La glía entérica es cada vez más reconocida por su papel en la homeostasis intestinal y los procesos patológicos, incluidas las complicaciones postoperatorias. Los pacientes equinos que se recuperan de una laparotomía exploratoria de emergencia presentan un alto riesgo de afecciones inflamatorias postoperatorias, lo que destaca la importancia de establecer un cultivo primario de células primarias de glía entérica equina repetible para su estudio.
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Artículo de método
Cultivo glial entérico equino y aplicación al estudio de un mecanismo inflamatorio neural en el cólico equino
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Resumen
Resumen
Las condiciones inflamatorias postoperatorias del cólico equino (abdomen agudo) contribuyen no solo al aumento del costo del cliente, la incomodidad del paciente y el tiempo de hospitalización, sino que, en muchos casos, resultan potencialmente mortales. Una población única de células intestinales, la glía entérica, es cada vez más reconocida por su papel en la detección del entorno gastrointestinal y la comunicación con los tipos de células circundantes. Las interacciones entre la glía entérica y el epitelio intestinal pueden resultar críticas para establecer cómo la glía entérica equina puede alterar la barrera mucosa para modular la inflamación en la salud y los cólicos.
Para estudiar esta interacción, presentamos un método para establecer cultivos primarios de glías entéricas equinas a partir del yeyuno equino y exponer los cultivos a condiciones inflamatorias que se sabe que están presentes en los cólicos. Los cultivos gliales entéricos primarios se obtuvieron de caballos adultos sacrificados por razones no relacionadas con los cólicos. Las vellosidades intestinales y la lámina propia se microdiseccionaron para exponer la submucosa. La submucosa aislada se sometió a digestión enzimática con colagenasa, proteasa y albúmina sérica bovina durante 2-3 h. A continuación, la digestión mecánica que involucró centrifugación, pipeteo y filtros de celdas (40-100 μm), produjo un pellet utilizado para el recubrimiento en pocillos recubiertos de poli-L-lisina de 0,05 mg/mL a una concentración de ~400.000 células/300 μL de medio.
Después de la confluencia y el primer paso, las células gliales entéricas se expusieron a IL-1β recombinante equina (0, 10, 25 ng) durante 24 h. Para modelar las interacciones epitelio-glial en el momento del cólico, se añadió directamente a las monocapas de yeyuno equino confluentes mientras se medía la resistencia eléctrica transepitelial (TEER) utilizando una cámara EndOhm de doble electrodo. Estos datos demuestran solo una de las muchas aplicaciones potencialmente impactantes del cultivo de glía entérica equina.
Introducción
El cólico equino es la queja médica más prevalente que se presenta para consulta de urgencia1. Con hasta un 17% de esos caballos que requieren corrección quirúrgica, los esfuerzos para aumentar los resultados postoperatorios deben estar a la vanguardia dela investigación médica equina. En la actualidad, los pacientes con cólicos postoperatorios experimentan un alto riesgo de padecer varios trastornos potencialmente mortales, como sepsis/shock endotoxémico (12,3% de los pacientes) y íleo postoperatorio (13,7% de los pacientes)3. A pesar de los avances en el tratamiento de las complicaciones postoperatorias, sigue siendo necesario contar con tratamientos avanzados para prevenir o tratar estas afecciones.
Investigaciones recientes han puesto de manifiesto el estado inflamatorio local y sistémico de los pacientes con cólicos4. Por ejemplo, se ha demostrado que las proteínas proinflamatorias como el factor de necrosis tumoral (TNF) alfa, la interleucina 1β (IL-1β), la interleucina 6 (IL-6) y la proteína quimioatrayente de monocitos 1, aumentan significativamente su expresión en la mucosa intestinal cólica en comparación con el tejido intestinal normal4. Desde el punto de vista sistémico, se ha demostrado que el aumento del TNF alfa en el tejido intestinal se correlaciona con un aumento del riesgo de reflujo nasogástrico postoperatorio superior a 2 L, una medida general de la dismotilidad postoperatoria4. También se sabe que la administración de interleucina IL-1β y TNF alfa es capaz de inducir signos clínicos de shock séptico5.
Una posible explicación para el estado inflamatorio del tejido intestinal cólico y su relación con las complicaciones postoperatorias es la barrera epitelial intestinal. En la salud, los complejos de unión estrecha que unen la capa única de epitelio cilíndrico que recubre el tracto intestinal proporcionan una barrera funcional para limitar el contenido luminal y sus componentes bacterianos para que no lleguen al espacio submucoso y al torrente sanguíneo. Sin embargo, la distensión y el daño causados por la obstrucción intestinal asociada a los cólicos y la manipulación intestinal durante la cirugía pueden alterar esta función de barrera intestinal.
En cuanto a los componentes funcionales de la pared intestinal en su conjunto, se ha demostrado que la red glial entérica submucosa dentro del sistema nervioso entérico es crucial en el desarrollo fisiopatológico de las complicaciones postoperatorias asociadas a las vías inflamatorias y puede proporcionar una diana terapéutica específica 6,7,8,9 . La glía entérica no solo está presente en todo el tracto gastrointestinal, sino que actúa como sensores del entorno intestinal, influye en la señalización con numerosos tipos de células de la pared intestinal y regula directamente la barrera intestinal6. Por lo tanto, es justificable suponer que estos potentes sensores del intestino se activarían por lesión e inflamación y podrían producir una respuesta aguda como alteraciones en la permeabilidad de la barrera.
Este estudio es el primero en describir el cultivo de la glía entérica equina y, más específicamente, el papel de la glía entérica equina inflamatoria en la función de barrera intestinal. Aquí, presentamos métodos de cultivo primario de glía entérica submucosa equina y su respuesta a la exposición a IL-1β inflamatoria, evaluación del efecto de los productos gliales entéricos después de la exposición a IL-1β sobre la permeabilidad de las monocapas de enterocitos equinos y posible bloqueo mediante la aplicación de suero equino.
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Protocolo
Se obtuvieron cultivos primarios de glía entérica equina de tres caballos sacrificados humanamente con una sobredosis de un barbitúrico por razones no relacionadas con este estudio. Los caballos seleccionados para los estudios de cultivo eran caballos adultos sin antecedentes actuales de enfermedad gastrointestinal.
1. Cultivo primario de glía entérica equina submucosa
- Cultive monocapas epiteliales equinas a partir de criptas yeyunales obtenidas de tres caballos equinos adultos separados.
- Cubra las placas de 24 pocillos con solución de recubrimiento durante 2 h a 37 °C o toda la noche a temperatura ambiente, lávelas 2 veces con agua estéril y guárdelas a temperatura ambiente hasta que las celdas estén listas para el recubrimiento.
- Después de la eutanasia humanitaria, dentro de los 60 minutos, retire una sección del yeyuno y colóquela en una solución fría de Ringer sobre hielo.
- Extraer una porción de 10 cm del yeyuno y abrirla en el borde antimesentérico para mantener las regiones no linfoides en el centro del tejido. Recorta la porción a una sección de aproximadamente 7 cm x 7 cm. Enjuague bien el tejido con una solución de Ringer fresca antes de la disección.
- Sujete el tejido con alfileres en una placa de Petri recubierta de elastómero de silicona en solución fría de Ringer o con la mucosa de PBS hacia arriba, estirando el tejido tanto como sea posible (Figura 1A).
- Extirpar las vellosidades intestinales con pinzas curvas (Figura 1B) seguidas de la capa de lámina propia de la región no linfoide de aproximadamente 5 cm x 5 cm (Figura 1C).
NOTA: Estas capas se separan fácilmente de la submucosa (Figura 1B). - Retire la submucosa en una hoja liberándola con tijeras de microdisección en una esquina y observe la separación natural mientras se retira la submucosa de la capa muscular circular interna del yeyuno (Figura 1D).
- Picar la capa submucosa recolectada en trozos de 2-5 mm y colocarlos en un tubo cónico de 50 mL que contenga 5 mL de "Organo-FBS" (Tabla 1), 0,825 mg de colagenasa, 5 mg de proteasa y 20 mg de albúmina sérica bovina. Incubar el tejido durante 2-3 h a 37 °C para la digestión enzimática.
- Después de la incubación, agregue 10 mL de "Organo + FBS" a temperatura ambiente para detener la acción de la enzima. Pipetear la mezcla de tejido hacia arriba y hacia abajo aproximadamente 15 veces con una pipeta serológica de 10 ml para disociar las células del tejido y, a continuación, centrifugar a 3.000 × g durante 3 min a temperatura ambiente.
- Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet con PBS a temperatura ambiente de 10 mL pipeteando hacia arriba y hacia abajo aproximadamente 15 veces con una pipeta serológica de 10 mL para disociar las células del tejido.
- Centrifugar el tubo cónico a 3.000 × g durante 3 min a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet con 10 mL de temperatura ambiente "Organo + FBS" pipeteando hacia arriba y hacia abajo aproximadamente 15 veces con una pipeta serológica de 10 mL para disociar las células del tejido.
- Filtre las células en serie a través de un filtro de células de 100 μm, 70 μm y, a continuación, un filtro de células del tamaño de un poro de 40 μm.
- Centrifugar las células y los medios filtrados a 3.000 × g durante 3 minutos a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 1 mL de "Organo + FBS".
- Teñir con azul de tripán para identificar las células vivas y contarlas con un hemocitómetro.
- Siembre aproximadamente 400,000 células en 300 μL de "Organo + FBS" en cada pocillo de una placa de 24 pocillos y agregue factores de crecimiento a cada pocillo: N2 5 μL/pocillo, G5 5 μL/pocillo y B27 10 μL/pocillo. Coloque la placa de 24 pocillos en una incubadora a 37 °C con 5% de CO2 para permitir que las células se adhieran. Veinticuatro horas después, cambie el medio a "glía media" (Tabla 1) con los factores de crecimiento anteriores y cambie cada 48 h (Figura 2).
2. Citología inmunofluorescente
- Cultivar las células gliales entéricas desde el cultivo primario (P0) (paso 2.1.14) hasta un 70-80% de confluencia y hacerlas pasar una vez (P1).
- Fije las células de cultivo primario (P0) en los pocillos con paraformaldehído al 4% durante 5 minutos antes de la aplicación de azida PBS al 0,1%.
- Prepare una solución de saturación que consista en azida PBS, suero de burro al 4% y Triton-X al 0,5%. Añadir 300 μL de solución de saturación a los pocillos para permeabilizar las células durante 2 h a temperatura ambiente.
- Añadir el anticuerpo primario para el marcador glial, la proteína ácida fibrilar glial (GFAP), y el anticuerpo primario para el marcador de fibroblastos, la actina del músculo liso alfa, en diluciones 1:1.000 en solución de saturación para la incubación nocturna a 4 oC.
- Lavar 3 veces con PBS antes de añadir el anticuerpo secundario para la IgG anti-conejo de burro Alexa Fluor 594 y la IgG anti-ratón de cabra Alexa Flour 488 a una dilución de 1:500 en solución de saturación durante 2-3 h.
- Teñir los núcleos con 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) en una dilución de 1:1.000 en PBS durante 5 min.
- Después de tres lavados con PBS, almacene las células en azida de PBS al 0,1%.
3. Exposición a IL-1β de cultivo primario de glía entérica equina submucosa
- Cuando las células del primer paso (P1) alcancen el 70-80% de confluencia, realice el experimento de exposición a IL-1β. Exponga los pocillos a 0 ng, 10 ng y 25 ng de IL-1β durante 24 h. Después de 24 horas, almacene y almacene los medios de cada pocillo a -80 °C.
4. Cultivo de organoides equinos para la producción de monocapas de enterocitos
NOTA: Siguiendo el protocolo de Stewart et al. publicado en 2018, las criptas intestinales equinas almacenadas y las yemas que habían sido crioalmacenadas se ampliaron para estudios de enteroides, en 2D10.
- Utilice aproximadamente 700-1.000 yemas/fragmentos de cripta (40.000-50.000 células cuando se disocian en células individuales) por inserto transwell. Cubrir los insertos transwell con 42 μL de Matrigel al 0,05% antes de la adición de los enterocitos. Dejar que la Matrigel se fije en el inserto incubando durante 1 h a 37 oC. Aspirar el medio extra y dejar secar los transpocillos durante 30 min sin tapar. Añada 200 μL de medio DMEM-F12 a cada inserto transwell y almacene la placa a 37 °C hasta su uso.
- Lave las hamburguesas Matrigel que contienen los organoides con PBS y luego expóngalas a 500 μL de Cell Recovery mientras están en hielo. Pipetearlas repetidamente para asegurar la recolección completa de células en un tubo de 15 mL.
- Centrifugar el tubo a 300 × g durante 5 min a 4 °C, retirar el sobrenadante y suspender el pellet de células en el volumen objetivo de medio de células madre epiteliales intestinales (IESC). Calcule el volumen objetivo multiplicando el número deseado de monocapas por 200 μL de medio. (Tabla 1).
- Reviste previamente una jeringa de 1 ml en medios IESC y aspire la suspensión celular a través de una aguja de 16 G. Reemplace la aguja de 16 G por una aguja de 28 G y expulse la suspensión celular a través de ella para favorecer la separación de los organoides.
- Coloque 200 μL de la suspensión celular resultante en el lado apical de los transpocillos recubiertos y 500 μL de IESC, así como los factores de crecimiento descritos anteriormente, en el lado basal del insertotranspocillo 10. Cambie los medios y los factores de crecimiento cada 24-48 h hasta alcanzar la confluencia. Defina la confluencia como la densidad de celdas correspondiente a un TEER de 1.000 ohmsxcm 2,11. Para la medición, consulte el paso 5.1.
5. Permeabilidad monocapa de enterocitos equinos tras la exposición a citocinas inflamatorias y productos gliales entéricos equinos
- Utilice una cámara de medición de TEER de doble electrodo para cuantificar el TEER en las monocapas y establecer una lectura base en cada membrana permeable transwellable. Asegúrese de que el medio IESC y el transwell tengan 15 minutos para alcanzar la temperatura ambiente antes de tomar mediciones. Llene el recipiente de cultivo con 1,5 ml de medio IESC y asegúrese de que haya exactamente 200 μl de medio dentro del inserto transwell para que las líneas de fluido coincidan en el momento de la medición.
- Exponga la cara basolateral de los insertos transpocillos a citocinas inflamatorias de 25 ng de IL-1β, 10 ng y 25 ng de interleucina 6 (IL-6) por pocillo, o a productos gliales de cultivos expuestos a 10 ng o 25 ng de IL-1β. Exponga la cara basolateral de los insertos de control transwell a la glía media y a la glía media de cultivos no expuestos a IL-1β.
- Mida el TEER durante 45 min a intervalos de 10-15 min colocando cada transwell en la taza de cultivo.
6. Estadísticas
- Calcule el cambio de pliegue del TEER de cada transpozo para los puntos de tiempo: 0, 10, 20, 30 y 45 min.
- Utilizando el software de elección (ver Tabla de Materiales), compare las correlaciones entre la disminución de TEER y la exposición basolateral a IL-1β (25 ng), IL-6 (10 ng, 25 ng y 100 ng) y medios gliales (expuestos a 0 ng IL-1β, 10 ng IL-1β y 25 ng IL-1β) para controlar los medios utilizando una prueba t de una cola no apareada.
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Resultados
La microdisección del yeyuno equino a la capa submucosa (Figura 1) con una digestión enzimática y mecánica adicional, podría producir cultivos celulares viables de glía entérica equina. Las células demostraron un pleomorfismo con una dominancia de células fusiformes consistente con la glía entérica de otras especies (Figura 2A). Los cultivos fueron positivos para el marcador glial selectivo, proteína ácida fibrilar glial (GFAP), con baja contaminación por fibrob...
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Discusión
El objetivo de este estudio fue desarrollar un método repetible de cultivo primario de glía entérica submucosa equina y demostrar su aplicación para modelar las interacciones epitelio-gliales en el momento del cólico. El aislamiento y cultivo de la glía entérica, que es novedoso en el caballo, ha demostrado ser beneficioso para comprender las vías de las enfermedades intestinales en modelos de cerdos y roedores y en humanos 6,7,13,14.<...
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Agradecimientos
Los autores desean agradecer a la Fundación Morris Animal por su financiación de este proyecto.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Tampón HEPES de 1 M | Gibco | 15630-080 | |
| 10 mM HEPES | Life Technologies | 15630-106 | |
| 2 mM GlutaMAX | Life Technologies | 25050-061 | |
| 4' 6-Diaminidino-2-Phenylindol | Invitrogen | D3571 | |
| Advanced DMEM/F12 | Life Technologies | 12634-010 | |
| Alfa músculo liso anticuerpo de actina | Abcam | 7817 | |
| Anfotericina B | Sigma | AA9529 | 4,4 g/mL alícuotas de stock, concentración final 1,1 y micro; g/mL |
| Anti-Antimicótico 1x | Gibco | 15240-096 | |
| B27 | Gibco | 12587010 | |
| Albúmina Suero Bovino | Sigma | AA3311 | |
| BSA 50 mg/mL solución madre | Sigma | A3311 | |
| CaCL2 | ACROS Organiics | 206791000 | Componente de Equine Ringer ' s Caldo 1: combine con otros ingredientes, luego agregue 100 mL de este caldo a un cilindro graduado y diluya a 1L con agua desionizada. Ajuste el pH a 7.4 con 5% de CO2. Combine con Equine Ringer' s Stock 2 para completar " Campanero' s Solución". |
| Collagenasa | Sigma | 9891 | |
| DMEM-F12 medios | Thermo Fisher | 11320033 | |
| Burro anti-conejo IgG Alexa Fluor 594 | Invitrogen | 21207 | |
| EVOM EndOhm doble electrodo cámara de medición TEER | World Precision Instruments | EVM-EL-03-01 | |
| EVOM Manual para la medición de TEER | World Precision Instruments | EVM-MT-03-01 | |
| G5 | Gibco | 17503012 | |
| solución de gentamicina | Sigma | G1272 | Concentración final 20 µ g/mL |
| GFAP anticuerpo | Abcam | 4674 | |
| Cabra anti-ratón IgG Alexa Fluor 488 | Invitrogen | 28175 | |
| IL-1 y beta; ELISA | Thermo Fisher | ESIL1B | |
| KCl | Thermo Fisher | P330-500 | Componente de Equine Ringer' s Caldo 1: combine con otros ingredientes, luego agregue 100 mL de este caldo a un cilindro graduado y diluya a 1L con agua desionizada. Ajuste el pH a 7.4 con 5% de CO2. Combine con Equine Ringer' s Stock 2 para completar " Campanero' s Solución". |
| Solución de L-glutamina | Corning | 25-00-Cl | |
| Matrigel | BD Bioscience | 354277 | |
| MgCl2 | Thermo Fisher | M33-500 | Componente de Ringer Equino s Caldo 1: combine con otros ingredientes, luego agregue 100 mL de este caldo a un cilindro graduado y diluya a 1L con agua desionizada. Ajuste el pH a 7.4 con 5% de CO2. Combine con Equine Ringer' s Stock 2 para completar " Campanero' s Solución". |
| N2 | Gibco | 17502048 | |
| Na2HPO4 | Thermo Fisher | BP332-1 | Componente de Equine Ringer' s Caldo 2: combine con otros ingredientes, luego agregue 100 mL de este caldo a un cilindro graduado y diluya a 1L con agua desionizada. Ajuste el pH a 7.4 con 5% de CO2. Combine con Equine Ringer' s Stock 1 para completar " Campanero' s Solución". |
| NaCl | Thermo Fisher | S271-10 | Componente de Equine Ringer' s Caldo 1: combine con otros ingredientes, luego agregue 100 mL de este caldo a un cilindro graduado y diluya a 1L con agua desionizada. Ajuste el pH a 7.4 con 5% de CO2. Combine con Equine Ringer' s Stock 2 para completar " Campanero' s Solución". |
| NaH2PO4 | Thermo Fisher | BP329-500 | Componente de Ringer Equino s Caldo 2: combine con otros ingredientes, luego agregue 100 mL de este caldo a un cilindro graduado y diluya a 1L con agua desionizada. Ajuste el pH a 7.4 con 5% de CO2. Combine con Equine Ringer' s Stock 1 para completar " Campanero' s Solución". |
| NaHCO3 | Thermo Fisher | S637-212 | Componente de Equine Ringer' s Caldo 2: combine con otros ingredientes, luego agregue 100 mL de este caldo a un cilindro graduado y diluya a 1L con agua desionizada. Ajuste el pH a 7.4 con 5% de CO2. Combine con Equine Ringer' s Stock 1 para completar " Campanero' s Solución". |
| Pluma/Solución estreptocócica | Gemini | 400-109 | |
| Poly-L-lisina | Sigma | P2636 | 0,5 mg/mL en 1x tampón de borato |
| Software Prism | GraphPad | ||
| Proteasa | Sigma | P4630 | |
| Solución de bicarbonato de sodio | Sigma | S8761 | Solución madre al 7,5% |
Referencias
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Reimpresiones y permisos
