Respirometría de alta resolución en una cámara de pequeño volumen

Resumen

Aquí, mostramos que la cámara de 0,5 ml para la respirometría de alta resolución muestra resultados que son consistentes con la cámara de 2,0 ml si se aplica la corrección de fondo instrumental O₂ adecuada. Requiere menos muestra, lo que es ventajoso para estudios con disponibilidad limitada o bajas capacidades respiratorias.

Resumen

La investigación de los flujos respiratorios es decisiva para comprender la compleja interacción entre los procesos metabólicos. Los estudios de células y tejidos con disponibilidad limitada de muestras y frecuencias respiratorias bajas pueden beneficiarse de pequeños volúmenes experimentales. Examinamos si la cámara de 0,5 ml produce resultados consistentes con la cámara de 2,0 ml a concentraciones de muestra idénticas utilizadas en la respirometría de alta resolución con Oroboros. El flujo de O₂ de fondo fue 4 veces mayor en cámaras de 0,5 ml que en cámaras de 2,0 ml con saturación de aire, pero fue reproducible, lo que permitió una corrección de fondo precisa. La velocidad de agitación óptima fue de entre 550 rotaciones por minuto (rpm) y 750 rpm en la cámara de 0,5 ml. Los flujos respiratorios en células vivas, células permeabilizadas y mitocondrias aisladas se midieron en paralelo en las cámaras de 0,5 ml y 2,0 ml, utilizando protocolos de titulación de sustrato-desacoplador-inhibidor con 14 a 20 titulaciones. Los fundentes de O₂ en los diferentes tipos de cámaras fueron idénticos dentro de los límites de detección. La cámara de 0,5 ml, que requiere casi cuatro veces menos muestra que la cámara de 2,0 ml, ofrece una ventaja significativa para estudios con cantidades limitadas de muestra o capacidades respiratorias bajas.

Introducción

La investigación de las vías respiratorias mitocondriales es clave para arrojar luz sobre los mecanismos metabólicos subyacentes a diversas enfermedades, el envejecimiento o las respuestas al estrés, proporcionando así objetivos potenciales para intervenciones terapéuticas y mejorando las capacidades diagnósticas ^1,2,3. La respirometría de alta resolución (HRR) permite un análisis detallado del control de la vía mitocondrial y el acoplamiento en la fosforilación oxidativa (OXPHOS) en una variedad de tipos de muestras y preparaciones⁴. El volumen de la cámara experimental es una característica fundamental del diseño de los instrumentos respirométricos. El volumen de la cámara establecido anteriormente es de 2,0 ml en el Oroboros. Este volumen se ha optimizado para implicar un bajo flujo de fondo instrumental O₂ y garantizar la homogeneidad del medio agitado. Estos se encuentran entre los criterios de calidad clave para la medición precisa de la respiración en condiciones hiperóxicas y de bajo oxígeno requeridas para la cinética del oxígeno mitocondrial y las fibras musculares permeabilizadas, respectivamente 5,6,7,8,9. Además, varias inserciones multisensor¹⁰ requieren el espacio de la cámara de 2,0 ml (Tabla 1).

En el presente estudio, examinamos la viabilidad de disminuir el volumen de la cámara para HRR de 2,0 mL a 0,5 mL. ¿Se pueden aplicar recuentos celulares o cantidades más bajas de tejido en ensayos respirométricos en una cámara más pequeña sin comprometer la precisión? La aclaración de esta pregunta es importante para investigar biopsias líquidas y de tejidos humanos, células primarias y cultivos celulares de crecimiento lento¹. De manera similar, una reducción del volumen de la cámara es potencialmente ventajosa en estudios de muestras con baja actividad respiratoria en mitocondrias^{defectuosas 11} y vías mitocondriales con capacidades inherentemente bajas, como la oxidación de ácidos grasos en el cerebro¹². Sin embargo, la resolución puede disminuir con un tamaño de cámara bajo debido al aumento desproporcionado de artefactos de retrodifusión de O₂ y una calibración de volumen inexacta^13,14. Por lo tanto, analizamos el rendimiento instrumental de los Oroboros con la cámara de pequeño volumen (sV) calibrada a un volumen experimental mínimo de 0,5 mL, en comparación con la cámara de volumen clásico (cV) calibrada a 2,0 mL. En particular, analizamos el flujo instrumental de fondo de O₂ y la velocidad óptima de agitación.

Los protocolos de titulación de sustrato-desacoplador-inhibidor (SUIT) se utilizan para evaluar las frecuencias respiratorias y los estados en el análisis OXPHOS. Los protocolos SUIT comprendieron de 14 a 20 titulaciones por ensayo respirométrico e implicaron flujos respiratorios de_O2 que iban desde unos pocos pmol∙^s-1∙^mL-1 hasta cientos de pmol∙^s-1∙^mL-1. Los estados de control de acoplamiento incluyen la tasa de fuga L, es decir, el componente disipativo de la respiración, que no está disponible para fosforilar adenosina-5'-difosfato (ADP) a adenosina-5'-trifosfato (ATP) y es el resultado de la fuga de protones, el deslizamiento de protones, el ciclo catiónico y la fuga de electrones. La capacidad P de OXPHOS explica la respiración de las mitocondrias cuando la transferencia de electrones medida como consumo de O₂ (oxidación) se acopla a la síntesis de ATP (fosforilación) en presencia de ADP. La capacidad de transferencia de electrones E en el estado desacoplado se cuantifica mediante titulaciones de un protonóforo en presencia de sustratos mitocondriales¹⁵. El consumo de oxígeno residual rox se determina después de la adición de los inhibidores del complejo I y del complejo III rotenona y antimicina A.

Medimos la respiración de las células y las preparaciones mitocondriales en las cámaras sV y cV. Las plaquetas son fragmentos citoplasmáticos anucleados de megacariocitos y representan una fuente fácilmente obtenible de mitocondrias humanas. Por lo tanto, las plaquetas se aplicaron como modelo para células vivas (o partículas celulares) con membranas plasmáticas intactas. La respiración de las células sanguíneas sirve como biomarcador de enfermedades mitocondriales sistémicas y se correlaciona con la aptitud bioenergética de los órganos metabólicamente activos 16,17,18,19, aunque estos hallazgos no pueden generalizarse 20,21,22. Los fibroblastos humanos fueron elegidos para su aplicación como modelo celular de disfunción mitocondrial 1,23,24,25. La integridad de las membranas plasmáticas es necesaria para la viabilidad celular, pero su permeabilización selectiva permite el intercambio de moléculas entre el citosol y el medio circundante. Por lo tanto, los fibroblastos con membranas plasmáticas químicamente permeabilizadas se estudiaron como un ejemplo de células permeabilizadas, en comparación con las mitocondrias aisladas utilizadas para evaluar la función mitocondrial y requeridas para separar las subpoblaciones mitocondriales^26,27.

Protocolo

Para el estudio sobre plaquetas humanas, ocho voluntarios dieron su consentimiento informado por escrito para participar en el estudio, que fue aprobado por la Autoridad de Revisión Ética de Suecia (Nr. 2013/181). Se compraron dos líneas celulares de fibroblastos de piel humana de recién nacidos varones a ATCC y se utilizaron de acuerdo con la aprobación ética del Ministerio de Salud de la República Checa (proyecto: AZV MZ CR NU22-07-00474). Los procedimientos con ratones se llevaron a cabo de acuerdo con la Ley de Experimentación Animal de Austria y de conformidad con el Convenio Europeo para la Protección de los Animales Vertebrados utilizados para Experimentación y otros Fines Científicos (Tierversuchsgesetz 2012; Directiva 2010/63/UE; BMWFM-66.011/0128-WF/V/3b/2016). Se aplicó el principio de las 3R para minimizar el número de animales de experimentación.

1. Calibración de volumen

1. Monte las cámaras de pequeño volumen (sV) o las cámaras de volumen clásico (cV) en el Oroboros (Figura 1A, B; Tabla 1).
2. Enciende el Oroboros y conéctate a DatLab.
3. Seca las cámaras.
4. Pipetear 0,54 ml de H₂O en els V (0,50 ml de volumen experimental efectivo más 0,04 ml de volumen muerto capilar) o 2,07 ml de H₂O en el cV (2,00 ml de volumen efectivo más 0,07 ml de volumen muerto capilar).
   NOTA: Para evitar la pérdida de líquido entre la parte superior del cilindro de vidrio y el soporte de la cámara de polioximetileno (POM), inserte la punta de la pipeta lo suficientemente profunda como para tocar la pared de la cámara de vidrio.
5. Encienda los agitadores.
6. Antes de cerrar la cámara, humedezca las juntas tóricas de los tapones mientras mantiene seco su capilar. Afloje los anillos de calibración de volumen e inserte los tapones hacia abajo hasta que el líquido llene el capilar del tapón y aparezca una pequeña gota en el recipiente en el extremo superior del capilar (Tabla 1).
7. Apriete los anillos de calibración de volumen para fijar su posición de modo que el volumen calibrado se obtenga en inserciones consecutivas de los tapones.

2. Entorno general de Oroboros

1. Inicie el software DatLab .
2. Ajuste la temperatura experimental (37 °C) y la velocidad de rotación de agitación a 550 rpm (9,2 Hz o rotaciones por s) en la cámara sV o 750 rpm (12,5 Hz) en la cámara cV. Establezca el intervalo de muestreo de datos en 2 s con suavizado de más de 80 s (40 puntos de datos) en pruebas instrumentales de fondo O₂ o 40 s (20 puntos de datos) para respirometría.
   NOTA: Las barras de agitación magnética (AlNiCo recubiertas de difluoruro de polivinilideno [PVDF]; Tabla 1) son agitados por un campo magnético giratorio pulsado con una intensidad de campo de 3,5 mT al nivel del agitador en la cámara.
3. Realice la calibración del aire²⁸ en MiR05 o en el mismo medio de incubación utilizado en experimentos posteriores.
4. Realice calibraciones de oxígeno cero de vez en cuando, pero nunca inmediatamente antes de comenzar los experimentos.
   1. Prepare una solución madre fresca de Na-ditionita disolviendo el polvo de O_2-Zero en tampón de fosfato de 50 mM (pH 8,0) a una concentración de 2,5 mM o 10 mM para las cámaras sV o cV , respectivamente.
   2. Valore el Na-ditionito en exceso para obtener la señal bruta R0 o corriente cero [μA] a una concentración de O₂ 0 μM^14,28.

3. Prueba de antecedentes instrumental O₂

1. Sala sV
   1. Después de la calibración del aire, cierre la cámara. Controle la señal de oxígeno durante unos 60 min hasta que la concentración de O₂ disminuya de la saturación del aire a aproximadamente 150 μM. Establezca cuatro marcas J°₁ a J°₄ en el gráfico 'O₂ pendiente negativa'.
      NOTA: Realice esta prueba instrumental de fondo O₂ todos los días antes de comenzar un experimento.
   2. OPCIONAL: Con una jeringa Hamilton, valore el Na-ditionito preparado de acuerdo con el paso 2.4.1 para alcanzar una concentración de O₂ de 100 μM (Figura 1C).
      NOTA: En otro protocolo, el Na-ditionito se titula en la cámara utilizando la microbomba de valoración-inyección (TIP2k; Figura complementaria 1 y Figura complementaria 2) para la comparación con un método estándar para determinar el flujo instrumental de fondo O₂ ²⁸.
2. Sala cV
   1. Después de la calibración del aire, cierre la cámara, espere a que se estabilice la pendiente de O₂ y coloque la marca J ° ₁ en la parcela 'Pendiente de O2 neg.'²⁸. Con una jeringa Hamilton, valorar la Na-ditionita preparada de acuerdo con el paso 2.4.1. en pasos de 0,7 μL para que coincida con el régimen deoxígeno de la V de la cámara y reduzca la concentración de O₂ a 150 μM.
   2. Agregue otro paso de valoración de Na-ditionito (aprox. 7 μL) para reducir la concentración de O₂ a 100 μM (Figura 1D).
3. Análisis de datos de fondo instrumental O₂
   1. Calcule la pendiente de fondo instrumental O₂ en DatLab²⁸. Seleccione Flujo/Pendiente en el menú superior.
   2. Abra la ventana de corrección de fondo de O₂. Seleccione Archivo activo como origen del fondo O₂ y seleccione las marcas J° que se utilizarán para el cálculo de la regresión lineal. Aplique la corrección de fondo O₂.

Figura 1: Cámaras de pequeño volumen (sV) y volumen clásico (cV) y prueba de fondo instrumental de O₂. (A) Sala sv. (B) Sala cv. (C) Trazas representativas de pendientes negativas y marcas J°₁, sV (0,5 mL; verde) y cV (2,0 mL; azul). (D) Concentración de oxígeno correspondiente y marcas R1. Tres valoraciones manuales de Na-ditionito (aprox. 0,7 μL, 10 mM de stock; cV) y una valoración final de 7,0 μL de 2,5 mM y 10 mM de stock en la cámara sV y cV , respectivamente. Se eliminaron los picos causados por las valoraciones. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

4. Adición de muestra a las cámaras de Oroboros

NOTA: La muestra se puede agregar a la cámara por dos métodos: reemplazo de volumen parcial (plaquetas y fibroblastos en el presente estudio) o reemplazo de volumen completo (mitocondrias aisladas en el presente estudio).

1. Reemplazo parcial de volumen
   1. Retire el tapón completamente insertado. Pipetea y desecha un volumen V_de MiR05. V_out es de 60-70 μL para plaquetas y 80-150 μL para fibroblastos, calculados de acuerdo con las concentraciones celulares en la suspensión de células madre.
   2. Equivalente a V_out, pipetear el mismo volumen V_J.i de suspensión de células madre (con concentración celular conocida) en la cámara (Figura 2).
   3. Calcule la concentración de la célula experimental en el volumen real V' (0,54 ml y 2,07 ml), mayor que el volumen experimental efectivo V (0,5 ml y 2,0 ml).
      NOTA: Las concentraciones de la suspensión de células madre y la concentración de células experimentales deben planificarse para obtener volúmenes de V_J.i = V_out que sean compatibles con un pequeño error de valoración. En los experimentos con plaquetas, se utilizó un prototipo de tapón para la Cámara sV con un volumen muerto capilar de 0,05 mL.
2. Reemplazo completo del volumen
   1. Extrae todo el medio de la cámara y reemplázalo con al menos 0,54 ml o 2,07 ml de solución madre de mitocondrias aislada a la concentración de muestra experimental en las cámaras sV o cV, respectivamente.
   2. Cierre la cámara y sifone el exceso de solución madre mitocondrial del receptáculo del tapón.
      NOTA: El reemplazo completo del volumen excluye cualquier variabilidad en la concentración mitocondrial en la que pueda incurrir al ajustar en la cámara cerrada a través del capilar de tapón con una jeringa Hamilton. Este último método es aplicable a muestras con un diámetro pequeño preparadas en suspensiones de stock concentrado (por ejemplo, mitocondrias aisladas); sin embargo, expone las células frágiles a posibles daños en las membranas plasmáticas por las fuerzas de cizallamiento ejercidas en la aguja de 51 mm de largo de la jeringa Hamilton (0,41 mm de diámetro interior). Esto se evita quitando el tapón y pipeteando la muestra en la cámara mediante un reemplazo parcial o completo del volumen. Se estudiaron tres tipos de preparaciones mitocondriales. Las preparaciones de muestra se describen en el Archivo Suplementario 1 1,26,29,30.
3. Células vivas: plaquetas humanas
   1. Introducir los crioviales que contienen plaquetas en un baño de agua a 37 °C y descongelar el contenido hasta que quede poco hielo.
   2. Abra los viales criogénicos y agregue 1 ml de medio precalentado (DPBS + 10 mM EGTA, 37 °C) lentamente en gotas.
   3. Mezcle suavemente las plaquetas y transfiéralas a un tubo de centrífuga de 50 ml con un volumen total de 10 ml de medio precalentado (DPBS + 10 mM EGTA, 37 °C). Centrifugar a 1000 g durante 10 min a temperatura ambiente (RT) utilizando un rotor basculante (aceleración 6, freno 2).
   4. Vuelva a suspender las plaquetas en 0,25 ml de DPBS + 10 mM EGTA (RT) y agréguelas a las cámaras mediante reemplazo parcial de volumen a una concentración inicial de células experimentales que oscila entre 157 · 10⁶ a 210 · 10⁶ x·^mL-1 en la cámara de 0,5 mL y de 164 · 10⁶ a 220 · 10⁶ x·^mL-1 en la cámara de 2.0 mL (ver³¹ para detalles sobre la unidad elemental x).
      NOTA: Un Oroboros estaba equipado con la cámara sV y cV en las posiciones A y B, respectivamente, utilizada en paralelo con otro Oroboros equipado con la cámara sV y cV en las posiciones B y A, respectivamente.
4. Células permeabilizadas: fibroblastos humanos
   1. Agregue las celdas a las cámaras de Oroboros mediante reemplazo parcial de volumen a una concentración nominal de celdas de 0.75 · 10⁶ x·^mL-1 en ambos tipos de cámara y calcular la concentración real (paso 4.1.3).
      NOTA: Se utilizaron diferentes instrumentos Oroboros en paralelo, cada uno equipado con las cámaras sV o cV .
5. Mitocondrias aisladas: corazón de ratón
   1. Agregue 15 μL de suspensión mitocondrial a 5985 μL de medio de respiración mitocondrial (MiR05), lo que da como resultado una concentración de proteína mitocondrial de reserva que oscila entre 0,013 y 0,026 mg∙^mL-1.
   2. Agregue la suspensión mitocondrial a las cámaras de Oroboros mediante un reemplazo completo de volumen.
      NOTA: Un Oroboros estaba equipado con las cámaras sV y cV en las posiciones A y B, respectivamente, utilizadas en paralelo con otro Oroboros equipado con las cámaras sV y cV en las posiciones B y A, respectivamente.

Figura 2: Adición de la suspensión celular mediante reemplazo parcial de volumen. (A) Adición en la cámara de 0.5 ml sV y (B) la cámara cV de 2.0 ml. (1) Cámara cerrada con volúmenes de medio respiratorio V y tapón capilar lleno V_stc, para la medición del fondo instrumental O₂ flujo J_O2°. (2) Tapón retirado, V_stc drenado en la cámara, lo que da como resultado un volumen total V' = V + V_stc. (3) Eliminación parcial del medio V_out = -V _J.i. Un volumen V''= V'+V_permanece en la cámara. (4) Pipeteo de la submuestra con volumen V _J.i de suspensión de células madre respirométricas en la cámara, lo que da como resultado un volumen total V^# = V+V_stc de suspensión de células diluidas. (5) Cámara cerrada con tapón capilar lleno (volumen muerto V_stc) para la medición del flujo de O₂ específico de volumen J_{V, O2} en un volumen experimental V. Esta figura se ha modificado de la Figura 2A en Recuento de células y normalización en HRR⁴¹. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

5. Protocolos SUIT

1. Valore las soluciones madre de los productos químicos enumerados en la Tabla complementaria 1 en las cámaras con microjeringas Hamilton, ajustando los volúmenes de valoración para obtener las mismas concentraciones experimentales en las cámaras sV y cV (ver leyendas de figuras de las Figuras 6, 8, 10).
2. Seleccione el protocolo SUIT-003_D018 ^32,33 (para plaquetas en el presente estudio).
3. Seleccione los protocolos SUIT-001_D004 4,15,34,35 y SUIT-002_D007 ^4,15,35,36 (para fibroblastos en el presente estudio).
4. Seleccione el protocolo SUIT-002_D005 4,15,35,37 (para mitocondrias aisladas en el presente estudio).

6. Análisis de datos de SUIT

1. En DatLab, establezca marcas para definir secciones de los gráficos seleccionados.
2. Seleccione Flujo/pendiente en el menú superior. Abra la ventana Flujo/pendiente . Aplique la corrección del volumen de valoración para la dilución de muestras suspendidas por cada valoración en el protocolo SUIT.
3. Selecciona Marcas en el menú superior. Abra las estadísticas de Marcar para mostrar la mediana de los puntos de datos marcados corregidos por la resta del consumo de oxígeno residual (rox).
4. Calcule la intersección y la pendiente entre los resultados pareados obtenidos en las cámaras sV y cV mediante análisis de regresión invertida^25,28 utilizando una hoja de cálculo.
5. Compare las frecuencias respiratorias en el estado rox (flujos mínimos de O₂) en las cámaras sV y cV mediante una prueba t de Student emparejada utilizando el software jamovi 2.3.13³⁸.
   NOTA: Dado que las dos cámaras de un instrumento Oroboros son funcionalmente independientes (excepto por la temperatura y los intervalos de registro de DatLab), las mediciones en cada cámara se pueden considerar por separado, de manera similar al uso de diferentes instrumentos. Los resultados finales pueden informarse como medianas o promedios de múltiples cámaras con información sobre su variabilidad.

Resultados

Se espera que las señales brutas R1 [μA] de los sensores de oxígeno (POS) sean independientes del volumen de la fase acuosa en equilibrio con la fase gaseosa del aire en la cámara "abierta", como se confirma en Tabla complementaria 2. En la cámara cerrada, sin embargo, el fondo instrumental O₂Flujo cerca de la saturación del aire J°₁[pmol∙s^-1∙mL^-1] depende del volumen V (Tabla complementaria 2). La O₂Consumo del sensor [PMOL ∙s^-1] se puede predecir a partir del flujo de electrones medido como la señal bruta corregida a cero R1-R0 [μA], el número de carga 4 e^-/O₂y la constante de Faraday F = 96 485.33 C∙mol^-1. 1 μA equivale a un flujo de electrones (e^-) de 10.36 pmol∙s^-1. Dividir por el número de carga da como resultado una O₂fluir^15,39 de 2.591 pmol∙s^-1·μA^-1. La mediana registrada de R1-R0 fue de 2,09 μA y 1,98 μA en las cámaras de 0,5 ml y 2,0 ml, respectivamente (Tabla complementaria 2; R0 = 0,006 ± 0,007 μA en el sV y R0 = 0,004 ± 0,003 μA en el cV cámaras), que corresponde teóricamente a O₂Tasas de consumo de 5,41 pmol∙s^-1y 5.13 pmol∙s^-1. La O₂El flujo del sensor se convierte al flujo específico de volumen esperado en saturación de aire (J°_R1) como 5.41 pmol∙s^-1/0,5 ml = 10,82 pmol∙s^-1∙mL^-1y 5.13 pmol∙s^-1/2,0 ml = 2,56 pmol∙s^-1∙mL^-1en la década de 1990V y cV cámara, respectivamente. Con el mismo tipo de sensores polarográficos de oxígeno en la cámara de 2,0 ml y 0,5 ml, el fondo de volumen específico O₂flux - calculado a partir de la corriente R1-R0 (J°_R1) - aumenta teóricamente 4 veces en proporción inversa al volumen de la cámara. J°_aire (en saturación de aire, donde la difusión posterior es cero; comparar Mesa 2 y Tabla complementaria 3) se calculó para la O₂concentración en saturación de aire a partir de la regresión lineal de la prueba de antecedentes experimental (Figura 3). J°_aire se acercó a los valores teóricamente esperados J°_R1 para ambas cámaras (Mesa 2). El J°_aire / J°_R1fue de 0,85 ± 0,04 y de 0,92 ± 0,12 en la década de 1990.V y cV cámara, respectivamente, en línea con una serie independiente de 52 mediciones en la cámara de 2,0 ml, en la que esta relación fue de 0,95 ± 0,12 (Tabla complementaria 4). J°_aire fue 3,9 veces mayor en la cámara de 0,5 ml que en la de 2,0 ml. La red O₂Difusión posterior J°₅₀, calculado a 50 μM O₂de la regresión lineal de la prueba experimental de antecedentes, fue solo tres veces mayor en la cámara de 0,5 mL (Mesa 2). La variabilidad del fondo instrumental O₂Los flujos fueron casi idénticos en los dos volúmenes de cámara diferentes, con una desviación estándar (DE) de 0,5 y 0,3 pmol∙s^-1∙mL^-1para J°_aire y 0,9 y 0,8 pmol∙s^-1∙mL^-1 para J°₅₀en la década de 1990V y cV cámara, respectivamente (Mesa 2). A pesar del fondo instrumental más alto O₂pendientes en la cámara de 0,5 ml, la dependencia del O de fondo₂fundentes encendidos c_O2fue altamente reproducible en ambos tipos de cámara (Figura 3D). Esto da como resultado valores bajos de los residuos <±1 pmol∙s^-1∙mL^-1para ambas cámaras (Tabla complementaria 5), en línea con el límite de detección de los Oroboros²⁸.

Cuantificamos el efecto de la velocidad de agitación en la señal bruta de calibración R1 del POS entre 350 rpm (5,8 Hz) y 950 rpm (15,8 Hz) en pasos de 100 rpm (1,7 Hz) con la cámara en la configuración "abierta". En esta configuración, el O₂ disuelto en el medio está en equilibrio con la fase gaseosa; por lo tanto, los cambios en la señal bruta (microamperios [μA]) en función de la velocidad de agitación no reflejan diferencias reales en c_O2. Los sensores de oxígeno respondieron a un cambio en la velocidad de agitación con una pequeña desviación de R1 a la velocidad predeterminada de 750 rpm, independientemente del volumen de la cámara (Figura 4). En la configuración 'abierta', el ruido de la pendiente de O₂, definida como SD para cada paso después de la estabilización de la señal, fue más bajo a 850 rpm en ambos tipos de cámara y aumentó cuando la velocidad de agitación se desvió de este valor en cualquier dirección (Figura 5A). Por debajo de 550 rpm, el ruido de la pendiente de O₂ superó el umbral de ±4 pmol∙^s-1∙^mL-1, definiendo la velocidad mínima práctica de agitación. Debido a limitaciones técnicas, no se alcanzó el límite superior, lo que hace que 950 rpm sea la velocidad máxima práctica de agitación (Figura 5A). Dentro de este rango, la desviación de la señal O₂ de R1 fue de <2,5 %. El cierre de las cámaras no alteró la relación entre el ruido y la velocidad de agitación (Figura 5B). La constante de tiempo exponencial τ fue de 2,53 ± 0,05 s a 550 rpm y de 2,50 ± 0,05 s a 750 rpm para la cámara de 0,5 ml (Figura complementaria 3).

El protocolo SUIT-003_D018 aplicado a las plaquetas incluye hasta 14 pasos de titulación. Está diseñado para estudiar el control de acoplamiento de células vivas, ce y permeabilidad de la membrana plasmática como índice de viabilidad celular³². El flujo de oxígeno medido en los dos tipos de cámaras (Figura 6) fue estrechamente emparejado en todos los estados respiratorios (Figura 7). Se requieren reoxigenaciones intermitentes para evitar la hipoxia funcional o restringir la concentración experimental de O₂ a un rango definido. Las reoxigenaciones se realizaron abriendo la cámara a la posición "abierta" después de la titulación de Rot. Al cerrar la cámara, el fundente de O₂ se estabilizó en 4 min en la cámara de 2,0 ml, pero se requirieron aproximadamente 10 min en la cámara de 0,5 ml antes de estabilizar y establecer la nueva marca (Figura 6 y Figura complementaria 4). La reoxigenación en el estado rox cuando los flujos de O₂ son bajos evita una disminución de la concentración de O₂ durante el tiempo requerido para la estabilización. La rox inhibida por rotenona fue de 0,9 ± 0,6 y 2,0 ± 0,6 pmol∙^s-1∙^mL-1 a los 98 ± 17 y 94 ± 17 μM O₂ (media ± DE) en la cámara sV y cV, respectivamente. Rox aumentó en 3,1 ± 0,9 y 0,9 ± 0,4 pmol∙^s-1∙^mL-1 tras la reoxigenación a 159 ± 8 y 147 ± 11 μM O₂ en la cámara sV y cV, respectivamente. La dependencia del oxígeno de rox observada en las plaquetas concuerda con los resultados en fibroblastos humanos y células endoteliales de la vena umbilical⁴⁰.

Para el análisis de OXPHOS en fibroblastos permeabilizados, utilizamos dos protocolos SUIT con hasta 17 y 20 pasos de titulación (SUIT-001 y SUIT-002, respectivamente³⁵; Figura 8); por lo tanto, la corrección del volumen de valoración es particularmente importante ya que al final de SUIT-002, la dilución ascendió a un máximo del 14 % y el 10,5 % en la cámara sV y cV, respectivamente. Los recuentos de células de fibroblastos de 0,35,10⁶ x y 1,44,10⁶ x en las cámaras de 0,5 ml y 2,0 ml, respectivamente, dieron como resultado la misma concentración celular de 0,75,10⁶ x ∙ ^ml-1. La combinación de SUIT-001 y SUIT-002 abordó 20 estados respiratorios, todos los cuales se correlacionaron estrechamente en los tipos de dos cámaras (r² = 0,950 para SUIT-001 y r² = 0,959 para SUIT-002). En ambos protocolos, el Complejo IV tuvo una dispersión relativamente alta (Figura 9). No se requirió reoxigenación en SUIT-001 a partir de un flujo de O₂ específico de bajo volumen de 18,7 ± 7,0 pmol∙^s-1∙^mL-1 en el estado de rutina (media ± DE), lo que permitió que la concentración de O₂ disminuyera a 56 μM hasta la sección del protocolo vinculada al CIV (Figura 8A; 8Ama). Sin embargo, en SUIT-002, la reoxigenación se realizó antes de las titulaciones del desacoplador, aumentando la concentración de O₂ de 100 μM a 180 μM (Figura 8B; 6Gp). Teniendo en cuenta el largo tiempo requerido para la estabilización del flujo después de la reoxigenación, se debe evitar la reoxigenación durante las valoraciones del desacoplador.

Se aplicó un protocolo SUIT abreviado a las mitocondrias aisladas (Figura 10). La concentración de proteína mitocondrial se determinó después del ensayo respirométrico, lo que hizo imposible definir de antemano la concentración precisa de la muestra en la cámara. El flujo respiratorio específico del volumen varía en función de la concentración mitocondrial. Por lo tanto, los datos se presentaron como flujo específico de volumen y específico de masa proteica (Figura 11). Ambas representaciones muestran la estrecha correlación entre las mediciones obtenidas en las cámaras de 0,5 ml y 2,0 ml (Figura 11).

El consumo de oxígeno residual medido después de la inhibición del Complejo III por la antimicina A se puede utilizar como un índice de rendimiento instrumental a frecuencias respiratorias muy bajas. En todas las series experimentales, rox fue comparable entre las cámaras de 0,5 ml y 2,0 ml (plaquetas: t ₍₅₎ = -0,34, p = 0,74; fibroblasto: SUIT-001: t ₍₁₀₎ = 20,00, p = 0,06; PALO-002: t₍₁₀₎ = 11,00, p = 0,96; mitocondrias aisladas: t₍₄₎ = -1,18, p = 0,27). La dispersión de los datos correspondió en gran medida a la incertidumbre instrumental de ±1 pmol∙^s-1∙^{mL-1 13,28}, como se ilustra en la Figura 12. Los archivos originales están disponibles para acceso abierto en el repositorio de Zenodo: 10.5281/zenodo.11634408. 

Figura 3: Fondo instrumental O₂ flux para la cámara sV (0,5 mL; verde y negro) y cV (2,0 mL; azul). Rango de concentración de O₂ desde la saturación del aire (aprox. 180 μM) hasta aprox. 50 μM. Símbolos abiertos: Concentraciones de O₂ obtenidas sin Na-ditionita. Símbolos sólidos: Concentraciones de O₂ controladas por valoraciones manuales de Na-ditionita. Círculos negros: concentraciones de O₂ controladas por valoraciones de Na-ditionito utilizando el TIP2k en la cámara de 0,5 ml (N = 8). Los resultados de las pruebas instrumentales de fondo se agruparon de (A) Serie 1 (sV: N = 2; cV: N = 2) antes de usar células vivas (ce); (B) Serie 2 (sV: N = 38; cV: N = 50) antes de usar células permeabilizadas (pce); (C) Serie 3 (sV: N = 10; cV: N = 10) antes de usar mitocondrias aisladas (imt). (D) Datos superpuestos de los paneles A-C. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Efecto de la velocidad de rotación de agitación en la señal POS en saturación de aire (cámara 'abierta') en la cámara de 0,5 ml (verde) y cámara de 2,0 ml (azul). Respuesta [%] relativa a las señales de calibración de aire corregidas por R0 R1-R0 [μA] a 750 rpm (sV: N = 4; cV: N = 4). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Ruido de la pendiente de O₂ en función de la velocidad de rotación de agitación. Ruido expresado como desviación típica en (A) cámara «abierta»; (B) cámara cerrada (0,5 ml, verde; 2,0 ml, azul). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Consumo de O₂ de plaquetas humanas criopreservadas en la cámara de 0,5 ml. Trazas representativas de la concentración de O₂ [μM] (líneas azules) y el flujo de O₂ por célula [amol∙^s-1∙^x-1] calculado como el flujo de O₂ [pmol∙^s-1∙^mL-1] dividido por la concentración celular de 157∙10⁶ x∙^mL-1 (líneas rojas, corregidas por el flujo de O₂ de fondo instrumental; se eliminaron los picos causados por las valoraciones). La concentración de O₂ se mantuvo por encima de 50 μM mediante reoxigenaciones intermitentes (aire, cámara "abierta", tono azul). Secuencia de estados respiratorios (titulaciones y frecuencias; protocolo SUIT-003_D018): ce1, respiración rutinaria R de células vivas. ce1P, piruvato 5 mM como sustrato externo. ce2Omy10 (panel A), valoraciones de Omy en pasos de 5 nM; fuga de respiración L. ce3U0,3 (panel A) y ce3U0,1 (panel B), valoraciones del desacoplador a una concentración óptima de CCCP de 0,3 y 0,1 μM, respectivamente; Capacidad ET E. ce3Glc, glucosa 11 mM; E inhibido progresivamente por el desacoplador. ce4Rot, rotenona 0,5 μM inhibiendo el CI; Consumo de oxígeno residual Rox. ce5S, succinato 10 mM; estimulando la E en células permeables a la membrana plasmática. 1Dig15 (panel A) y 1Dig10 (panel B), valoraciones de digitonina en pasos de 5 μg·^mL-1 a concentraciones óptimas de 15 y 10 μg·^mL-1, respectivamente para la permeabilización completa de la membrana plasmática; capacidad ET de la vía del succinato S_E. 1c, citocromo c 10 μM; Prueba de integridad de la membrana externa mitocondrial. 2Ama, antimicina A 2,5 μM inhibidora de CIII; rox. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7: Correlación de la respiración de las plaquetas humanas criopreservadas medidas en la cámara de 0,5 ml y 2,0 ml. El flujo de O₂ corregido por Rox se evaluó en el protocolo SUIT-003_D018 (Figura 6); N = 6. (A) Con oligomicina Omy; (B) sin Omy. Pendientes medias e intersecciones de la regresión de mínimos cuadrados invertidos y coeficientes de determinación r² calculados a partir de todos los datos. Las líneas negras discontinuas representan las líneas de identidad. Las líneas rojas representan las líneas de regresión calculadas. Se excluyeron los flujos de O₂ en el estado posterior a la adición de glucosa (ver Figura 6). Los protocolos con y sin oligomicina se separan en los paneles A y B para evitar la superposición de puntos de datos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 8: Consumo de fibroblastos de O₂ en la cámara de 0,5 ml. Trazas representativas de c_O2 (líneas azules [μM]) y flujo de O₂ por célula calculadas como flujo de O₂ [pmol∙^s-1∙mL-1] dividido por la concentración celular (0,75·10⁶ x∙^mL-1), corregido por el flujo de O₂ de fondo instrumental (se eliminaron las líneas rojas, los picos causados por las valoraciones). La concentración de O₂ se mantuvo por encima de 50 μM mediante reoxigenaciones intermitentes (aire, cámara "abierta", tono azul). Secuencia de estados respiratorios (titulaciones y frecuencias). (A) Protocolo SUIT-001_D004: ce1, respiración de rutina R. +Dig, digitonina 10 μg·^mL-1 (ce a pce), respiración endógena residual ren. 1PM, piruvato 5 mM y malato 2 mM; Respiración de fuga de la vía N N_L. 2D, ADP 2,5 mM; Capacidad de OXPHOS de la vía N_P. 2c, citocromo c 10 μM; Prueba de integridad de la membrana externa mitocondrial. 3U1.5, valoraciones del desacoplador a una concentración óptima de CCCP de 1,5 μM; Capacidad ET vinculada al NADH N_E. 4G, glutamato 10 mM; N(PGM)_E. 5S, succinato 10 mM; Capacidad de ET de la vía NS NS_E. 6Rot, rotenona 0,5 μM; capacidad ET de la vía del succinato S_E. 7Gp, glicerofosfato 10 mM; SGp_E. 8Ama, antimicina A 2,5 μM; rox. 9AsTm, ascorbato 2 mM y TMPD 0.5 mM; sustratos para la estimulación de CIV; la cámara se mantuvo abierta durante 20 min para permitir el equilibrio redox sin agotamiento de oxígeno⁴; O₂ fundente fuera de escala después de cerrar la cámara (205 amol·^s-1·^x-1). 10Azd, azida 100 mM; Flujo de fondo químico dependiente de oxígeno CHB. b) Protocolo SUIT-002_D007: ce1, R. +Excavar, ren. +D, estimulante ren. +M.1, malato 0,1 mM y 1Oct, octanoilcarnitina 0,5 mM; Capacidad de OXPHOS de la vía F_{F P} = J(1Oct)-J(+M.1). 1c. 2M2, malato 2 mM que apoya la vía N anaplerótica; F(N)_P. 3P y 4G, activación progresiva a FN_P. 5S, FNS_P. 6Gp, FNSGp_P. 7U1.5, FNSGp_E. 8Rot, SGp_E. 9Ama, rox. 10AsTm O₂ fundente fuera de escala 207 amol·^s-1·^x-1. 11Azd, cap. En general, la actividad del Complejo IV es la diferencia de tasas, J (AsTm) -J (Azd) a concentraciones de O₂ estrechamente coincidentes. Consulte la Figura 6 para obtener más detalles. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 9: Correlación de la respiración de fibroblastos permeabilizados en la cámara de 0,5 ml y 2,0 ml. Flujo de O₂ corregido por Rox en (A) SUIT-001_D004 y (B) SUIT-002_D007 (N = 6). Pendiente media e intersección de la regresión de mínimos cuadrados invertidos y coeficiente de determinación r² calculados a partir de todos los datos. La línea negra discontinua representa la línea de identidad. Las líneas rojas representan las líneas de regresión calculadas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 10: Consumo de O₂ de mitocondrias cardíacas de ratón aisladas en cámaras de 0,5 ml (verde) y 2,0 ml (azul). Trazas representativas de (A) flujo de O₂ específico de masa a una concentración de proteína mitocondrial de 0,023 mg∙^mL-1 (corregido por el flujo de O₂ de fondo instrumental, se eliminaron los picos causados por las valoraciones) y (B) concentración de O₂ [μM]. Secuencia de estados respiratorios (titulaciones y frecuencias) siguiendo el protocolo SUIT-002_D005: imt, respiración endógena residual. +D, ADP 2,5 mM; Estimulando Ren. +M.1, malato 0,1 mM y 1Oct, octanoilcarnitina 0,5 mM; Capacidad de OXPHOS de la vía F_{F P} = J(1Oct)-J(+M.1). 1c, citocromo c 10 μM; Prueba de integridad de la membrana externa mitocondrial. 2M2, alto malato 2 mM que apoya la vía N anaplerótica; F(N)_P. 3P, piruvato 5 mM; FN_P. 4G, glutamato 10 mM; FN_P. 5S, succinato 10 mM; FNS_P. 6Gp, glicerofosfato 10 mM; FNSGp_P. 7U0,5, valoraciones del desacoplador a una concentración óptima de CCCP de 0,5 μM; FNSGp_E. 8Rot, rotenona 0,5 μM inhibiendo el CI; SGp_E. 9Ama, antimicina A 2,5 μM inhibidora de CIII; Consumo de oxígeno residual Rox. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 11: Correlación de la respiración de las mitocondrias cardíacas de ratón aisladas medidas en las cámaras de 0,5 ml y 2,0 ml. O₂ en el protocolo que se muestra en la Figura 10 (N = 4). (A) Flujo de O₂ específico del volumen. (B) Flujo de O₂ corregido por Rox dividido por la concentración de proteína mitocondrial (0,013 - 0,026 mg ∙ ^mL-1). Pendiente media e intersección de la regresión de mínimos cuadrados invertidos y coeficiente de determinación r² calculados a partir de todos los datos. Las líneas negras discontinuas representan la línea de identidad. Las líneas rojas representan la línea de regresión calculada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 12: Consumo de oxígeno residual rox en las cámaras de 0,5 ml y 2,0 ml. Flujo por volumen medido después de la adición de antimicina A, combinado de experimentos con células vivas (ce, cuadrados), células permeabilizadas (pce, círculos) y mitocondrias aisladas (imt, triángulos). Pendiente media e intersección de regresión de mínimos cuadrados invertidos. Línea discontinua: línea de identidad. Línea roja: línea de regresión calculada. Shadow: rango de resolución instrumental. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Módulo	sV	cV
Cámara experimental volumen V	0,5 ml	2,0 ml
Diámetro interior del cilindro de vidrio	12,0 milímetros	16,0 milímetros
Diámetro exterior del cilindro de vidrio	24,0 milímetros	24,0 milímetros
Espesor de la pared de vidrio	6,0 milímetros	4,0 milímetros
Barra agitadora recubierta de PVDF	11,5 x 6,2 mm	15,0 x 6,0 milímetros
Diámetro capilar del tapón	1,00 milímetros	1,30 milímetros
Área de la sección transversal capilar del tapón	0,79 milímetros2	1,33 milímetros2
Longitud capilar del tapón	50,64 milímetros	48,86 milímetros
Volumen capilar del tapón	39,8 μl	64,9 μl
Tapón capilar volumen muerto Vstc incluyendo una pequeñagota a	0,04 ml	0,07 ml
Volumen V' para la calibración del volumen	0,54 ml	2,07 ml

^unLa gota debe corresponder a 5 μL para la Cámara cV y cerca de 0 μL para la Cámara sV.
Tabla 1: Dimensiones de los módulos de volumen pequeño (sV) y volumen clásico (cV) con tapones de poliéter éter cetona (PEEK).

	J°air / [pmol∙s-1∙mL-1]		J°50 / [pmol∙s-1∙mL-1]
Cámara experimental volumen V	0,5 ml	2,0 ml	0,5 ml	2,0 ml
Significar	9.22	2.37	-3.17	-1.17
Mediana	9.25	2.36	-3.08	-1.04
Desviación estándar	0.49	0.34	0.93	0.83
Mínimo	8.20	1.79	-5.11	-3.72
Máximo	10.41	3.42	-0.82	0.67

Tabla 2: J°_air extrapolado a la saturación del aire y J°₅₀ calculado a una concentración de 50 μM O₂ . Los datos agrupados de las pruebas instrumentales de fondo en las series 2 (pce) y 3 (imt) y antes de las valoraciones de TIP2k (0,5 mL: N = 48; TIP2k: N = 8; 2,0 mL: N = 60).

Archivo complementario 1: Muestras de preparación. Plaquetas humanas, fibroblastos humanos y mitocondrias aisladas de corazones de ratones. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 1: Prueba de fondo instrumental O₂ utilizando el TIP2k. Trazas representativas de la prueba realizada con el TIP2k para valorar Na-ditionito (2,5 mM) en la cámara de 0,5 ml. Medio: MiR05, temperatura: 37 °C, velocidad de agitación: 750 rpm. Se eliminaron los picos causados por las valoraciones. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 2: Fondo instrumental Flujo de O₂ J°₁ en función de la concentración de O₂ . Cámara sV (0,5 ml; verde, N = 48) y cámara cV (2,0 ml; azul, N = 60) en las series 2 (pce, círculos) y 3 (imt, triángulos), y antes de las valoraciones de TIP2k en la cámara de 0,5 ml (círculos negros, N = 8). Líneas rojas: mediana ± SD. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 3: Constante de tiempo exponencial τ en función de la velocidad de rotación de agitación. Valores individuales de τ para la cámara de 0,5 ml a 37 °C (N = 2). En la cámara de 0,5 ml, τ fue de 2,53 ± 0,05 s a 550 rpm, 2,50 ± 0,05 s a 750 rpm y 2,47 ± 0,04 s a 850 rpm. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 4: Consumo de O₂ de plaquetas humanas criopreservadas en la cámara de 2,0 ml. Traza representativa del protocolo SUIT-003_D018, incluidas las valoraciones de oligomicina (Omy). El flujo [pmol∙^s-1∙^mL-1] se corrigió para el flujo instrumental de fondo O₂ y se dividió por la concentración celular (164∙10⁶ x∙^mL-1). Se eliminaron los picos causados por las valoraciones. c_{El O2} se mantuvo por encima de 60 μM mediante reoxigenaciones intermitentes (aire, cámara "abierta", tono azul). Secuencia de estados respiratorios (titulaciones y frecuencias): ce1, respiración rutinaria R de células vivas. ce1P, piruvato como sustrato externo. ce2Omy10, valoraciones de Omy en pasos de 5 nM; fuga de respiración L. ce3U2.0, valoraciones del desacoplador a concentraciones óptimas de 2 μM; Capacidad ET E. ce3Glc, glucosa 11 mM; E inhibido progresivamente por el desacoplador. ce4Rot, rotenona 0,5 μM inhibidora de CI; Consumo de oxígeno residual Rox. ce5S, succinato 10 mM; estimulando la E en células permeables a la membrana plasmática. 1Dig20, valoraciones de digitonina a concentraciones óptimas de 20 μg·^mL-1, para una permeabilización completa de la membrana plasmática; capacidad ET de la vía del succinato S_E. 1c, citocromo c 10 μM; Prueba de integridad de la membrana externa mitocondrial. 2Ama, antimicina A 2,5 μM inhibidora de CIII; rox. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla complementaria 1: Productos químicos utilizados en los protocolos de titulación de inhibidores-desacopladores de sustrato (SUIT). Abreviaturas y concentraciones de solución madre para las cámaras sV y cV . Haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla complementaria 2: Comparación de R1-R0 y J°₁ en las cámaras de 0,5 ml y 2,0 ml. Los datos agrupados de las pruebas instrumentales de fondo en las series 2 (pce) y 3 (imt) y antes de las valoraciones de TIP2k (0,5 mL: N = 48; TIP2k: N = 8; 2,0 mL: N = 60). Los datos se promediaron de las Series experimentales 2 (pce) y 3 (imt) solamente, que se realizaron a una presión barométrica promedio de 94,9 kPa (Innsbruck, Austria), excluyendo los datos de la Serie 1 (ce) obtenidos a nivel del mar. Se utilizó el mismo tipo pero diferentes POS individuales en las cámaras de 0,5 ml y 2,0 ml. Por lo tanto, se debe considerar la variabilidad entre los sensores al comparar las cámaras sV y cV. Mientras que J°₁ = 2,26 ± 0,41 pmol∙^s-1∙^mL-1 obtenido experimentalmente para la cámara de 2,0 mL correspondía estrechamente al valor calculado, el J°₁ experimental = 8,48 ± 0,53 pmol∙^s-1∙mL-1 para la cámara de 0,5 mL fue menor de lo esperado. Esto se explica por las siguientes observaciones. Después de cerrar la cámara, el mayor flujo de O₂ de fondo en la cámara de 0,5 ml reduce las concentraciones de O₂ en las marcas de J°₁ establecidas en intervalos de tiempo comparables (Figura 1). La concentración de oxígeno en J°₁ fue en promedio 4.06 % y 1.72 % por debajo de la saturación de aire en la cámara de 0.5 mL y 2.0 mL, respectivamente (Figura complementaria 2, Tabla complementaria 2). A un c_O2 más bajo, el consumo disminuido de O₂ por el sensor y algo de difusión posterior de O₂ reducen el J°₁ determinado experimentalmente. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla complementaria 3: Concentración de oxígeno [μM] a la que se obtuvo la calibración (R1) y J°₁ y su diferencia porcentual. Los datos agrupados de las pruebas instrumentales de fondo en las series 2 (pce) y 3 (imt) y antes de las valoraciones de TIP2k (0,5 mL: N = 48; TIP2k: N = 8; 2,0 mL: N = 60). Haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla complementaria 4: J°₁ medido y esperado en la cámara de 2,0 ml. Serie independiente de pruebas instrumentales de fondo con O2k serie A (con tapones de titanio¹³), V = 2,0 ml (37 °C, solución de NaCl con factor de solubilidad de O₂ 0,92; N = 52). n_O2/Q_e = 10⁶/(96485.33·4) = 2.591 pmol∙^μC-1 = 2.591 pmol∙^s-1∙^μA-1. Basado en la suposición de que la difusión de O₂ es despreciable en c_O2,1, lo que es cierto solo en c_O2,1 ~ c_O2*. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla complementaria 5: Residuos de regresión lineal (valores absolutos [pmol O₂∙^s-1∙^mL-1]) calculados para cada prueba de fondo instrumental O₂. Datos agrupados de pruebas instrumentales de fondo en las series 2 (pce) y 3 (imt) y antes de las valoraciones TIP2k. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

La cantidad de muestra disponible para la respirometría es frecuentemente limitada, por ejemplo, en estudios de biopsias, células primarias o cultivos celulares de crecimiento lento con recuentos celulares bajos¹. Además, las actividades respiratorias se deprimen debido a lesiones mitocondriales¹¹ o cuando se investigan vías mitocondriales con bajas capacidades, como la oxidación de ácidos grasos¹². En estos casos, un bajo volumen de cámara respirométrica ofrece ventajas para la resolución del flujo de O₂. Sin embargo, los flujos instrumentales de O₂ de fondo aumentan a volúmenes de cámara más bajos e inducen errores cuando no se miden de manera confiable y no se corrigen adecuadamente en función de la concentración de O₂. La replicabilidad de las pruebas instrumentales de fondo de O₂ y las correcciones de fondo son particularmente importantes para volúmenes de cámara bajos. Los valores casi idénticos del flujo teórico (J°_R1) y experimental (J°_air) de O₂ proporcionan evidencia de la precisión de la medición polarográfica con 4 e^-/O₂ en la reacción catódica del POS. La diferencia entre J°_R1 y J°_air fue de 1,64 ± 0,43 y 0,22 ± 0,31 pmol∙^s-1∙mL-1 en la cámara sV y cV, respectivamente, lo que indica una precisión en las mediciones que se encuentra dentro del límite de detección de la cámara de 2,0 mL (±1 pmol∙^s-1∙^mL-1)²⁸. Con el mismo tipo de sensores polarográficos de oxígeno en la cámara de 2,0 ml y 0,5 ml, el flujo de O₂ de fondo específico del volumen aumentó 4 veces en proporción inversa al volumen de la cámara, y la variabilidad fue casi idéntica en los volúmenes de las dos cámaras, con una desviación estándar de 0,5 y 0,3 pmol∙^s-1∙mL-1 para J°_air y 0,9 y 0,8 pmol∙^s-1∙^mL-1 para J°₅₀ en los sV y cV cámara, respectivamente (Tabla 2). Como mínimo, las actividades respiratorias, para las que se diseñó la cámara de pequeño volumen, incluso los pequeños efectos de fondo se vuelven significativos (Tabla complementaria 3; Figura complementaria 2). Por lo tanto, se requiere una evaluación rutinaria del flujo instrumental de fondo O₂ (Figura 1) para aplicar la corrección adecuada²⁸.

Se requiere una agitación alta y constante del medio para mantener un sistema homogéneo y garantizar una señal de oxígeno estable. La velocidad de agitación de 750 rpm se establece para la cámara de 2,0 ml, pero no se conocía la velocidad óptima en la cámara de 0,5 ml. Las diferentes geometrías de la cámara de vidrio y la barra agitadora (Tabla 2) requieren una evaluación independiente de la velocidad óptima de agitación. Los sensores de oxígeno respondieron a cambios en la velocidad de agitación entre 550 rpm y 950 rpm, con una pequeña desviación de la señal O₂ R1 a 750 rpm, independientemente del volumen de la cámara. La constante de tiempo exponencial τ evaluada para la Cámara sV estuvo de acuerdo con τ reportada para la cámara de 2.0 mL a la misma velocidad de agitación¹³. Estos resultados sugieren que la agitación es igualmente efectiva en ambas geometrías de cámara y que la velocidad de agitación predeterminada de 750 rpm (cámara de 2,0 ml) se puede aplicar a la cámara de 0,5 ml. Tanto en la configuración de la cámara "abierta" como en la "cerrada", la cámara de 0,5 ml tenía una mayor relación señal-ruido, lo que sugiere una mayor precisión como una ventaja de la cámara de 0,5 ml (Figura 5), aunque no se puede excluir el efecto de la variabilidad individual del POS. Dado que el ruido no aumentó al reducir la velocidad de agitación de 750 rpm a 550 rpm, reducir la velocidad de agitación a 550 rpm en la cámara de 0,5 ml puede ser beneficioso para minimizar el esfuerzo cortante sin comprometer la relación señal-ruido.

Se midieron tasas de consumo de_O2 casi idénticas en las cámaras de 0,5 ml y 2,0 ml en tres modelos experimentales cuando se aplicó la corrección de fondo adecuada. Los resultados obtenidos con plaquetas pequeñas de 2 μm de diámetro⁴², fibroblastos vivos y permeabilizados y mitocondrias aisladas sugieren que se puede esperar obtener frecuencias respiratorias consistentes en las cámaras de 0,5 ml y 2,0 ml en una amplia gama de tipos de células y preparaciones mitocondriales. Sin embargo, las fibras musculares permeabilizadas no se han probado en el presente estudio. La medición precisa de rox requiere control de los niveles de oxígeno⁴⁰ y alta resolución instrumental¹. El flujo de O₂ específico del volumen de rox puede ser tan bajo como el límite de detección. Las reoxigenaciones no son necesarias cuando se utilizan recuentos celulares bajos o cantidades generalmente bajas de muestras en un experimento. Sin embargo, si es necesario, se recomienda realizar reoxigenaciones en estados respiratorios con bajo flujo de O₂ para evitar una rápida disminución de la concentración de O₂ durante el período requerido para la estabilización del flujo de O₂. La estabilización del flujo de O₂ después de las reoxigenaciones lleva más tiempo en la cámara de 0,5 ml.

Como contribución al control de calidad, se debe prestar especial atención a la dilución de la muestra en suspensión durante la reposición parcial del volumen. Después de retirar el tapón completamente insertado, el volumen total V' del medio de respiración en la cámara viene dado por el volumen experimental V y el volumen capilar del tapón V_stc (Tabla 2). Por lo tanto, el volumen de stock V _J.i se diluye en el volumen real V', que es mayor que V, lo que da como resultado un factor de dilución V/V' de 0,5/0,54 = 0,926 y 2,0/2,07 = 0,966 en las cámaras de 0,5 ml y 2,0 ml, respectivamente (Figura 2). En los experimentos con plaquetas, se utilizó un prototipo de tapón para la Cámara sV con un volumen muerto capilar de 0,05 mL, correspondiente a un factor de dilución de 0,909.

Se requieren cantidades casi cuatro veces menores de células vivas, células permeabilizadas y mitocondrias aisladas en la cámara de 0,5 ml que en la cámara de 2,0 ml a concentraciones de muestra idénticas (cantidad por volumen), lo que arroja resultados cuantitativamente comparables del consumo respiratorio de_O2 normalizado para el recuento de células o la masa de proteínas. Esto indica que la Cámara sV es una herramienta valiosa para estudios en los que la cantidad de muestras disponibles es limitada. Por otro lado, la aplicación de una cantidad idéntica de muestra en la cámaras V aumenta el flujo de O₂ específico del volumen y, por lo tanto, reduce la incertidumbre de las mediciones cuando las actividades respiratorias son bajas.

El régimen de oxígeno en el presente estudio se restringió al rango O₂ de saturación de aire a 30 μM. La aplicabilidad a niveles de oxígeno más allá de este rango requiere una evaluación adicional para investigar la función mitocondrial en la normoxia o hipoxia^{tisular 43} y los tejidos permeabilizados en la hiperoxia⁹. Varias configuraciones multisensor de los módulos NADH y Q de Oroboros; electrodos de pH, NO y TPP^{+ 10,44} - no se pueden acomodar en la cámara sV y requieren la cámara de 2,0 ml.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Anaconda3	Anaconda Software Distribution	https://www.anaconda.com/	software
ADP	Merck, Alemania	117105
Antibióticos-antimicóticos 100x	Biosera, Francia	XC-A4110	PRECAUCIÓN H317 Puede causar una reacción alérgica en la piel
Antimicina A	Sigma-Aldrich, EE. UU.	A8674	PRECAUCIÓN H300  Mortal en caso de ingestión, peligro acuático H400 a corto plazo (agudo)
Ascorbate	Sigma-Aldrich, Estados Unidos	A7631
ATP	Sigma-Aldrich, Estados Unidos	A 2383
BSA libre de ácidos grasos	Sigma-Aldrich, EE. UU.	A 6003	albúmina sérica bovina
CaCO3	Sigma-Aldrich, EE. UU.	C 4830
CCCP	Sigma-Aldrich, EE. UU.	C2759	cianuro de carbonilo m-clorofenil hidrazona PRECAUCIÓN H301 + H311 + H331 Tóxico en caso de ingestión, contacto con la piel o inhalación
Condesa Contador celular automatizado	Thermo Fisher Scientific, EE. UU	AMQAX100
Citocromo c	Sigma-Aldrich, EE. UU.	C7752
DatLab	Oroboros Instruments, Austria	Versión 7.4	Software para adquisición y análisis de datos
DatLab	Oroboros Instruments, Austria	Versión 8.1	Software para adquisición y análisis
de datos DC Protein Assay	Bio-Rad, EE. UU	5000112	Kit de ensayo de proteínas; PRECAUCIÓN H314 Causa quemaduras graves en la piel y daño ocular
Digitonin	Sigma-Aldrich, EE. UU.	D5628	PRECAUCIÓN H301 Tóxico si se ingiere
Ditiotreitol	Sigma-Aldrich, EE. UU.	D 0632	PRECAUCIÓN H318 Causa daño ocular grave
DMEM	Pan Biotech, Alemania	P04-05551	Dulbecco' s modificado Eagle' s
medio DMSO	Sigma-Aldrich, EE. UU.	D2650	dimetilsulfóxido
DPBS	Lonza Bioscience, Suiza	LONBE17-512F	Dulbecco sin calcio' s solución salina tamponada con fosfato
EGTA	Sigma-Aldrich, EE. UU.	E 4378
FBS	Thermo Fisher Scientific, EE. UU.	A5256701	suero fetal bovino
Glucosa	Sigma-Aldrich, EE. UU.	G7528
Glutamato	Sigma-Aldrich, USA	G1626
Glicerofosfato	Santa Cruz Biotechnology	sc-215789
Heraeus Multifuge 3s Large	Thermo Fisher Scientific, USA	HM3S	centrifuge
Hettich Rotina 380R	Andreas Hettich GmbH & Co. KG, Alemania	1701	centrífuga
Imidazol	Honeywell Fluka, Austria	56750	PRECAUCIÓN H302 Nocivo en caso de ingestión, H314 Causa quemaduras graves en la piel y daños oculares, H360D Puede dañar al feto
jamovi	El proyecto jamovi	Versión 2.3.13	software
K+-MES	Sigma-Aldrich, USA	M 8250
Tubo de leucosep	Greiner Bio-One GmbH, Austria	Tubo centrífugo Z642843-300EA	con barrera de polietileno
Malate	Sigma-Aldrich, USA	M1000	PRECAUCIÓN H319 Causa irritación ocular grave.
Manitol	Sigma-Aldrich, USA	M 4125
MgCl2	Scharlau, España	MA 0036
MiR05-Kit	Oroboros Instruments, Austria	60101-01	medio de respiración mitocondrial
Mezclador	Swelab Instruments, Suecia	Mesa mecedora	440S
Mr. Frosty Freezing Container	Thermo Fisher Scientific, EE. UU.	5100-0001	contenedor de congelación
Oroboros	Oroboros Instruments, Austria		el NextGen-O2k y el O2k se abordan colectivamente con el término ' Oroboros
Cámara Oroboros cV	Oroboros Instruments, Austria	23100-01	cámara de volumen clásica
Cámara Oroboros sV	Oroboros Instruments, Austria	33100-01	cámara de volumen pequeño
Oroboros TIP2k-Module	Oroboros Instruments, Austria	11100-03	Valoración-Inyección microPump
O2-Zero Powder	Oroboros Instruments, Austria	26600-02	Na-ditionita PRECAUCIÓN H251 Autocalentamiento: puede incendiarse, H302 Nocivo si se ingiere, H319 Causa irritación ocular grave
octanoilcarnitina	Biotrend - APExBIO Technology, Alemania	B6371
Oligomicina	Sigma-Aldrich, EE. UU.	O4876
Fosfocreatina	Sigma-Aldrich, EE. UU.	P 7936
Piruvato	Sigma-Aldrich, EE. UU	P2256	PRECAUCIÓN H317 Puede causar una reacción alérgica en la piel
Rotenone	Sigma-Aldrich, USA	R8875	PRECAUCIÓN H300 Fatal si se ingiere
Líneas celulares de fibroblastos de la piel	ATCC, EE. UU.
Azida sódica	Sigma-Aldrich, EE. UU.	S2002	PRECAUCIÓN H300 + H310 + H330 Mortal en caso de ingestión, contacto con la piel o inhalación
Subtilisina A	Sigma-Aldrich, EE. UU.	P 5380	PRECAUCIÓN H318 - Causa daño ocular grave, H334 - Puede causar síntomas de alergia o asma o dificultades respiratorias si se inhala
Succinato	Sigma-Aldrich, EE. UU.	S2378
Sucrose	Sigma-Aldrich, USA	S 7903
Swelab Alfa contador de células sanguíneas	Boule Diagnostics AB, Suecia	1420041
Taurina	Sigma-Aldrich, EE. UU.	T 0625
Tecan Infinite TM F200	Tecan, Suiza		espectrofotómetro
TMPD	Sigma-Aldrich, EE. UU.	T3134	N, N, N', N'-Tetrametil-p-fenilendiamina diclorhidrato PRECAUCIÓN H315 Causa irritación de la piel, H319 Causa irritación ocular grave
Tripsina	Sigma-Aldrich, EE. UU.	T4799	PRECAUCIÓN H334 Puede causar síntomas de alergia o asma o dificultades respiratorias si se inhala
Vacuette	Greiner Bio-One GmbH, Austria	15452520