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Artículo de método

Derivación de un organoide cerebral humano con desarrollo de microglía

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DOI:

10.3791/67491

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17 de enero de 2025

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1Translational Neuroscience Center, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health, 2Cancer Genetics and Comparative Genomics Branch, National Human Genome Research Institute, National Institutes of Health

En este artículo

Resumen

Presentamos un protocolo para generar un organoide cerebral humano con microglía residente mediante la incorporación de células progenitoras hematopoyéticas (HPC) derivadas de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) en el desarrollo de organoides.

Resumen

Los cultivos tridimensionales (3D) de organoides cerebrales derivados de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) proporcionan una importante herramienta alternativa in vitro para estudiar el desarrollo del cerebro humano y la patogénesis de las enfermedades neurológicas. Sin embargo, la falta de incorporación de microglía en los organoides del cerebro humano sigue siendo un obstáculo importante para los modelos 3D de neuroinflamación. Los enfoques actuales incluyen la incorporación de microglía completamente diferenciada en organoides cerebrales maduros o la inducción de la diferenciación microglial desde la etapa temprana de cuerpos embrioides (EB) derivados de iPSC. El primer enfoque pasa por alto la etapa en la que la diferenciación microglial interactúa con el entorno neuronal adyacente, y el último enfoque es técnicamente desafiante, lo que resulta en inconsistencia entre los organoides finales en términos de la cantidad y calidad de la microglía. Para modelar organoides cerebrales con microglía para estudiar las interacciones tempranas entre el desarrollo microglial y neuronal, se incorporaron células progenitoras hematopoyéticas (HPC) de alta pureza diferenciadas de las iPSC humanas en EB derivadas de iPSC para producir organoides cerebrales. Mediante el uso de inmunotinción y secuenciación de ARN de una sola célula (sc-RNA-seq), confirmamos que las HPC se incorporaron a los organoides 3D, que finalmente se convirtieron en organoides cerebrales con microglía y neuronas. En comparación con los organoides cerebrales sin HPC, este enfoque produce una incorporación microglial significativa en los organoides cerebrales. Este novedoso modelo de organoide 3D, que consta de propiedades de desarrollo microglial y neuronal, se puede utilizar para estudiar las interacciones tempranas entre el desarrollo inmunitario innato y del sistema nervioso y, potencialmente, como modelo para la neuroinflamación y los trastornos neuroinfecciosos.

Introducción

Las microglías son células inmunitarias residenciales en el cerebro, que desempeñan un papel fundamental tanto en el desarrollo del cerebro como en la homeostasis 1,2. La activación de la microglía da lugar a la producción de factores proinflamatorios, fagocitosis elevada y estrés oxidativo reactivo, que elimina los patógenos invasores y las células comprometidas. Sin embargo, la sobreactivación o la activación prolongada de la microglía puede, por otro lado, causar neurodegeneración como mecanismo de patogénesis en muchos trastornos neurológicos, incluida la enfermedad de Parkinson 3,4. Es importante que la microglía se incluya en los modelos relevantes para el estudio de los trastornos neurológicos humanos. En los últimos años, las células madre humanas se han utilizado para desarrollar organoides 3D como modelos in vitro como alternativa a los modelos animales y a los estudios con sujetos humanos5. Idealmente, los organoides humanos constituyen múltiples tipos de células y estructuras de tejidos similares a los órganos humanos correspondientes, representando mejor la fisiología y la patogénesis humanas que los modelos animales, pero sin las preocupaciones éticas involucradas en los estudios de individuos humanos directamente. Pueden representar el futuro de la modelización de enfermedades humanas para el estudio de la patogénesis y el desarrollo de fármacos y para la orientación de terapias individualizadas6. Por ejemplo, los organoides cerebrales humanos en 3D derivados de células madre pluripotentes inducidas por humanos (iPSC) han prevalecido en el campo de la investigación en neurociencia, modelando enfermedades infecciosas neuronales como el ZIKA, el SARS-CoV-27 y enfermedades neurodegenerativas como la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) y la enfermedad de Alzheimer 8,9. Sin embargo, los organoides neuronales 3D convencionales que utilizan la inhibición de SMAD dual para inducir la diferenciación neuronal10 producen organoides cerebrales que carecen de microglía, ya que se derivan de progenitores reclutados de la sangre en lugar del linaje del neuroectodermo del que provienen las neuronas 11,12. Sin la presencia de microglía, los organoides son inadecuados para modelar las infecciones del SNC, la inflamación y la neurodegeneración asociada.

Para abordar este problema crítico, se han realizado intentos de incorporar microglía diferenciada en los organoides cerebrales13 o inducir la diferenciación microglial dentro de los organoides desde el principio utilizando enfoques alternativos en lugar de la inhibición de SMAD dual13. Sin embargo, al incorporar microglía diferenciada en los organoides cerebrales, se pierden las interacciones tempranas entre el desarrollo neuronal y microglial. Esto podría ser importante en el desarrollo del SNC o en la patogénesis de trastornos neuroinfecciosos dirigidos al desarrollo del cerebro infantil, como en la infección por el virus ZIKA14. Por otro lado, la diferenciación de la microglía innata dentro de organoides cerebrales derivados de iPSC sin etapas intermitentes implica un proceso prolongado y tiene una mayor variabilidad dentro de los productos finales15. En este protocolo informado, incorporamos las células progenitoras hematopoyéticas (HPC) derivadas de iPSC en las iPSC para crear cuerpos embrioides (EB), que se diferenciaron aún más en organoides 3D que incluían neuronas y microglía.

Nuestro protocolo proporciona un enfoque fácil que se puede adoptar para estudiar el sistema nervioso central humano que involucra interacciones neuronas y microgliales tempranas y la patogénesis de trastornos infecciosos neuronales y neuroinflamación que involucran activación microglial.

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Protocolo

Las muestras de sangre originales de donantes adultos sanos se recolectaron en el Banco de Sangre de Medicina Transfusional de los NIH, y se obtuvieron formularios de consentimiento informado firmados de acuerdo con la Junta de Revisión Institucional de los NIH.

1. Producción de células progenitoras hematopoyéticas (HPC) a partir de iPSC humanas

NOTA: Se utilizaron las células iPSC humanas 510 y 507 para producir los resultados representativos. Los métodos de generación y mantenimiento de las iPSCs se pueden encontrar en una publicación anterior16.

  1. Día 0: Cubrir una placa de celdas de 12 pocillos añadiendo 500 μL/pocillo de solución helada de Matrigel (matriz de membrana basal [BMM]) diluida en medio DMEM/F12 e incubarla durante al menos 30 minutos a temperatura ambiente (RT).
  2. Retire completamente el sobrenadante de recubrimiento y reemplácelo con 1 mL de medio E8 Flex por pocillo.
  3. Verifique el cultivo de iPSC en una placa de 6 pocillos bajo el microscopio para confirmar que las iPSC son de alta calidad y sin signos de diferenciación. Elige una colonia de tamaño mediano marcándola con un rotulador debajo de la parte inferior del plato.
  4. Retire el medio del cultivo de iPSC y añada 500 μL de tampón de disociación iPSC de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) (0,5 mM de EDTA, 0,45 g/L de NaCl en DPBS) al pocillo.
  5. Observe bajo un microscopio los signos de disociación celular cuando tres o cuatro filas de células de los bordes de la colonia comienzan a encogerse, con la aparición de espacio vacío entre las células. Esto suele tardar entre 1 y 3 minutos.
  6. Deseche la solución de EDTA por completo. Desaloje la colonia de iPSC marcada pipeando 1 mL de medio E8 Flex con fuerza y directamente sobre ella. Asegúrese de que la colonia se desprenda completamente en parches celulares que contengan de 20 a 50 células cada uno después de 1 a 3 veces de pipeteo.
  7. Recoja el sobrenadante que contiene parches celulares y agréguelo al primer pocillo de los pocillos recubiertos en la placa de 12 pocillos.
  8. Mezcle el pocillo pipeteando una o dos veces y transfiera 1 mL de las células al segundo pocillo que contiene 1 mL de medio.
  9. Repita el paso 1.8 dos veces para hacer cultivos de iPSC diluidos en serie en un total de cuatro pocillos.
  10. Incubar la placa en una incubadora a 37 °C, 5% de CO2.
  11. Pasadas las 24 h, el día 1, revisa las colonias bajo el microscopio y cuenta el número de colonias recorriendo todos los campos de un pozo de forma continua. Elija un pozo que contenga de 10 a 20 colonias de iPSC.
  12. Reemplace el medio con 1 mL de medio A del kit hematopoyético. Vuelva a colocar la placa en la incubadora durante 48 h.
  13. El día 3, retire 500 μL de medio gastado y agregue 500 μL de medio A fresco.
  14. El día 4, observe bajo el microscopio y note un crecimiento celular significativo y una diferenciación de las colonias de iPSC. Reemplace el medio con 1 mL de medio B.
  15. Controle la diferenciación celular bajo el microscopio y realice el cambio de medio medio con 500 μL de medio B cada dos días. Las células tipo HPC aparecen en los días 6-7.
  16. En el día 10, observe bajo el microscopio células redondas brillantes con la morfología de las HPC normales flotando en el medio o débilmente unidas a la capa inferior única de células planas, con algunos agregados de células sueltas.
    NOTA: Las HPC diferenciadas están listas para su recolección para su caracterización o experimentación adicional.
  17. Recoja todas las HPC diferenciadas pipeteando hacia arriba y hacia abajo tres veces con una punta de pipeta de 1 ml para romper los agregados de células y separar las HPC de la superficie de la placa.
  18. Agregue las células en un tubo de 15 ml y centrifugue las células a 300 x g durante 5 minutos. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en 1 mL de medio B.
  19. Cuente las células y ajuste la concentración a 1 millón de células/mL. En esta etapa, se generan más de 1 millón de HPC. Cuando se comprueba con citometría de flujo, asegúrese de que la pureza sea superior al 85% de las células con CD34+/CD43+. Asegúrese de que no se detecten células muertas significativas (más del 5%).

2. Desarrollo de cuerpos embrioides a partir de iPSCs y HPCs mixtas

  1. El mismo día de la recolección de las HPC, asegúrese de que un cultivo de iPSC también alcance el 80 % de confluencia en un pocillo en una placa de 6 pocillos (o dos pocillos en una placa de 12 pocillos).
  2. Trate un pocillo de la placa de cultivo de micropocillos para la formación de EB con 500 μL de solución de enjuague antiadherente agregándola para minimizar las burbujas.
  3. Girar la placa a 2000 x g durante 5 min en un rotor de cubo oscilante equipado con soportes de placa para eliminar posibles burbujas.
  4. Retire completamente la solución de enjuague pipeteando y lave los pocillos dos veces con 1 mL de DPBS y luego 1 mL de DMEM/F12 sin generar burbujas.
  5. Disocie las iPSC de la placa tratando las células con 1 mL de solución de Accutasa.
  6. Observe bajo el microscopio hasta que las células muestren signos de separación, pero aún estén unidas al fondo. Esto suele ocurrir entre 1 y 3 minutos después del tratamiento con Accutase. No digiera en exceso las iPSC.
  7. Retire completamente la solución de Accutase sin alterar las células y agregue 1 mL de medio DMEM/F12 a los pocillos. Además, disocie las células en células individuales pipeteando hacia arriba y hacia abajo un par de veces con una punta de 1 mL.
  8. Recoja las células en un tubo de 15 mL y llénelo hasta 5 mL con medio DMEM/F12. Girar las celdas a 300 x g durante 5 min.
  9. Retire el sobrenadante pipeteando y vuelva a suspender las células en 1 ml de medio E8 Flex. Cuente las células y ajuste la concentración de células a 1 millón de células por ml en el medio E8 Flex.
  10. Mezcle iPSC con HPC en una proporción de 2:1 añadiendo 1 millón de iPSC (1 mL) y medio millón de HPC (500 μL) juntos. Agregue todas las células mezcladas en el pocillo previamente tratado de la placa de cultivo de micropocillos.
  11. Añada 1 μL de solución madre del inhibidor de rocas Y27632 (1 mM) por 1 mL de medio en el sobrenadante. Agite el plato de lado a lado varias veces para distribuir las células de manera uniforme.
  12. Gire la placa de cultivo de micropocillos a 300 x g durante 5 min en un rotor de cangilón oscilante equipado con soportes para placas. Observe bajo el microscopio para ver si las células se han asentado en los micropocillos. (Figura complementaria 1A).
  13. Sin alterar las células, coloque la placa en una incubadora de células a 37 °C, 5% de CO2 .
  14. El día 2, 48 h después, observe las células bajo el microscopio para detectar la formación de EB. Cuando los EB estén claramente formados, continúe con el siguiente paso (Figura complementaria 1B).
  15. Trate una placa de cultivo celular de 24 pocillos con tampón de enjuague antiadherente (500 μL) durante 15 min para hacer una placa de fijación baja.
  16. Retire el tampón de enjuague por completo y lave los pocillos dos veces con 1 mL de DPBS, luego agregue 1 mL de medio E8 Flex en los pocillos.
  17. Vuelva a suspender los EB en la placa de cultivo de micropocillos pipeteándolos con una punta de pipeta de orificio de 1 ml de ancho varias veces.
  18. Para cada pocillo de las placas de 24 pocillos tratados con baja adherencia, recoja y agregue 100 μL de medio que contenga EB. Esto dará como resultado de 10 a 20 EB por pozo. Agregue el medio E8 Flex al pozo antiguo que contiene los EB sobrantes como respaldo.
  19. Incubar la placa en una incubadora de células deCO2 al 5% de 37 °C durante 48 h.

3. 3D inducción, proliferación y maduración de organoides neuronales

  1. El día 2 después de la formación de EB, descongele las alícuotas de BMM en el hielo durante al menos 30 minutos.
  2. Use una punta preenfriada de 20 μL y agregue 15 μL de gota de BMM helada sabiamente sobre el medio para cubrir los EB. Esto crea una película de BMM a la que los EB se adherirán y crecerán.
  3. Coloque la placa en una incubadora de células de CO2 al 5% a 37 °C.
  4. El día 4, después de la formación de EB, retire 500 μL de medio con cuidado sin descartar EB y repita el recubrimiento BMM siguiendo el paso 3.2.
  5. Inicie inmediatamente la inducción neuronal agregando 500 μL de medio de inducción neuronal PSC sobre las células.
  6. En los días 6 y 8, realice el medio cambio de medio retirando cuidadosamente 500 μL de medio sin tocar las células y agregando 500 μL de medio de inducción neural.
  7. En los días 10, 12 y 14, realice un medio cambio de medio con medio de células madre neurales (NSC): Knockout DMEM/F12 + 1x suplemento Glutamax + 1x suplemento neural + bFGF + EGF.
  8. El día 15, transfiera todo el pocillo de esferas con medio a una nueva placa de 12 pocillos tratada con una solución de enjuague antiadherente como se describió anteriormente. Añadir 500 μL de medio de maduración neuronal (DMEM/F12 + 1x suplemento de N2 + 1x suplemento de B27 + 1x antibióticos-antimicóticos) sobre el cultivo.
  9. Realizar un cambio de medio medio con medio de maduración neuronal cada dos días.
  10. Durante la etapa de maduración, si hay signos de agotamiento de la nutrición, como el cambio de color del medio, mueva el organoide a placas de 6 pocillos, que contienen hasta 3 ml de medio por pocillo.
  11. Opcionalmente, 17 días después de la formación de EB, suplementar el medio de maduración con citocinas (IL-34, M-CSF, TGF-β1, CD200, CX3CL1) durante 6 días para facilitar la maduración microglial.
  12. El día 23, recoja los organoides neuronales resultantes para su caracterización o experimentos adicionales.

4. Aclaramiento e inmunotinción de organoides neuronales 3D

  1. Fijar hasta 10 organoides por inmersión en 1 mL de paraformaldehído (PFA) al 4% a 4 °C durante 24 h.
  2. Transfiera los organoides por pocillo a una placa inferior transparente de 96 pocillos y lave con 200 μL de DPBS 2 veces durante 1 h cada vez con una agitación suave.
  3. Permeabilizar los organoides lavándolos una vez con metanol al 50% en DPBS, al 80% de metanol en agua bidestilada (dd) y al 100% de metanol seco durante 10 minutos cada uno, a 4 °C con una agitación suave.
  4. Lavar los organoides en serie con 20% de DMSO/metanol, 80% de metanol en agua dd, 50% de metanol en DPBS, en 100% de DPBS, luego en DPBS con 0,2% Triton X-100, durante 10 min cada uno a 4 °C con una agitación suave. Haga un esfuerzo por eliminar completamente el tampón residual después de cada lavado.
  5. Incubar en tampón permeable (DPBS con 0,2% de Triton X100, 0,3 M de glicina y 20% de DMSO) con una agitación suave durante 40 min en RT.
  6. Bloquear en tampón de bloqueo (DPBS con 0,2% Triton X100, 6% suero de cabra y 10% DMSO) durante 1 h a 37 °C con una suave agitación en un agitador a 80 rpm.
  7. Incubar con anticuerpos en tampón de dilución de anticuerpos (IBA1 1:100, TREM2 1:100, βIII-tubulina, 1:1000, 100 μL /pocillo en DPBS con 0,2% Tween 20, 100 μg/mL de heparina, 3% de suero de cabra y 5% de DMSO) a 37 °C durante 2 h o en cámara frigorífica con agitación suave a 80 rpm durante 3 días.
  8. Lavar con DPBS con 0,2% Tween 20, 100 μg/mL de heparina 5 veces, 10 min cada una a RT con agitación suave en un agitador a 80 rpm.
  9. Incubar con anticuerpo secundario (Alexa488 anti-ratón de cabra 1:200) a 37 °C durante 1 h, seguido de RT durante la noche con agitación suave en un agitador a 80 rpm.
  10. Para la tinción con contraste nuclear, realice la tinción DAPI junto con la incubación de anticuerpos o en un tampón de lavado.
  11. Lavar los organoides 10 veces en tampón de lavado, 10 min cada vez a 37 °C, agitando suavemente.
  12. Observa bajo un microscopio. Si el fondo sigue siendo alto, sigue lavándolo 5 veces.
  13. Deseche el sobrenadante tanto como sea posible. Añadir 200 μL de solución de aclarado de organoides e incubar durante 5 minutos antes de la observación y tomar imágenes con un microscopio confocal.

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Resultados

Nuestro protocolo sigue un esquema para diferenciar las HPC de las iPSC y luego mezclar las HPC con las iPSC para hacer EB, seguido de inducción, diferenciación y maduración neuronal (Figura 1). La alta calidad de la diferenciación de HPC es fundamental para el éxito de la formación de EB y la posterior diferenciación de organoides. Se utiliza una técnica de cultivo de dilución en serie para producir el número y el tamaño adecuados de colonias de iPSC para in...

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Discusión

Aquí, se presenta un protocolo detallado para hacer organoides neuronales 3D que contienen microglía innata a partir de EB derivadas de iPSC mixtas y HPC diferenciadas por iPSC. Es un enfoque relativamente corto y fácil que involucra solo técnicas y equipos de cultivo celular generalmente disponibles en la mayoría de los laboratorios.

El factor más crítico para el éxito de este protocolo es la calidad de la diferenciación de HPC. Adoptamos el método publicado<...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este estudio cuenta con el apoyo de fondos de investigación interna del NINDS.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Placas de cultivo celular de 12 pocillosCorning #3512
placa de cultivo celular de 24 pocillosSARSTEDT#83.3922
AccutaseThermo A1110501
Aggrewell 400placa Tecnologías de células madre#34411Denominado placa de cultivo de micropocillos 
Alexa Fluor 488 cabra anti-ratón anticuerpoLife techniologiesA110011:400 dilución
Alexa Fluor 594 cabra anti-conejo anti-LifetechniologiesA110121:400 dilución
Allegra X-30R Centrífuga con rotor S6069Beckman Couler
Antiadherencia  Solución de enjuagueStem Cell Technologies#07010
anticuerpo anti-CD34Stem Cell Technologies#60013dilución 1:100
anticuerpo CD43 humanoStem Cell Technologies#60085dilución 1:100
anticuerpo anti-IBA1 rabbbitFujifilm019-197412.5 µ g/mL
anti-TREM2  rata pAbRD Systemsmab172912.5 µ g/mL
Antibiótico-antimicóticoGibco15240-0621x
B27 suplementoLife technologies17504-0441x
bFGFPeprotech100-18B20 ng/mL
CD200NovoproteinC311  Viales CryoTube de 100 ng/mL
Thermo#368632
CX3CL1Peprotech300-31  100 ng/mL
DAPISigmaD95421 µ g/mL
DMEM/F12Life technologies12400-0241x
DMSOSigmaD2650
DPBSGibco#41901361x
E8 Flex kit medioThermoA2858501
EDTAMediatech46-034-Cl 0,5 mM
EGFPeprotechAF-100-1520 ng/mL
EVOS FL Microscopio automáticoMicroscopio de termofluorescencia 
FastStart Universal SYBR Verde PCR master mixRoche#4913850001
GlutamaxGibco#35050079
Suero de cabraSigmaG90234%
IL-34Peprotech200-34  100 ng/mL
ImageXpress Micro ConfocalDispositivos Moleculares Knockout
DMEM/F12Gibco#10829018
M-CSFPeprotech300-25  25 ng/mL
MatrigelCorning#354277Matriz de membrana basal (BMM)
Anti-y beta de ratón; Anticuerpo III-tubulinaPromegaG712Adilución 1:1000
Mr. Frosty containerThermo5100-0001
N2 suplementoLife technologies17502-0481x
ParaformadehídoSigmaP61484%
PSC Medio de inducción neuronalGibcoA1647801
Inhibidor de roca Y27632Stemcell tecnologías#723041 mM stock
RT LTS 1000 ul puntas de pipetaRAININ#30389218  para la transferencia de organoides
STEMdiff Kit de organoides cerebralesStem Cell Technologies#08570
STEMdiff HematopoyéticoKit StemCell Technologies#5310Referido como Kit hematopoyético
StemPro Neural SupplementGibcoA1050801Referido como suplemento neural
TGF-β 1Peprotech100-2150 ng/mL
Kit de purificación de ARN total Plus Norgen#48400
TritonX-100SigmaT92840.10%
Visikol Histo-Starter KitVisikolHSK-1Contiene solución de limpieza de organoides HISTO-M, tampón de lavado
Zeiss LSM 510-META Microscopio confocalZeiss

Referencias

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