Artículo de método

Espectroscopia óptica correlativa y metodología de imagen por espectrometría de masas para visualizar la distribución del fármaco en una sección de tejido blando

DOI:

10.3791/67383

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20 de junio de 2025

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1Chemical & Biological Sciences Department, National Physical Laboratory, 2Department of Life Sciences, University of Bath, 3Haleon CH SARL, 4School of Chemistry & Chemical Engineering, University of Surrey

En este artículo

Resumen

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Este estudio presenta un método para la obtención de imágenes correlativas de fármacos en tejidos blandos utilizando espectroscopia óptica no lineal e imágenes de espectrometría de masas. La combinación de imágenes cutáneas de alta resolución con la detección de fármacos sensibles ofrece un enfoque valioso para estudiar la distribución de fármacos en la piel, fundamental para el desarrollo de productos tópicos superiores.

Resumen

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Se ha desarrollado una nueva metodología de imagen correlativa que combina la resolución espacial submicrónica con la detección sensible de fármacos mediante espectroscopia óptica e imágenes de espectrometría de masas para visualizar la distribución química tras la aplicación de fármacos en los tejidos blandos. En este ejemplo, el método se ha probado en tejido cutáneo extirpado después de la aplicación tópica in vitro de un producto farmacéutico antiinflamatorio no esteroideo comercial durante 16 horas. Los métodos espectroscópicos ópticos no destructivos, como la dispersión Raman estimulada, la generación de segundos armónicos y las microscopías de fluorescencia de dos fotones, se emplearon por primera vez para mapear la estructura y morfología de la piel. Posteriormente, las mismas muestras de tejido cutáneo se analizaron mediante espectrometría de masas de iones secundarios en el tiempo de vuelo (ToF-SIMS), lo que permitió mejorar la sensibilidad para la detección de diclofenaco en las capas más externas de la piel: epidermis y dermis. Se idearon métodos de registro de imágenes para integrar los datos ópticos y de espectrometría de masas. Este enfoque combina la visualización de alta resolución y sin etiquetas de la estructura del tejido con la detección de sustancias químicas sensibles, y representa una herramienta valiosa para investigar la distribución de fármacos en la piel y, potencialmente, en otros tejidos biológicos blandos.

Introducción

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Comprender la tasa, el alcance y los impulsores de la distribución de los ingredientes farmacéuticos activos dentro de los tejidos biológicos blandos después de su aplicación tópica o sistémica es crucial para dilucidar los mecanismos subyacentes a la absorción, el metabolismo y la eliminación de fármacos específicos de los tejidos (es decir, una comprensión más profunda de la farmacocinética de los fármacos). Aquí, presentamos un nuevo método de imagen correlativa que integra espectroscopía óptica no lineal e imagen de espectroscopia de masas para la visualización sin etiquetas de la estructura del tejido y la distribución de fármacos tópicos dentro de la misma muestra de tejido1.

La espectroscopia Raman (RS) se ha convertido en una valiosa herramienta para mapear la distribución de fármacos dentro de células y tejidos con alta resolución espacial y especificidad molecular2. RS se basa en la dispersión inelástica de la luz3 por una muestra de interés, lo que permite una caracterización química detallada a través de los modos vibracionales característicos de las moléculas que contiene, sin necesidad de etiquetas externas. Sin embargo, los largos tiempos de adquisición para producir imágenes de alta resolución pueden comprometer la integridad de las muestras biológicas sensibles. Además, al sondear capas más profundas de tejido, la dispersión y absorción de luz por parte del tejido puede atenuar la señal Raman, limitando aún más su sensibilidad. La microscopía de dispersión Raman estimulada (SRS) representa un avance significativo con respecto a la RS convencional, ya que aprovecha la excitación láser pulsada y la detección de la señal Raman estimulada4. La microscopía SRS permite la adquisición rápida de imágenes en 2D y 3D con alta resolución espacial y, cuando se realiza en conjunto con microscopías de generación de segundos armónicos (SHG) y fluorescencia excitada por dos fotones (TPEF), puede proporcionar una imagen completa de los tejidos conectivos, el colágeno y la elastina 1,5,6,7,8,9 . La microscopía SHG es una técnica óptica no lineal que se basa en la interacción de la luz con estructuras no centrosimétricas en una muestra, generando una señal a la mitad de la longitud de onda de la luz incidente. Es particularmente útil para obtener imágenes de estructuras ordenadas como el colágeno en tejidos biológicos. TPEF es otra técnica de microscopía no lineal en la que dos fotones de baja energía excitan simultáneamente un fluoróforo, lo que hace que emita fluorescencia. El TPEF permite la obtención de imágenes de tejidos profundos con un menor fotodaño, ya que la luz de excitación se encuentra en el rango del infrarrojo cercano, que penetra más profundamente en las muestras biológicas.

La imagen por espectrometría de masas (MSI) es una poderosa técnica analítica que combina las capacidades de la espectrometría de masas con información espacial, lo que permite la identificación sin etiquetas de una amplia gama de moléculas 10,11,12. La espectrometría de masas de iones secundarios en el tiempo de vuelo (ToF-SIMS) funciona bombardeando la superficie de la muestra con iones primarios de alta energía, lo que provoca la expulsión de iones secundarios de la superficie. A continuación, estos iones secundarios se aceleran hacia un analizador de tiempo de vuelo, donde se determinan sus relaciones masa-carga. Este análisis permite la identificación de fragmentos moleculares y variaciones isotópicas con alta sensibilidad y resolución. Se han demostrado valiosas aplicaciones de ToF-SIMS en la investigación biológica y farmacéutica para el estudio de productos químicos y biomoléculas en células13, tejidos14,15 y órganos15.

Tanto el SRS como el ToF-SIMS se han utilizado de forma independiente para estudiar la distribución de fármacos en diferentes modelos de piel. Sin embargo, lo más valioso es utilizar estas técnicas en combinación para beneficiarse de su complementariedad. En este estudio, describimos un flujo de trabajo para combinar las microscopías ópticas (SRS, TPEF y SHG) con ToF-SIMS para obtener imágenes de la morfología de la piel con resolución espacial submicrónica (proporcionada por los métodos ópticos) superpuesta con la señal del fármaco detectada con sensibilidad superior (proporcionada por el ToF-SIMS). El enfoque se ha utilizado para abordar el desafiante ejemplo de visualizar la distribución de diclofenaco en tejidos cutáneos extirpados tratados con una formulación tópica comercial (gel Voltaren). Los criterios de éxito incluyeron una alta sensibilidad química para detectar diclofenaco en su concentración terapéutica y una resolución espacial suficiente para resolver la estructura de la piel. Aunque el contenido de diclofenaco en diferentes capas de la piel se puede cuantificar después del tratamiento tópico a través de métodos laboriosos y técnicamente exigentes, como la extracción con cinta seguida de cuantificación16, o mediante microperfusión de flujo abierto17, estos enfoques no pueden dilucidar la partición, penetración, retención y distribución de profundidad del diclofenaco dependiente del excipiente en las capas individuales de la piel, que son factores esenciales que ayudan a la fase de desarrollo del producto.

Antes de la metodología de medición que se describe a continuación, se aplicaba sobre la superficie de la piel (4, 12, 16 o 24 h) el gel Voltaren Forte (que contenía un 2,32 % de diclofenaco dietilamonio) o un gel placebo correspondiente (suministrado por Haleon CH SARL) durante diferentes períodos (4, 12, 16 o 24 h). Después de la eliminación de cualquier formulación residual, se realizaron mediciones de SRS y ToF-SIMS en las mismas muestras de piel; Los detalles completos de la metodología se describen en el manuscrito original1.

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Protocolo

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Declaración ética: Las muestras de piel humana fueron obtenidas de Tissue Solutions Ltd, Glasgow, Reino Unido, por Charles River Laboratories (CRL) en Edimburgo, Reino Unido. Todas las muestras anónimas se adquirieron de acuerdo con las normas legales y éticas del país de recolección, con la aprobación ética y el consentimiento informado de los donantes o sus familiares más cercanos.

1. Seccionamiento de la piel

Se utilizó un criostato para producir secciones de los tejidos de la piel.

  1. Transporta los discos de piel tratados fuera del congelador a -20 °C y corta un trozo pequeño (~1,0 cm x 1,0 cm) del centro del disco.
  2. Monte la muestra en el mandril del criostato sobre una gota de agua congelada. No utilice compuesto de temperatura de corte óptima (OCT) u otros medios de incrustación.
  3. Ajuste la temperatura de la cuchilla y de la muestra a -20 °C y -16 °C, respectivamente.
  4. Sección de 30 μm de espesor sobre un cubreobjetos de vidrio (#1.5, Fisher Scientific).
  5. Realice SRS y ToF-SIMS inmediatamente o, alternativamente, la muestra puede envasarse al vacío para su almacenamiento a -80 °C.
  6. Secar durante 20 minutos antes de usar.

2. Imágenes SRS

La microscopía SRS, SHG y TPEF se realizó utilizando un microscopio Raman coherente. Dos pulsos láser de picosegundos fueron generados por un haz de Stokes de 1031,2 nm, superpuesto espacial y temporalmente con un haz de bomba sintonizable. El haz de Stokes, modulado a 20 MHz, facilitó la detección de señales de pérdida Raman estimuladas a través de la transmisión. Se utilizó un detector basado en silicio, junto con un amplificador de bloqueo, para la detección de señales. Se empleó otro canal para recoger el segundo armónico y las señales de fluorescencia emitidas, empleando un tubo fotomultiplicador para la detección.

  1. Instale lentes de objetivo y condensadores adecuadas para la obtención de imágenes de tejidos multifotónicos, en este caso una lente de aumento de 40x por inmersión en agua (1,1 NA) junto con una lente de condensador de aire de corta distancia de trabajo (0,9 NA).
  2. Coloque la sección de tejido montada en la platina de muestra del microscopio SRS de modo que el tejido quede en la misma cara del portaobjetos del microscopio que la lente del condensador. Enfoque la lente del objetivo en la sección de tejido y, a continuación, optimice la altura del condensador.
  3. Ajuste la potencia del láser a los valores adecuados para obtener una buena relación señal-ruido sin dañar el tejido. En este ejemplo, se aplicaron aproximadamente 10 mW para el haz de la bomba y 30 mW para el haz de Stokes en la muestra. Refiérase a Tsikritsis et al para consideraciones prácticas para las mediciones de SRS4.
  4. Adquiera una imagen de mosaico de toda la sección con una resolución de 512 x 512 píxeles correspondiente a 290 μm x 290 μm con un zoom X1 con una velocidad de imagen de 400 Hz y un promedio de línea de 1 a 2850 cm-1 correspondiente al estiramiento CH2 .
  5. Dentro de la imagen de mosaico de toda la sección, elija una región de interés (ROI) con las siguientes consideraciones: (i) se coloca en el centro, evitando el 20 % más externo del perímetro de la muestra donde podría haber piel sin dosificar que se sujetó en el aparato de células de Franz; ii) es lo suficientemente plana para ser examinada dentro del mismo nivel de profundidad óptica; (iii) tiene características estructurales distintivas que ayudarían a su identificación visual cuando la muestra se transfiere a ToF-SIMS.
  6. Aplique ajustes de ganancia consistentes en todo el estudio para detectores SRS y SHG/fluorescencia, y adquiera imágenes en (i) la región de estiramiento C-H (a 2945 cm-1, 2850 cm-1 y 2650 cm-1 correspondientes a CH3, CH2 y control fuera de resonancia, respectivamente); (ii) la región de las huellas dactilares (a 1666 cm-1 y 1723 cm-1 correspondientes a la amida I y al control fuera de resonancia, respectivamente); (iii) el número de onda correspondiente a la resonancia de encendido y apagado relacionada con el fármaco aplicado; en este ejemplo, a 1586 cm-1 y 1530 cm-1 correspondientes a C=C y fuera de resonancia, respectivamente.

Después de la obtención de imágenes SRS, transfiera inmediatamente la muestra a la configuración ToF-SIMS para su análisis.

3. Imágenes ToF-SIMS

Las imágenes de espectrometría de masas de iones secundarios durante el tiempo de vuelo se realizaron utilizando un haz de iones primarios Bi3+ de 30 keV con una corriente de 0,2 pA.

  1. Elija la configuración de adquisición adecuada; En este ejemplo, se utilizó la polaridad de iones negativos, con un tiempo de ciclo de trabajo de 100 ms, un rango de masa de m/z 0-900 y un diámetro de haz de 5 μm. Se utilizó un cañón de inundación de electrones de 20 eV a 5 μA para la compensación de carga.
  2. Adquiera una imagen general mediante el modo de trama macro de etapa para mapear toda la sección de tejido con un campo de visión que depende de las dimensiones del tejido (en nuestro caso usamos 2,5 a 3,0 mm x 8,5 a 9,0 mm). Esta imagen general está formada por un mosaico de imágenes más pequeñas. En este ejemplo, cada uno tenía un campo de visión de 0,5 mm x 0,5 mm (256 x 256 píxeles) con 1 disparo de haz de iones por píxel, lo que daba como resultado una dosis de iones de 8,18 x 108 iones/cm2.
  3. Utilice el mismo método para capturar imágenes del retorno de la inversión seleccionando un campo de visión apropiado; En este caso, fue de 1,0 mm x 0,5 mm, con 4 disparos por píxel por fotograma y 10 fotogramas por parche, lo que corresponde a una dosis de iones de 1,31 x10 11 iones/cm2.
  4. Para garantizar el control de calidad, analice las muestras de tejido homogeneizado inmediatamente antes y después de examinar cada sección de piel. Utilice un campo de visión de 0,5 mm x 0,5 mm (256 x 256 píxeles) con 1 disparo por píxel y 1 fotograma por escaneo, realizando un total de 15 escaneos. Esta configuración corresponde a una densidad de dosis de iones de 3,27 x10 10 iones/cm2.
  5. Después de la adquisición, los espectros de masas resultantes se pueden calibrar utilizando iones H-, C-, C-2' y C-3-.
  6. La adquisición y extracción de datos se realizó mediante el software Surface Lab 7.1.

4. Registro de imágenes y análisis de datos mediante MATLAB

  1. Reduzca las imágenes SIMS y SRS a 3 dimensiones, cada una utilizando la factorización de matrices no negativas para visualizarlas como canales de color rojo, verde y azul.
  2. Elija las características coincidentes entre estas dos imágenes de factorización que no son matrices seleccionando la herramienta de selección de puntos de control de Matlab "cpselect" (Matlab, Mathworks, 2019b y Image Processing Toolbox).
  3. Utilice las funciones "cp2tform" e "imtransform" para realizar el registro, aplicando una transformación afín con los datos SIMS como imágenes fijas y los datos de espectroscopia óptica como imágenes en movimiento.
  4. Cuando se detecten múltiples picos en los datos de ToF-SIMS para el fármaco de interés, se sumen las intensidades de estos picos para crear una intensidad combinada de iones del fármaco.
  5. Extraiga el recuento total promedio de iones de los dos conjuntos de datos homogeneizados (antes y después) para cada muestra de tejido cutáneo correspondiente. Con este valor correspondiente, normalice las intensidades en los datos ToF-SIMS del ion del fármaco en cada imagen de la piel.
  6. Después del registro, cree una superposición de la espectroscopia óptica y los datos SIMS asignando las imágenes respectivas a los canales RGB: rojo (imagen SRS para CH2), verde (imagen SHG para colágeno) y azul (imagen SIMS para diclofenaco, incluidas las señales de varios iones en m/z 214.04, 216.04, 250.02, 252.02, 294.01 y 296.01).

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Resultados

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La Figura 1 presenta los resultados del registro de imágenes basado en características, mostrando las imágenes superpuestas registradas de SRS, SHG y SIMS para dos muestras de piel, una tratada con un placebo (Figura 1a) y las otras con gel Voltaren durante 4 horas (Figura 1b) y 16 horas (Figura 1c). En esta imagen, la señal de intensidad del fármaco sumada (a partir de ...

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Discusión

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Este método permite la obtención de imágenes correlativas con espectroscopia óptica no lineal e imágenes de espectrometría de masas para detectar la distribución del fármaco en el tejido blando con resolución espacial submicrónica y alta sensibilidad. Es importante destacar que la obtención de imágenes se logra sin el uso de etiquetas potencialmente interferentes que serían necesarias para las microscopías basadas en fluorescencia. La validación adicional del flujo de trabajo implicó la ...

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Divulgaciones

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MBB es un empleado de Haleon CH SARL, la institución financiadora del estudio.

Agradecimientos

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Este estudio fue financiado por Haleon CH SARL. Las contribuciones de NAB y RHG fueron parcialmente apoyadas por la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) del Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos (HHS) a través de un premio de asistencia financiera (1-U01-FD006533). Este trabajo fue financiado por el Departamento de Negocios, Energía y Estrategia Industrial del Reino Unido a través de los proyectos NMS/ID74 y NMS/ST18 del Sistema Nacional de Medición del Reino Unido. El contenido de este artículo es el de los autores y no representa necesariamente los puntos de vista oficiales de la FDA/HHS o el gobierno de los EE. UU., ni lo respaldan. NAB agradece el apoyo de la Comunidad para la Ciencia de la Medición Analítica para el Premio de Becas CAMS 2020 financiado por el Fondo Fiduciario de Química Analítica.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Microscopio Raman coherente Leica Microsystemshttps://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-cars/
Muestras de piel humana Tissue Solutions Ltd, Glasgow
Leica CM 1850 Criostato Leica Biosystemshttps://www.leicabiosystems.com/en-fr/histology-equipment/cryostats/leica-cm1850/Descatalogado
Sistema láser PicoEmerald-SAPE Berlinhttps://www.ape-berlin.de/en/cars-srs/
ToF SIMS 5IONToF GmbHhttps://spectral.se/products/tof-sims-5

Referencias

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