Artículo de método

Marcaje de fluorescencia para visualizar proteínas de baja expresión en el pez cebra

1.5K vistas

⸱

DOI:

10.3791/67616

⸱

24 de enero de 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Cellular Stress Biology, School of Life Sciences, Faculty of Medicine and Life Sciences, Xiamen University, 2Technology Center, Shanxi Xinghuacun Fenjiu Distillery Co., Ltd., 3Research Unit of Cellular Stress of CAMS, Cancer Research Center of Xiamen University, Xiang'an Hospital of Xiamen University, School of Medicine, Xiamen University, 4Laboratory Animal Center, Xiamen University

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para marcar proteínas con una etiqueta de proteína de fluorescencia en larvas de pez cebra, un sistema in vivo recientemente desarrollado y modificado especialmente útil para visualizar proteínas de baja abundancia en pez cebra.

Resumen

La tecnología knock-in (KI) mediada por CRISPR/Cas9 permite un marcado más fácil de proteínas fluorescentes en el pez cebra (Danio rerio), un organismo modelo preferido para la obtención de imágenes in vivo debido a su transparencia durante la etapa temprana de desarrollo. Aquí, proporcionamos un protocolo detallado para realizar el gen KI de fluorescencia de alta eficiencia, el cribado rápido de los fundadores de KI y el rastreo de proteínas de baja abundancia en larvas de pez cebra, que sentará una base crítica para posteriores estudios fisiopatológicos en pez cebra. El protocolo actual incluye pasos completos para el diseño de sgRNA para el gen de interés, transcripción in vitro de sgRNA, transcripción in vitro de ARNm Cas9, cribado in vivo de sgRNA para el de mayor eficiencia, diseño y construcción de plásmidos donantes, microinyección en larvas de pez cebra, cribado fundador de KI e imágenes en vivo de pez cebra. Se incluyen y discuten los pasos críticos, los consejos para la solución de problemas, los métodos de control de calidad y las ventajas y aplicaciones de este protocolo. Este protocolo asegura resultados rápidos y precisos a un bajo costo y ha sido validado por múltiples ensayos.

Introducción

Como organismo modelo bien aceptado, el pez cebra (Danio rerio) es ampliamente utilizado en la investigación científica sobre el desarrollo, la regeneración, la tumorigénesis, la infección y la inmunidad, etc. 1,2,3,4,5. El pez cebra es especialmente adecuado para la obtención de imágenes en vivo in vivo cuando se trata con PTU (1-fenil 2-tiourea), un compuesto químico tóxico que inhibe la melanogénesis y hace que las larvas de pez cebra sean transparentes durante un período de tiempo relativamente largo6. También están disponibles cepas de pez cebra transparente modificadas genéticamente, como el casper7 y el crystal8, lo que permite la visualización en vivo y el seguimiento del linaje hasta la edad adulta. Además de estos esfuerzos para superar la pigmentación para una mejor visualización en vivo en peces adultos, nuestra investigación también se centra en el desarrollo de poderosas estrategias de edición de genes para hacer que el etiquetado de proteínas fluorescentes sea más eficiente y menos artificial.

La tecnología de KI basada en la unión de extremos mediada por microhomología CRISPR/Cas9 (MMEJ) ahora se aplica ampliamente en modificaciones genéticas en múltiples organismos, incluido el pez cebra, debido a su eficiencia de KI relativamente alta 9,10,11,12. Para lograr el éxito de la obtención de imágenes in vivo, es necesario abordar dos desafíos. Uno son los indels o cicatrices introducidas por el proceso de recombinación; La otra es que algunos genes diana se expresan endógenamente a un nivel bajo, lo que provoca señales débiles de la etiqueta de fluorescencia coexpresada y el fracaso de la detección in vivo. Con el objetivo de lograr un etiquetado eficiente y preciso de proteínas y minimizar la interferencia de los niveles de expresión génica endógena, un trabajo reciente informó de una estrategia optimizada que combina un método de etiquetado "VH" de amplificación de señal de fluorescencia y un flujo de trabajo de cribado de línea germinal refinado13, que es más adecuado para el marcaje de fluorescencia de genes de baja expresión y más eficiente que los métodos anteriores al optimizar la columna vertebral del donante y combinar la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y las verificaciones de fluorescencia para implementar el cribado de la línea germinal al menor costo de tiempo y esfuerzo. Aquí, presentamos un protocolo detallado paso a paso para el método informado, que incluye los pasos de preparación del embrión y cría del pez cebra, diseño de sgRNA, transcripción in vitro de sgRNA, transcripción in vitro de ARNm Cas9, microinyección de embriones de pez cebra, cribado in vivo de sgRNAs con la mayor eficiencia, diseño y construcción de plásmidos de donante, genotipado de pez cebra KI, cribado de la línea germinal KI e imágenes y fenotipado de pez cebra KI. Este protocolo todo en uno, que proporciona un método de etiquetado de fluorescencia de última generación, sin duda promoverá los estudios con pez cebra en varios campos científicos y beneficiará a los lectores de diferentes antecedentes académicos.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

Toda la cría y los experimentos de pez cebra fueron revisados y aprobados por el Comité de Ética y Manejo de Animales de Laboratorio de la Universidad de Xiamen y estuvieron en estricta conformidad con las buenas prácticas animales según lo definido por el Centro de Animales de Laboratorio de la Universidad de Xiamen. El estudio cumplió con todas las normas éticas relevantes para el uso de animales.

NOTA: Todos los peces cebra adultos y larvales se mantuvieron siguiendo los protocolos estándar a 28,5 °C con un ciclo de luz/oscuridad de 13/11 h en el sistema de acuarios de peces cebra de la Universidad de Xiamen. Los embriones se mantuvieron en el tampón embrionario (Tabla 1) en una incubadora controlada (temperatura, 28 ± 0,5 °C; luz, ciclo de 13 h luz/11 h oscuridad). La alimentación y el monitoreo general de todos los peces cebra se realizaron dos veces al día (9 a.m. y 4 p.m.). La cepa de tipo salvaje (WT) utilizada en esta investigación fue Tübingen (Tü).

1. Elección de genes de interés y diseño del ARN guía

  1. Conocer la información del gen de interés. Busque en la base de datos (https://zfin.org/) y asegúrese de que se conozca el número de variantes genéticas. Decida qué variante manipular y descargue la información del gen objetivo de Ensembl (https://www.ensembl.org/), incluida la secuencia del genoma, la secuencia de ADNc y la secuencia codificante (CDS). Marque exones, intrones, UTR, codones de inicio y codones de parada en las secuencias.
  2. No elija más de 200 pb de CDS aguas arriba del codón de parada (TAA, TAG o TGA) del gen diana como región diana del sgRNA.
    NOTA: Es mejor asegurarse de que esta región no tenga polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) mediante la secuenciación del ADN.
  3. Utilice el sitio web de CRISPRscan (https://www.crisprscan.org/) para diseñar candidatos a sgRNAs dentro de la región diana elegida y predecir la eficiencia de los sgRNAs.
    1. Introduzca la secuencia de ADN en el marco de diseño.
    2. Seleccione la información correspondiente, incluidas las especies, los desajustes máximos en los objetivos externos, la endonucleasa y el promotor. En este caso, elija el pez cebra-Danio rerio, No mismatch, Cas9-NGG y promotor T7 in vitro.
    3. Haga clic en Obtener sgRNAs para obtener algunos sgRNAs. Seleccione de 5 a 7 sgRNAs con una puntuación CRISPRscan alta y una puntuación baja fuera del objetivo para el cribado in vivo .
  4. Diseñe cebadores de PCR que flanqueen los sitios objetivo de sgRNA cuyo producto sea de aproximadamente 500 pb para la posterior amplificación de PCR, prueba de digestión enzimática y secuenciación para verificar la eficiencia de knockout después de la microinyección de sgRNA / Cas9. Seleccione una secuencia de aproximadamente 20 pb en las regiones aguas arriba y aguas abajo y asegúrese de que su contenido de GC sea de aproximadamente el 50% y que el valor de Tm oscile entre 50 y 55 °C.
    NOTA: Diseñe dos cebadores aguas arriba y dos cebadores aguas abajo si es necesario hacer combinaciones.

2. Preparación de sgRNAs

NOTA: La secuencia común del andamio de sgRNA (Figura 1) se ha clonado en un plásmido (Tabla de materiales).

  1. La PCR amplifica la secuencia conjugada promotor T7-sgRNA utilizando cebadores y la mezcla de PCR que se muestra en la Tabla 2 y la Tabla 3, respectivamente. Ejecute el programa PCR de la Tabla 4. Electroforesis en gel (gel de agarosa, 1,2% de agarosa en tampón TAE; Tampón TAE [Tabla 1]; 200 V; unos 5 min) con 2 μL de los productos PCR para asegurarse de que los productos son correctos (el MW es de unos 150 pb).
  2. Purifique los productos de PCR utilizando un kit de purificación (Tabla de materiales) u otros kits disponibles en el mercado siguiendo las instrucciones del fabricante.
    NOTA: A partir de ahora, se deben utilizar reactivos y materiales libres de ARNasa, y los procedimientos deben realizarse con especial precaución para evitar la contaminación por ARNasa (ver Discusión).
    1. Añada el tampón aglutinante a los productos de PCR en una proporción de volumen de 5:1 y mezcle. Aplique la mezcla a la columna colocada en un tubo de recolección de 2 mL. Centrifugar a 17.900 × g durante 1 min a 25 °C. Deseche el flujo y vuelva a colocar la columna en el mismo tubo de recolección.
    2. Añadir 750 μL del tampón de lavado a la columna y centrifugar a 17.900 × g durante 1 min a 25 °C. Deseche el flujo y vuelva a colocar la columna en el mismo tubo de recolección. Centrifugar a 17.900 × g durante 2 min a 25 °C. Coloque la columna en un tubo limpio de 1,5 ml.
    3. Añadir 20 μL de agua libre de nucleasas a la columna, centrifugar a 17.900 × g durante 2 min a 25 °C, para eluir el ADN y medir la concentración con un espectrofotómetro.
  3. Utilice el sistema de producción de ARN T7 en la Tabla de Materiales o kits equivalentes para transcribir in vitro 250 ng del ADN purificado. Se requieren operaciones y condiciones libres de RNasa.
    1. Prepare la reacción en tubos de PCR (libres de RNasa) de acuerdo con la Tabla 3 y mezcle suavemente. Incubar a 37 °C en un baño metálico durante 2 h.
    2. Agregue 0,5 μL de DNasa I (libre de RNasa) y mezcle suavemente. Incubar a 37 °C en un baño metálico durante 15-20 min.
    3. Precipitación de etanol
      1. Agregue agua libre de ARNasa a cada reacción para que el volumen final alcance los 20 μL y transfiera las muestras a tubos de 1,5 mL.
      2. Añadir 50 μL de etanol al 100% (2,5 V, sin RNasa), mezclar bien, poner la mezcla en hielo durante 10 min y centrifugar a 21.000 × g durante 15 min a 4 °C.
      3. Deseche el sobrenadante, lave el pellet con 500 μL de etanol al 75% (libre de RNasa) y centrifugue a 21.000 × g durante 5 min a 4 °C.
      4. Deseche el sobrenadante, seque el pellet a 45 °C en un baño de metal y disuelva con 40 μL de agua libre de RNasa.
        NOTA: Para KI, los sgRNAs deben ser precipitados con LiCl (ver más abajo), pero para KO, no es necesario.
    4. Geles de agarosa (Gel de agarosa: 1,2% de agarosa en tampón TAE; Tampón TAE [Tabla 1]; 200 V; unos 5 min) con 1-2 μL de ARN para estimar la calidad y luego medir la concentración con un espectrofotómetro.
      NOTA: los sgRNAs pueden almacenarse a -20 °Cor -80 °C para su uso posterior.

3. Preparación del ARNm de Cas9

  1. Realice la digestión enzimática del plásmido Cas9 (Tabla de Materiales) durante más de 1,5 h utilizando XbaI de acuerdo con las instrucciones del fabricante (para la mezcla de reacción, consulte la Tabla 3). Prueba por electroforesis en gel (Gel de agarosa: 1,2% de agarosa en tampón TAE; Tampón TAE [Tabla 1]; 200 V; unos 10 min) con 1 μL para comprobar que la digestión es completa.
  2. Purifique los productos de la misma manera que los productos de PCR de sgRNA (pasos 2.2.1-2.2.3). A partir de aquí, se requieren materiales y operaciones libres de RNasa.
  3. Utilice el kit de transcripción T3 (Tabla de materiales) o kits equivalentes para la transcripción in vitro de ARNm Cas9.
    1. Prepare la reacción en tubos de PCR libres de RNasa de acuerdo con la Tabla 3 y mezcle suavemente. Incubar a 37 °C durante más de 2,5 h.
    2. Añadir 1 μL de Turbo DNasa libre de RNasa e incubar a 37 °C durante 15-20 min.
    3. Precipitación de LiCl
      1. Transfiera las muestras a tubos de 1,5 ml, agregue 30 μl de LiCl (1,5 V) y mezcle suavemente.
      2. Ponga la mezcla a -20 °C durante unos 30 minutos y luego centrifugue a 21.000 × g durante 30 minutos a 4 °C.
      3. Deseche el sobrenadante, lave los pellets con 500 μL de etanol al 75% (libre de RNasa) y centrifugue a 21.000 × g durante 5 min a 4 °C.
      4. Deseche el sobrenadante, seque el pellet a 45 °C y disuélvalo en 40 μL de agua libre de RNasa.
  4. Mida la concentración del ARNm de Cas9 utilizando un espectrofotómetro. Geles de agarosa (Gel de agarosa: 1,2% de agarosa en tampón TAE; Tampón TAE [Tabla 1]; 200 V; unos 10 min) con 1-2 μL de ARN para comprobar la concentración y la calidad.
    NOTA: Un OD 260/280 debe estar por encima de 2.0, y la concentración debe ser alrededor o superior a 1000 ng/μL. El ARNm de Cas9 podría almacenarse a -20 °Cor -80 °C para su uso posterior.

4. Preparación para la microinyección

  1. Prepare el pez cebra: La noche antes de la microinyección, coloque un pez cebra hembra sano y dos peces cebra machos sanos en un tanque de apareamiento, usando un divisor para separar a los machos y las hembras para prepararlos para el apareamiento.
  2. Prepare agarosa al 4%, tampón de lisis y tampón embrionario (pH 8.0) (Tabla 1).
  3. Preparar las agujas de vidrio capilar para la microinyección (Tabla de Materiales).
  4. Preparar las placas de microinyección: Vierta 35 mL de la agarosa al 4% derretida en una placa de Petri de 10 cm y coloque suavemente un molde de plástico para crear canales en forma de cuña. Evite las burbujas de aire golpeando suavemente el molde. Después de que se solidifique, agregue un poco de agua destilada doble (ddw) y coloque la placa a 4 ° C para su uso posterior.

5. Prueba de eficiencia de sgRNA a través de microinyección

  1. El día de la microinyección, prepare la mezcla de microinyección como se indica en la tabla 5 en hielo en un entorno libre de ARNasa.
  2. Cargue la solución de microinyección en la aguja utilizando una punta de pipeta sin RNasa (Tabla de materiales). Tenga cuidado de no traer burbujas.
  3. Coloque la aguja cargada en un micromanipulador conectado a un microinyector. Corte la punta de la aguja de inyección debajo del microscopio con las pinzas puntiagudas, pellizcando suavemente la punta de la aguja para romperla. A continuación, ajuste la presión de inyección hasta que la aguja expulse constantemente una gota de 1 nL, que se cuantifica mediante el uso de un micrómetro de etapa y un capilar.
  4. Retire el divisor y deje que los peces se reproduzcan durante unos 6 minutos. Recoja y transfiera los embriones en etapa de 1 célula a una placa de Petri que contenga tampón de embriones.
    1. Examine la salud de los embriones bajo el microscopio óptico y elimine los óvulos no fertilizados o los desechos. Reserve 20 embriones sanos como controles no inyectados en una placa de Petri separada y en una etiqueta.
  5. Transfiera y alinee suavemente los embriones sanos en etapa de 1 célula en las ranuras de la placa de microinyección calentada a temperatura ambiente (RT) con un cepillo pequeño. Retire el exceso de tampón.
  6. Realice todas las operaciones posteriores bajo un microscopio estereoscópico. Use la punta de la aguja para ajustar suavemente la posición del embrión de modo que el palo del animal mire hacia la aguja. Inyecte 1 nL de la solución mezclada en el poste del animal.
  7. Aproximadamente la inyección de 100 embriones es suficiente para un sgRNA. Después de la inyección, enjuague suavemente los embriones en una placa de seis pocillos con tampón para embriones. Coloque la placa en una incubadora a temperatura constante a 28,5 °C. Alrededor de las 10 h después de la fertilización (hpf), examine el desarrollo embrionario bajo un microscopio estereoscópico y retire los embriones muertos.
  8. A 24 hpf, recoja los embriones en tubos de 1,5 ml para el genotipado (3 tubos por sgRNA y 5 embriones por tubo). Deseche el exceso de agua cuidadosamente con una pipeta, añada 100 μL de tampón de lisis que contenga proteinasa K (a una concentración final de 0,5 mg/mL) en cada tubo, e incube a 56 °C durante 1 h y luego a 95 °C durante 15 min.
  9. Añadir 200 μL de etanol (2V), mezclar bien y centrifugar a 19.000 × g durante 10 min a RT.
  10. Deseche el sobrenadante, lave el pellet con 500 μL de etanol al 70% y centrifugue a 19.000 × g durante 3 min en RT.
  11. Deseche el sobrenadante, seque el pellet a RT y disuélvalo con 50 μL de ddw. A continuación, utilice 1 μL de los extractos para preparar la mezcla de reacción para la PCR (Tabla 3) (para los cebadores de PCR, consulte el paso 1.4).
  12. Geles de agarosa (Gel de agarosa: 1,2% de agarosa en tampón TAE; Tampón TAE [Tabla 1]; 200 V; alrededor de 10 min) con 2 μL de los productos de PCR para confirmar que la PCR es exitosa, y luego realizar digestiones enzimáticas (Tabla 3) para determinar la eficiencia de los sgRNAs. Mezcle suavemente la mezcla de digestión enzimática. Incubar a la temperatura indicada por el fabricante.
  13. Geles de agarosa para los productos digeridos (Gel de agarosa: 1,2% de agarosa en tampón TAE; Tampón TAE [Tabla 1]; 200 V; unos 10 min) con los productos de PCR no digeridos como controles para confirmar si se produce la digestión.
    NOTA: El sitio de escisión de Cas9 está a unos 3 pb aguas arriba del PAM, por lo que el sitio de reconocimiento de la enzima de restricción es el mejor para cubrir 6 pb aguas arriba del PAM. Si la eficiencia del sgRNA es alta, el corte y la mala reparación conducirán a indels, por lo que existe una alta posibilidad de que la enzima de restricción ya no pueda reconocer el sitio de corte. Si el sgRNA es ineficiente y el sitio de reconocimiento de la enzima de restricción está intacto, la digestión enzimática puede ocurrir normalmente. A través de la electroforesis en gel de agarosa, se puede distinguir si se ha producido una digestión enzimática.
  14. Si no hay un sitio adecuado de reconocimiento de enzimas de restricción, secuenciar los productos de PCR y analizar la eficiencia del sgRNA por TIDE (https://tide.nki.nl/). Recuerde hacer PCR y también secuenciar el ADN genómico WT como control.
    1. Abra el sitio web y haga clic en Iniciar marea. Introduzca la secuencia guía de sgRNA en el fotograma en Secuencia guía.
    2. Haga clic en Examinar en Cromatograma de muestra de control (.ab1 o .scf) para introducir el resultado de la secuenciación para el control WT y haga clic en Examinar en Cromatograma de muestra de prueba (.ab1 o .scf) para introducir el resultado de la secuenciación de la muestra editada.
    3. Haga clic en Actualizar vista. El sitio web dará un porcentaje de la diferencia entre las dos secuencias. Un porcentaje mayor indica una mayor eficiencia de sgRNA. Un sgRNA con una eficiencia de knockout superior al 80% es adecuado para procedimientos de KI posteriores.

6. Construcción de plásmidos donantes para el marcaje de proteínas fluorescentes

  1. Diseñar secuencias que primero se clonarían en el plásmido y luego se insertarían en el genoma del pez como Figura 2: una secuencia de 25 pb aguas arriba del sitio de escisión de Cas9 predicho se diseña como el brazo de homología izquierdo, y una secuencia de 25 pb aguas abajo del sitio de escisión de Cas9 predicho es el brazo de homología derecho. Introducir CDS entre el sitio diana del sgRNA y el codón de parada en el donante para mantener la integridad del gen endógeno.
    NOTA: El 5' del CDS complementado (elemento 4 en la Figura 2) debe estar mutado como sinónimo para evitar la escisión secundaria del genoma recombinante por el complejo sgRNA/Cas9.
  2. Utilice la clonación independiente de la ligadura (LIC)14 utilizando exonucleasa III (Tabla de Materiales) para la construcción del plásmido donante. Otros métodos, como el ensamblaje de Gibson, también son factibles. En la Figura 2 se ilustran los cebadores de clonación. Los elementos "1", "2", "3" y "4" son transportados por los cebadores:
    1. Cartilla de diseño F1, que se compone de una secuencia superpuesta con el vector, el elemento "1" y una parte del elemento "2".
    2. Imprimación de diseño R2, que se compone de una parte del elemento "1", el elemento "2" y el elemento "3".
    3. Imprimación de diseño F2, que se compone de los elementos "3", "4" y la secuencia 5' del CDS siguiendo el sitio objetivo del sgRNA.
    4. Diseño Primer R1, que está compuesto por la secuencia 3' del CDS del gen y una secuencia superpuesta con el vector.
    5. Use ADNc de pez cebra como plantilla y haga PCR con los cebadores.
      NOTA: La superposición recomendada entre cebadores o entre el cebador y el vector es de 15-20 pb. Estos cebadores son específicos del gen diana, y en la Tabla 2 se da un ejemplo de los cebadores para cx39.9 y cx44.1. Este diseño se aplicó con éxito como se describió anteriormente13. Los mapas detallados de plásmidos se proporcionan en el Archivo Suplementario 1 y en el Archivo Suplementario 2. Las secuencias de ADN y proteínas diseñadas de cx39.9 y cx44.1 se proporcionan en el Archivo Suplementario 3.
    6. Purifique los productos de PCR de la misma manera que los productos de PCR de sgRNA (pasos 2.2.1-2.2.3).
  3. Digiera el vector donante (Figura 3 y Tabla 6) mediante enzimas de restricción adecuadas. En este ejemplo, las enzimas son PciI y Acc65I (Tabla de Materiales). Realice el de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Tabla 3). Purifique el vector donante digerido de la misma manera que los productos de PCR de sgRNA (pasos 2.2.1-2.2.3).
  4. Cuantificar los fragmentos de PCR purificados y el vector donante digerido mediante electroforesis en gel de ADN (gel de ADN: 1,2% de agarosa en tampón TAE; Tampón TAE [Tabla 1]; 200 V; unos 10 min). Prepare la mezcla de reacción para LIC de acuerdo con la Tabla 3.
    NOTA: Todos los tubos y componentes de la reacción deben colocarse en hielo, y la reacción y todas las manipulaciones deben realizarse en hielo. Añada 1 μL de Exo III (20 unidades) a la reacción como último componente y luego pipetee inmediatamente hacia arriba y hacia abajo para mezclar bien todos los componentes. Recuerde incluir una mezcla de reacción sin fragmentos de PCR como control para mostrar el potencial de autorecocido del vector digerido.
  5. Coloque inmediatamente la mezcla de reacción en hielo e incube durante 60 min.
  6. Añadir 1 μL de EDTA 0,5 M (pH 8,0) para detener la reacción, pipetear hacia arriba y hacia abajo para mezclar bien, y luego incubar a 60 °C durante 5 min y luego en hielo durante 5 min.
  7. Transformar células competentes, como la DH5α, utilizando los productos LIC y cultivar las bacterias en placas LB (Tabla de Materiales y Tabla 1) con antibióticos adecuados (Ampicilina en este caso) durante 16 h.
  8. Asegúrese de que haya diferencias de órdenes de magnitud entre el número de colonias en las placas que contienen fragmentos de PCR y las de la placa de control. Elija colonias individuales de las placas LIC para el análisis de digestión enzimática y la secuenciación del ADN.
  9. Extraiga y purifique los plásmidos donantes correctos con un kit de purificación de la misma manera que los productos de PCR de sgRNA (pasos 2.2.1-2.2.3). Asegúrese de que la concentración final sea superior a 300 ng/μL.

7. Microinyección de embriones de pez cebra para el gen KI

  1. Realice todas las manipulaciones de microinyección descritas anteriormente, excepto la preparación de la solución de microinyección de acuerdo con la Tabla 7.

8. Cribado e identificación de progenie marcada con proteínas fluorescentes

  1. Observar la fluorescencia bajo un microscopio estereoscópico de fluorescencia 12-48 h después de la microinyección.
  2. Aplique un método de pantalla recién establecido13. Si se observa una fluorescencia evidente, elija las larvas fluorescentes y críalas. Si solo se observa un rastro de fluorescencia o incluso ninguna fluorescencia, cría todas las larvas inyectadas.
  3. A 1 mes de edad, anestesiar el pez cebra microinyectado con tricaína al 0,02% (Tabla 1). Para cada pez cebra, recoja un pequeño trozo de la aleta caudal en un tubo de PCR marcado y mantenga el pez cebra anestesiado correspondiente en un pocillo de una placa de seis pocillos que contiene agua filtrada esterilizada con UV (pH 7,2) con la misma etiqueta.
  4. Utilice el método de lisis alcalina (tampón de lisis en la Tabla 1)15 para la extracción de ADN genómico, seguido de la PCR de unión 5'. Diseñe el cebador delantero aguas arriba del brazo de homología izquierdo y el cebador inverso en el inserto (Figura 4). El tamaño del producto PCR es de alrededor de 500 pb. Para ver ejemplos de los cebadores, consulte la Tabla 2.
    NOTA: Para el pez cebra fluorescente, esta PCR se utiliza para verificar la precisión del KI, por lo que el producto de PCR se somete a secuenciación. En el caso del pez cebra sin fluorescencia, esta PCR se utiliza para verificar si se produce KI. Elija los peces positivos para PCR y críalos hasta la edad adulta como F0.
  5. Examinar los embriones F1 obtenidos del apareamiento de F0 cribado con WT para detectar patrones de expresión de GFP y genotipados por PCR de unión.
    NOTA: Si la inserción del objetivo se produce en F1 (ya sea perfecto o no), el F0 correspondiente se define como F0 heredable, cuyo producto de PCR se secuencia a continuación. Si la inserción es precisa, el F0 correspondiente se define como el F0 deseado.
  6. Cuando se obtiene el F0 deseado, utilice la progenie para obtener imágenes con el fin de observar y rastrear la proteína objetivo.

9. Procesamiento de imágenes y datos

  1. Determine la etapa de desarrollo que se va a fotografiar. Prepara el pescado con anticipación. Agregue 1-fenil 2-tiourea diluido (PTU; 0.003%, Tabla de Materiales) al pescado para eliminar los pigmentos si es necesario.
    NOTA: La PTU sería menos efectiva si se aplicara después de 24 hpf. En este ejemplo, la PTU se añadió al tampón embrionario antes de las 24 hpf y se mantuvo en el tampón hasta las 48 hpf, cuando las larvas de pez cebra se procesaron para la obtención de imágenes.
  2. Agregue 2 mL de agarosa derretida al 4% (Tabla 1) a un plato de 35 mm y déjelo a un lado para que se solidifique. Transfiera los peces al tampón embrionario que contiene 0,02% de tricaína (Tabla 1).
  3. Diluir 200 μL de agarosa fundida al 4% en 1 mL de ddw. Transfiera el pescado anestesiado a la agarosa diluida con una pipeta de 1 ml cuando la agarosa se esté enfriando. Mezcle suavemente y transfiera la agarosa montada en peces al plato que contiene gel de agarosa solidificado al 4% preparado en el paso 9.2.
  4. Coloque el pez de modo que la parte de interés esté en la parte superior.
  5. Utilice un microscopio de fluorescencia confocal vertical para la obtención de imágenes y el procesamiento de datos siguiendo las instrucciones del fabricante (Tabla de materiales).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

Las uniones gap que consisten en proteínas poliméricas llamadas conexinas son esenciales para el intercambio de metabolitos e iones de bajo peso molecular entre las células en contacto. El método de marcaje de proteínas fluorescentes descrito anteriormente se utilizó para marcar la conexina 39.9 (Figura 5A) y la conexina 44.1 (Figura 5B), respectivamente. El KI correcto se verificó mediante PCR de unión (Figura 6)....

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

Para llevar a cabo este experimento sin problemas y con éxito, se debe prestar más atención a algunos aspectos importantes. La etapa óptima de desarrollo del pez cebra para la inyección debe ser la etapa de una célula. Completar la inyección dentro de esta etapa puede garantizar que todas las células producidas a través de la división posterior contengan los componentes necesarios para el KI, aumentando así la probabilidad de ocurrencia simultánea de KI en todas las células y mejorando l...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

Todos los autores declaran no tener intereses contrapuestos en este artículo.

Agradecimientos

Agradecemos a Lu Zhou (Universidad de Xiamen) por la revisión y edición de este manuscrito. Este trabajo contó con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (subvención 82388201 a J.H.; subvención 31801158 a Y.Z.), el Programa Nacional Clave de Investigación y Desarrollo de China (2020YFA0803500 a J.H.), el Fondo de Innovación CAMS para Ciencias Médicas (CIFMS) (2019-I2M-5-062 a J.H.), el Programa Especial de Desarrollo Central de Ciencia y Tecnología Local de la Provincia de Fujian (2022L3079 a J.H.), y el Programa de Cooperación del Distrito FuXia-Quan Zi-Chuang (3502ZCQXT2022003 a J.H.). Los financiadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, las decisiones de publicación o la preparación de manuscritos.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
1000 y micro; L  puntasCualquier marcaN/APara todas las manipulaciones
Tubos de 1,5 mLCualquier marcaN/APara el almacenamiento y centrifugación de diversas soluciones
Tubos de 1,5 mL (sin RNasa)Cualquier marcaN/APara el almacenamiento y centrifugación de soluciones sin RNasa
10 µ L puntasCualquier marcaN/APara todas las manipulaciones
10 µ Puntas L (sin RNasa)Cualquier marcaN/APara manipulaciones sin RNasa
1000 y micro; L  puntas (sin ARNasa)Cualquier marcaN/APara manipulaciones sin ARNasa
1-fenil 2-tiourea (PTU)SigmaP7629Para inhibir la melanogénesis y mantener las larvas transparentes
200 µ L puntasCualquier marcaN/APara todas las manipulaciones
200 y micro; Puntas L (sin RNasa)Cualquier marcaN/APara manipulaciones sin RNasa
2x Taq Plus Master Mix II (Dye Plus)VazymeP213-03PCR para pruebas de eficiencia de sgRNA
Placas de 35 mmCorning430165Para la obtención
de imágenes Placas de 6 pocillosCualquier marcaN/APara la cría de peces cebra de forma individual y temporal
Acc65INEBR0599SPara digestión enzimática
Ácido acéticoSigma695092Para la preparación de tampones TAE
AgarBiofroxx8211GR500Para placas LB
Ampicilina, sal sódicaSangonA610028Para placas LB
CaCl2SigmaC5080Para la preparación de tampones embrionarios
Tubos capilaresApparatus30-0016Para agujas generadoras para inyección
Tubos capilaresCualquier marcaID (diámetro interior) = 0,1 mmPara cuantificar una gota de 1 nL
CRISPRscanCRISPRscan  http://www.crisprscan.org/Para el diseño de sgRNA
DH5 y alfa;TIANGENCB101Para la transformación
EDTASigmaE6758Para la preparación de tampones de lisis y tampones TAE
EnsemblEnsembl  https://asia.ensembl.org/Danio_rerio/Info/IndexPara encontrar información genética
EtanolHUSHI64-17-5Para purificación y extracción de ADN
Exonucleasa III Takara2170ALIC
Microinyector de gasWarner InstrumentsPLI-100APara microinyección
Sistema de electroforesis en gelWIXWIX-EP3000Para gel electroforesis
GuantesCualquier marcaN/APara todas las manipulaciones
Glucosasgdbio10010518Para placas LB
GlicerolSangonA501745Para placas LB
gRNA-pMD19-TChina Zebrafish Resource Center (CZRC)CZP3plásmido sgRNA que contiene andamio sgRNA
KClSigmaP5405Para embrión Preparación de tampón
Solución de precipitación de cloruro de litioThermofisherAM9480Precipitación de sgRNAs, libre de RNasa Agarosa
bajo punto de fusiónSangonA600015Para la preparación de geles de agarosa al 4%
Sulfato de magnesiosgdbio20025118Para placas LB
Baño de metalCualquier marcaN/APara incubación a temperatura constante
Azul de metilenoSigmaM9140Para la preparación de tampones de embriones
Molde de microinecciónCaseroN/APara generar ranuras para sujetar embriones durante la microinyección
Microcargador, punta para el llenado de Femtotips y otros microcapilares de vidrio, estéril, 0.5 – 20 µ L, 100 mm, gris claro, 192 uds. (2 bastidores y tiempos; 96 piezas.)Eppendorf5242956003Para cargar la solución de microinyección en la aguja de inyección, sin ARNasa
Extractor de micropipetasSutter InstrumentP-97Para la generación de agujas para inyección
MicropipetasEppendorfN/APara todas las manipulaciones
MicroondasCualquier marca N/APara fundición de placa de inyección y geles de agarosa
MinElute PCR Kit de purificación (50)QIAGEN28004Para purificar productos de PCR y productos de digestión, sin RNasa
mMESSAGE mMACHINE T3 Kit de transcripciónInvitrogenAM1348Transcripción in vitro de ARNm Cas9, sin N
2Cualquier marcaN/APara microinyección
NaClSigmaS5886Para la preparación de tampones embrionarios y tampones de lisis
NaHCO3SigmaS5761Para la preparación de tampones embrionarios
NaOHSangonA100173Para la preparación de tampones TAE
Agua libre de nucleasas ThermofisherR0581Manipulaciones relacionadas con ARN, libre de ARNasa
PciINEBR0655Sdigestión enzimática
Cualquier marcaN/AAmplificación
de PCR, tubos de tiras de PCR, Cualquier marcaN/A, Para PCR,
tubos de PCR,FEITONGKANGBLP-200Para PCR
placa de PetriCualquier marca, N/APara la cría de larvas de pez cebra, etc.
Rojo de fenolSigmaP0290Para microinyección, sin RNasa
Soporte para pipetasWarner InstrumentsPLI-PH1Para microinyección
PrimeStar (Premezcla)TakaraDR040APara clonación molecular
Proteinasa KMerck539480Para extracción de ADN genómico
pT3TS (T3:zCas9-UTRglobin)China Zebrafish Resource Center (CZRC)Plantilla de plásmidoCZP11
Centrífuga refrigeradaCualquier marcaN/APara centrifugación relacionada con ARN
EscalaSartoriusBCE124-1CCNPara fundición de placa de inyección y geles de agarosa
TijerasCualquier marcaN/APara cortar colas de peces adultos
SDSSangonA600485Para la preparación
de tampones de lisisCepillos pequeñosCualquier marcaN/APara el movimiento suave de embriones en placas de microinyección
EspectrofotómetroThermofisherNanoDrop 2000Para mediciones de concentración de ADN/ARN
Micrómetro de etapaCualquier marcaDIV (División) = 0,01 mmPara cuantificar una gota de 1 nL
Microscopio de fluorescencia estereoscópicaOlympusSZX16Para la observación de la expresión génica
Microscopio estereoscópicoMoticSMZ-168Para observación y microinyección
T7 RiboMAX Express Sistema de producción de ARN a gran escalaPromegaP1320Transcripción in vitro de sgRNAs, sin RNasa
Incubadora de temperatura controladaCualquier marcaN/APara la incubación de embriones
TIDETIDE https://tide.nki.nl/Para el análisis de la eficiencia del sgRNA 
Metanosulfonato de tricaínaSigmaA5040Para la preparación de soluciones de tricaína
TrisSangonA600194Para la preparación de soluciones de tricaína, tampón de lisis y tampón TAE
TriptonaOXOIDLP0042Para placas LB
PinzasmarcaN/APara cortar agujas de inyección
XbaINEBR0145SPara enzimáticas digestión
Extracto de levaduraOXOIDLP0021Para placas LB Sistema
acuario de pez cebraESENESEN-AW-S1Para la cría de peces adultos
Tanques de apareamiento de pez cebra (con divisor)Cualquier marcaN/APara el apareamiento de los peces
Zeiss LSM 900+Airyscan2ZEISSZeiss LSM900Para la obtención de imágenes confocales de los peces marcados con fluorescencia y análisis de datos
Sitio web de ZFINZFIN http://zfin.org/Para encontrar información sobre genes
Harvard de Para máquina de PCR para , , , , Cas9 Cualquier de

Referencias

  1. Brittijn, S. A., et al. Zebrafish development and regeneration: new tools for biomedical research. Int J Dev Biol. 53 (5-6), 835-850 (2009).
  2. Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. The zebrafish as a model for complex tissue regeneration. Trends Genet. 29 (11), 611-620 (2013).
  3. Haraoka, Y., Miyake, M., Ishitani, T. Zebrafish imaging reveals hidden oncogenic-normal cell communication during primary tumorigenesis. Cell Struct Funct. 48 (1), 113-121 (2023).
  4. Gomes, M. C., Mostowy, S. The case for modeling human infection in zebrafish. Trends Microbiol. 28 (1), 10-18 (2020).
  5. Trede, N. S., Langenau, D. M., Traver, D., Look, A. T., Zon, L. I. The use of zebrafish to understand immunity. Immunity. 20 (4), 367-379 (2004).
  6. Karlsson, J., von Hofsten, J., Olsson, P. E. Generating transparent zebrafish: a refined method to improve detection of gene expression during embryonic development. Mar Biotechnol (NY). 3 (6), 522-527 (2001).
  7. White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
  8. Antinucci, P., Hindges, R. A crystal-clear zebrafish for in vivo imaging. Sci Rep. 6, 29490(2016).
  9. He, M. D., et al. Efficient ligase 3-dependent microhomology-mediated end joining repair of DNA double-strand breaks in zebrafish embryos. Mutat Res. 780, 86-96 (2015).
  10. Hisano, Y., et al. Precise in-frame integration of exogenous DNA mediated by CRISPR/Cas9 system in zebrafish. Sci Rep. 5, 8841(2015).
  11. Luo, J. J., et al. CRISPR/Cas9-based genome engineering of zebrafish using a seamless integration strategy. FASEB J. 32 (9), 5132-5142 (2018).
  12. Wierson, W. A., et al. Efficient targeted integration directed by short homology in zebrafish and mammalian cells. Elife. 9, e53968(2020).
  13. Liu, J., et al. Optimal tagging strategies for illuminating expression profiles of genes with different abundance in zebrafish. Commun Biol. 6 (1), 1300(2023).
  14. Li, C., Evans, R. M. Ligation independent cloning irrespective of restriction site compatibility. Nucleic Acids Res. 25 (20), 4165-4166 (1997).
  15. Yu, C., Zhang, Y., Yao, S., Wei, Y. A PCR based protocol for detecting indel mutations induced by TALENs and CRISPR/Cas9 in zebrafish. PLoS One. 9 (6), e98282(2014).
  16. Hirata, H., et al. Connexin 39.9 protein is necessary for coordinated activation of slow-twitch muscle and normal behavior in zebrafish. J Biol Chem. 287 (2), 1080-1089 (2012).
  17. Cason, N., White, T. W., Cheng, S., Goodenough, D. A., Valdimarsson, G. Molecular cloning, expression analysis, and functional characterization of connexin44.1: a zebrafish lens gap junction protein. Dev Dyn. 221 (2), 238-247 (2001).
  18. Urushibata, H., et al. Control of developmental speed in zebrafish embryos using different incubation temperatures. Zebrafish. 18 (5), 316-325 (2021).
  19. Yu, D., et al. Cyclic digestion and ligation-mediated PCR used for flanking sequence walking. Sci Rep. 10 (1), 3434(2020).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este artículo de JoVE

Solicitar permiso

Etiquetas

Imagenolog a de pez cebrainserci n por CRISPRmarcado g nicomicroinyecci n en pez cebradise o de sgRNAconstrucci n de pl smidos donantesimagenolog a en vivo de pez cebrarastreo de prote nas

Artículos relacionados