado en 2018, las criptas intestinales equinas almacenadas y las yemas que habían sido crioalmacenadas se ampliaron para estudios de enteroides, en 2D10.

  1. Utilice aproximadamente 700-1.000 yemas/fragmentos de cripta (40.000-50.000 células cuando se disocian en células individuales) por inserto transwell. Cubrir los insertos transwell con 42 μL de Matrigel al 0,05% antes de la adición de los enterocitos. Dejar que la Matrigel se fije en el inserto incubando durante 1 h a 37 oC. Aspirar el medio extra y dejar secar los transpocillos durante 30 min sin tapar. Añada 200 μL de medio DMEM-F12 a cada inserto transwell y almacene la placa a 37 °C hasta su uso.
  2. Lave las hamburguesas Matrigel que contienen los organoides con PBS y luego expóngalas a 500 μL de Cell Recovery mientras están en hielo. Pipetearlas repetidamente para asegurar la recolección completa de células en un tubo de 15 mL.
  3. Centrifugar el tubo a 300 × g durante 5 min a 4 °C, retirar el sobrenadante y suspender el pellet de células en el volumen objetivo de medio de células madre epiteliales intestinales (IESC). Calcule el volumen objetivo multiplicando el número deseado de monocapas por 200 μL de medio. (Tabla 1).
  4. Reviste previamente una jeringa de 1 ml en medios IESC y aspire la suspensión celular a través de una aguja de 16 G. Reemplace la aguja de 16 G por una aguja de 28 G y expulse la suspensión celular a través de ella para favorecer la separación de los organoides.
  5. Coloque 200 μL de la suspensión celular resultante en el lado apical de los transpocillos recubiertos y 500 μL de IESC, así como los factores de crecimiento descritos anteriormente, en el lado basal del insertotranspocillo 10. Cambie los medios y los factores de crecimiento cada 24-48 h hasta alcanzar la confluencia. Defina la confluencia como la densidad de celdas correspondiente a un TEER de 1.000 ohmsxcm 2,11. Para la medición, consulte el paso 5.1.

5. Permeabilidad monocapa de enterocitos equinos tras la exposición a citocinas inflamatorias y productos gliales entéricos equinos

  1. Utilice una cámara de medición de TEER de doble electrodo para cuantificar el TEER en las monocapas y establecer una lectura base en cada membrana permeable transwellable. Asegúrese de que el medio IESC y el transwell tengan 15 minutos para alcanzar la temperatura ambiente antes de tomar mediciones. Llene el recipiente de cultivo con 1,5 ml de medio IESC y asegúrese de que haya exactamente 200 μl de medio dentro del inserto transwell para que las líneas de fluido coincidan en el momento de la medición.
  2. Exponga la cara basolateral de los insertos transpocillos a citocinas inflamatorias de 25 ng de IL-1β, 10 ng y 25 ng de interleucina 6 (IL-6) por pocillo, o a productos gliales de cultivos expuestos a 10 ng o 25 ng de IL-1β. Exponga la cara basolateral de los insertos de control transwell a la glía media y a la glía media de cultivos no expuestos a IL-1β.
  3. Mida el TEER durante 45 min a intervalos de 10-15 min colocando cada transwell en la taza de cultivo.

6. Estadísticas

  1. Calcule el cambio de pliegue del TEER de cada transpozo para los puntos de tiempo: 0, 10, 20, 30 y 45 min.
  2. Utilizando el software de elección (ver Tabla de Materiales), compare las correlaciones entre la disminución de TEER y la exposición basolateral a IL-1β (25 ng), IL-6 (10 ng, 25 ng y 100 ng) y medios gliales (expuestos a 0 ng IL-1β, 10 ng IL-1β y 25 ng IL-1β) para controlar los medios utilizando una prueba t de una cola no apareada.

Resultados

La microdisección del yeyuno equino a la capa submucosa (Figura 1) con una digestión enzimática y mecánica adicional, podría producir cultivos celulares viables de glía entérica equina. Las células demostraron un pleomorfismo con una dominancia de células fusiformes consistente con la glía entérica de otras especies (Figura 2A). Los cultivos fueron positivos para el marcador glial selectivo, proteína ácida fibrilar glial (GFAP), con baja contaminación por fibroblastos (alfa SMA, Figura 2B). En algunos casos, la microdisección de las capas submucosas no se controló en un grado suficientemente alto, y los cultivos se contaminaron con altos porcentajes de fibroblastos observados a través de la inmunofluorescencia de la actina del músculo liso marcador de fibroblastos (Figura 3).

A continuación, como ejemplo de la utilidad del cultivo de glía entérica equina, se evaluó el impacto de la glía entérica expuesta a IL-1β sobre la función de la barrera epitelial intestinal. La exposición basolateral a los medios del cultivo de glía entérica submucosa equina expuesto a 10 ng y 25 ng de IL-1β durante 24 h aumentó significativamente la permeabilidad (p = 0,05 y 0,04, respectivamente, media de los medios de control = 0,9, media del grupo glial 10 ng IL-1β = 0,8, intervalo de confianza del 95% = -0,2 a 0,02, media del grupo glial 25 ng IL-1β = 0,8, intervalo de confianza del 95% = -0,1995 a 0,01060, n = 3-4) (Figura 4A). Sin embargo, la exposición de las monocapas epiteliales equinas basolaterales de 10-25 ng a la IL-6 equina, una citocina inflamatoria que se ha demostrado que es producida por la glía entérica expuesta a la IL-1β y que induce un aumento de la permeabilidad de los enterocitos en modelos de roedores12, no aumentó significativamente la permeabilidad de la monocapa de enterocitos equinos (Figura 4B)

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Figura 1: Aislamiento de la glía entérica del yeyuno equino por microdisección y digestión enzimática y mecánica. (A) El yeyuno se cortó a lo largo del borde antimesentérico y se fijó con el lado de la mucosa hacia arriba. (B) Las vellosidades intestinales se visualizaron por microscopía y se extirparon con un raspado suave hasta que se visualizó la lámina propia tenue. (C) A continuación, se retiró la capa de lámina propia hasta que las fibras musculares lisas fueron apenas visibles a través de la submucosa translúcida. (D) La submucosa se cubrió y se retiró de la capa muscular, haciendo cortes a las marcas fibrosas según fuera necesario. Las imágenes se obtuvieron con un microscopio de disección de 10x (B,C). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Imágenes de los cultivos de glía entérica submucosa equina. (A) La morfología estrellada (flechas), fusiforme (punta de flecha abierta) y ganglionar (punta de flecha cerrada) de la glía entérica equina se apreció mediante microscopía de contraste de fase. (B) La pureza de los cultivos se evaluó mediante tinción para GFAP, y para el marcador de fibroblastos, actina de músculo liso Barras de escala = 100 mm (A), 400 mm (B). Abreviaturas: GFAP = proteína ácida fibrilar glial; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Imágenes de cultivos de glía entérica submucosa equina no exitosos. La pureza de los cultivos se evaluó mediante tinción para GFAP (rojo) y para el marcador de fibroblastos, actina de músculo liso (verde), demostrando un alto porcentaje de contaminación por fibroblastos. La punta de flecha amarilla denota GFAP y la punta de flecha blanca actina de músculo liso. Barra de escala = 400 mm. Abreviatura: GFAP = proteína ácida fibrilar glial. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: TEER de monocapa epitelial equina después de la exposición a citocinas inflamatorias y productos gliales inflamatorios. (A) La exposición basolateral a medios de cultivo de glía entérica submucosa equina, expuesta a 10 ng y 25 ng de IL-1β durante 24 h, aumentó significativamente la permeabilidad (*p = 0,05 y 0,04, respectivamente, n = 3-4). (B) La exposición aguda de la monocapa de enterocitos equinos a 25 ng basolaterales de IL-1β y 10-25 ng de IL-6 equina no aumentó significativamente la permeabilidad de la monocapa epitelial equina (n = 2-4). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Reactivos para aislamiento y cultivo. Los siguientes reactivos se utilizaron para formular medios para el aislamiento de la glía entérica equina, el cultivo de la glía entérica y el cultivo de células madre epiteliales intestinales equinas. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Discusión

El objetivo de este estudio fue desarrollar un método repetible de cultivo primario de glía entérica submucosa equina y demostrar su aplicación para modelar las interacciones epitelio-gliales en el momento del cólico. El aislamiento y cultivo de la glía entérica, que es novedoso en el caballo, ha demostrado ser beneficioso para comprender las vías de las enfermedades intestinales en modelos de cerdos y roedores y en humanos 6,7,13,14. El estudio de esta población celular es potencialmente importante debido a su papel como sensores subepiteliales del entorno intestinal, así como a su capacidad para interactuar y comunicarse con las células circundantes dentro de la pared intestinal. Con su aguda capacidad de sensación, no es difícil imaginar un papel potencialmente crítico de la glía en el cólico equino, donde el tejido intestinal se ve estresado por la distensión, la isquemia y la posible manipulación quirúrgica6.

Trabajos previos de Lisowski et al. demostraron el aumento del estado inflamatorio del tejido intestinal equino en el momento de la cirugía de cólicos. La importancia de mitigar este ambiente inflamatorio se pone de manifiesto en los cultivos de glía entérica de roedores que han demostrado ser capaces de sintetizar productos con la capacidad de alterar la función de la barrera intestinal 7,12. La fuga de contenido luminal intestinal en la pared intestinal no solo conduciría a una respuesta inflamatoria, sino también a una posible infiltración en la circulación, lo que podría inducir un shock endotoxémico/sepsis. Desafortunadamente, los pacientes postoperatorios con cólicos equinos están plagados de numerosas complicaciones postoperatorias de base inflamatoria, como la sepsis y el íleo postoperatorio, que no solo reducen la supervivencia y la comodidad del paciente, sino que también aumentan los costos del cliente y la angustia emocional. El establecimiento de un modelo de interacciones epitelio-gliales en el momento del cólico puede dilucidar una posible vía de permeabilidad de la barrera intestinal equina en el cólico y una posible prevención.

El cultivo de glía entérica submucosa equina implica adaptaciones y limitaciones debidas a las características de la especie. Y lo que es más importante, el tiempo necesario para una digestión enzimática eficaz requería una titulación. Los autores encontraron que la incubación con las enzimas durante 2-3 h a 37 °C era necesaria para el aislamiento exitoso de la glía entérica equina. Además, permitir que los cultivos entéricos equinos alcancen más del 80% de confluencia antes del paso parece ser perjudicial para la viabilidad del cultivo. La principal limitación de este método en esta fecha es el tamaño de la muestra. Este estudio solo incluyó tejidos/células que se habían obtenido de caballos sometidos a cirugía de cólicos o eutanasia por razones no relacionadas con el estudio. El cultivo continuo de la glía entérica equina de sujetos adicionales, así como el desarrollo de un protocolo para la congelación y el almacenamiento de la glía entérica equina aumentarán en gran medida la potencia de este estudio.

Este estudio presenta la novedosa utilidad del cultivo glial entérico submucoso equino y el cultivo primario de enterocitos equinos como metodologías potenciales para ayudar a comprender el cólico equino y la enfermedad gastrointestinal. Además, si bien las monocapas epiteliales equinas cultivadas a partir de criptas intestinales aisladas y organoides han sido bien establecidas en el pasado, este estudio no solo continuó mostrando su utilidad como modelo, sino que también fomenta estudios adicionales que examinen la interacción con el enterocito intestinal equino y otros tipos de células que se encuentran dentro de la pared intestinal.

Las interacciones observadas entre estos tipos de células contienen aplicaciones potenciales tanto para los cólicos como para otros trastornos gastrointestinales inflamatorios, como la enfermedad inflamatoria intestinal (EII) y la colitis. Además, el perfeccionamiento continuo de los métodos de cultivo para la glía entérica y los enterocitos permitirá el establecimiento de estudios de cocultivo en el futuro. Además, mientras que el estudio actual se centra en la población glial entérica submucosa debido a su proximidad a la monocapa epitelial y el enfoque en la función de barrera intestinal, se puede realizar un trabajo adicional para cultivar y evaluar la función de la glía entérica equina a partir de los plexos mientéricos de la pared intestinal, lo que puede ayudar a determinar el impacto de la glía entérica equina inflamatoria en la motilidad15.

Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Agradecimientos

Los autores desean agradecer a la Fundación Morris Animal por su financiación de este proyecto.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Tampón HEPES de 1 MGibco15630-080
10 mM HEPESLife Technologies15630-106
2 mM GlutaMAXLife Technologies25050-061
4' 6-Diaminidino-2-PhenylindolInvitrogenD3571
Advanced DMEM/F12Life Technologies12634-010
Alfa músculo liso anticuerpo de actinaAbcam7817
Anfotericina BSigmaAA95294,4 g/mL alícuotas de stock, concentración final 1,1 y micro; g/mL
Anti-Antimicótico 1xGibco15240-096
B27Gibco12587010
Albúmina Suero BovinoSigmaAA3311
BSA 50 mg/mL solución madreSigmaA3311
CaCL2ACROS Organiics206791000Componente de Equine Ringer ' s Caldo 1: combine con otros ingredientes, luego agregue 100 mL de este caldo a un cilindro graduado y diluya a 1L con agua desionizada. Ajuste el pH a 7.4 con 5% de CO2.
Combine con Equine Ringer' s Stock 2 para completar " Campanero' s Solución".
CollagenasaSigma9891
DMEM-F12 mediosThermo Fisher11320033
Burro anti-conejo IgG Alexa Fluor 594Invitrogen21207
EVOM EndOhm doble electrodo cámara de medición TEERWorld Precision InstrumentsEVM-EL-03-01
EVOM Manual para la medición de TEERWorld Precision InstrumentsEVM-MT-03-01
G5Gibco17503012
solución de gentamicinaSigmaG1272Concentración final 20 µ g/mL
GFAP anticuerpoAbcam4674
Cabra anti-ratón IgG Alexa Fluor 488Invitrogen28175
IL-1 y beta; ELISAThermo FisherESIL1B
KClThermo FisherP330-500Componente de Equine Ringer' s Caldo 1: combine con otros ingredientes, luego agregue 100 mL de este caldo a un cilindro graduado y diluya a 1L con agua desionizada. Ajuste el pH a 7.4 con 5% de CO2.
Combine con Equine Ringer' s Stock 2 para completar " Campanero' s Solución".
Solución de L-glutaminaCorning25-00-Cl
MatrigelBD Bioscience354277
MgCl2Thermo FisherM33-500Componente de Ringer Equino s Caldo 1: combine con otros ingredientes, luego agregue 100 mL de este caldo a un cilindro graduado y diluya a 1L con agua desionizada. Ajuste el pH a 7.4 con 5% de CO2.
Combine con Equine Ringer' s Stock 2 para completar " Campanero' s Solución".
N2Gibco17502048
Na2HPO4Thermo FisherBP332-1Componente de Equine Ringer' s Caldo 2: combine con otros ingredientes, luego agregue 100 mL de este caldo a un cilindro graduado y diluya a 1L con agua desionizada. Ajuste el pH a 7.4 con 5% de CO2.
Combine con Equine Ringer' s Stock 1 para completar " Campanero' s Solución".
NaClThermo FisherS271-10Componente de Equine Ringer' s Caldo 1: combine con otros ingredientes, luego agregue 100 mL de este caldo a un cilindro graduado y diluya a 1L con agua desionizada. Ajuste el pH a 7.4 con 5% de CO2.
Combine con Equine Ringer' s Stock 2 para completar " Campanero' s Solución".
NaH2PO4Thermo FisherBP329-500Componente de Ringer Equino s Caldo 2: combine con otros ingredientes, luego agregue 100 mL de este caldo a un cilindro graduado y diluya a 1L con agua desionizada. Ajuste el pH a 7.4 con 5% de CO2.
Combine con Equine Ringer' s Stock 1 para completar " Campanero' s Solución".
NaHCO3Thermo FisherS637-212Componente de Equine Ringer' s Caldo 2: combine con otros ingredientes, luego agregue 100 mL de este caldo a un cilindro graduado y diluya a 1L con agua desionizada. Ajuste el pH a 7.4 con 5% de CO2.
Combine con Equine Ringer' s Stock 1 para completar " Campanero' s Solución".
Pluma/Solución estreptocócicaGemini400-109
Poly-L-lisinaSigmaP26360,5 mg/mL en 1x tampón de borato
Software PrismGraphPad
ProteasaSigmaP4630
Solución de bicarbonato de sodioSigmaS8761Solución madre al 7,5%

Referencias

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Cultivo glial entérico equino y aplicación al estudio de un mecanismo inflamatorio neural en el cólico equino
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