Establecimiento y comparación de métodos de detección de actividad de T6SS basados en fluorescencia en Acinetobacter baumannii

Summary

En este trabajo se propone un método de detección cuantitativo basado en el marcaje fluorescente (especialmente luciferasa) para evaluar de forma eficiente y precisa la actividad de la T6SS bacteriana, que es adecuado para el análisis de alto rendimiento de cepas clínicas.

Abstract

El Sistema de Secreción Tipo VI (T6SS) es un mecanismo crucial que media las interacciones intercelulares en bacterias Gram-negativas, particularmente en especies patógenas como Acinetobacter baumannii. Estudios previos han demostrado que el plásmido grande pAB3 en la cepa ATCC 17978 de A. baumannii codifica una proteína similar a TetR que inhibe la expresión de los genes T6SS centrales. Por el contrario, la cepa WT^R- , que carece de pAB3, puede expresar y secretar de manera estable la proteína efectora T6SS Hcp y exhibe la capacidad de matar E. coli. El gen tssM , uno de los genes centrales de T6SS, es esencial para su actividad; su eliminación conduce directamente a la inactivación de T6SS. Sin embargo, los métodos tradicionales de detección de actividad T6SS, como los ensayos de eliminación, adolecen de un bajo rendimiento y una sensibilidad insuficiente. Para abordar estas limitaciones, hemos desarrollado métodos de detección cuantitativa basados en el marcaje fluorescente.

Para mejorar la detección de la actividad de T6SS, desarrollamos tres métodos de marcaje fluorescente: (1) Un método de detección cuantitativo basado en el marcaje con luciferasa, que se caracteriza por su alta especificidad, sensibilidad y reproducibilidad, lo que lo hace adecuado para el análisis de alto rendimiento; (2) Un método de detección basado en el marcaje de proteínas fluorescentes verdes (GFP), que, a pesar de ser susceptible a las interferencias ambientales, ofrece la ventaja de un alto rendimiento; (3) Detección por citometría de flujo, que puede evaluar cuantitativamente la viabilidad bacteriana pero es operativamente compleja y costosa. Después de una comparación exhaustiva, el método de etiquetado basado en luciferasa demostró ser el más preciso, sensible y fácil de usar. Cuando se aplicó a 20 aislados clínicos de A. baumannii, se confirmó que este método evaluó de manera rápida y precisa la actividad de T6SS.

Introduction

El sistema de secreción tipo VI (T6SS) es un importante sistema de secreción de proteínas en bacterias gramnegativas, ampliamente involucrado en la competencia bacteriana, el antagonismo contra los huéspedes eucariotas y la regulación de las respuestas inmunitarias del huésped ^1,2. Al inyectar proteínas efectoras tóxicas en las bacterias vecinas o células eucariotas, T6SS ayuda a las bacterias a mantener una ventaja competitiva en entornos complejos. En los últimos años, el importante papel de T6SS en la adaptabilidad bacteriana, la patogenicidad y las interacciones microbianas lo ha convertido en un foco de investigación, especialmente en patógenos multirresistentes, donde sus funciones proporcionan objetivos potenciales para el desarrollo de nuevas estrategias antibacterianas ^3,4,5.

Acinetobacter baumannii (Ab) es un patógeno oportunista gramnegativo ampliamente distribuido en entornos hospitalarios. Debido a su alta resistencia a los medicamentos y su fuerte adaptabilidad, se ha convertido en un importante patógeno nosocomial a nivel mundial ^6,7,8. La supervivencia de A. baumannii en ambientes microbianos complejos depende de múltiples sistemas de secreción, entre los cuales T6SS juega un papel clave en su competencia con otros microbios e interacciones con el huésped. Con su grupo de genes T6SS altamente conservado y funciones bien definidas, A. baumannii se ha convertido en un modelo ideal para estudiar los mecanismos de T6SS. Además, la estructura única del T6SS en A. baumannii proporciona una perspectiva distintiva para revelar aún más la diversidad y las funciones del T6SS.

El grupo de genes T6SS de A. baumannii contiene 12 genes de proteínas centrales (como tssA-tssM, que carece de tssJ) y varios genes con funciones desconocidas (como tagX, tagN, tagF, etc.)^2,9,10. Entre ellas, la proteína corregulada por hemolisina (Hcp) es un componente importante de la T6SS, y su secreción se considera un sello distintivo de la T6SS funcional. Los estudios han demostrado que el plásmido grande pAB3 en A. baumannii inhibe la expresión de T6SS mediante la codificación de una proteína reguladora similar a TetR. Por el contrario, las cepas que han perdido pAB3 (como WT^R-) pueden expresar y secretar Hcp de manera estable, exhibiendo una actividad significativa de T6SS¹¹. El gen tssM es uno de los genes centrales de T6SS, y su deleción conduce directamente a la inactivación de T6SS.

Sin embargo, los métodos tradicionales de detección de actividad de T6SS (como los ensayos de eliminación) tienen limitaciones como bajo rendimiento, poca reproducibilidad y sensibilidad insuficiente, que restringen gravemente el estudio en profundidad y la aplicación generalizada de T6SS⁵. Por lo tanto, el desarrollo de métodos de detección de actividad T6SS eficientes y precisos se ha convertido en una necesidad urgente en la investigación actual. Este estudio tiene como objetivo establecer y comparar métodos de detección de actividad de T6SS basados en el marcaje fluorescente para superar las deficiencias de los métodos tradicionales. A través de la tecnología de etiquetado fluorescente, hemos logrado un monitoreo cuantitativo en tiempo real de la actividad de T6SS, proporcionando una herramienta más precisa y confiable para el estudio de las interacciones bacterianas. Este estudio ha validado la eficacia de los métodos de marcaje con fluorescencia y, al comparar las ventajas y desventajas de diferentes estrategias de marcaje con fluorescencia, ha proporcionado nuevas perspectivas y apoyo metodológico para futuras investigaciones. No solo ofrece nuevos medios técnicos para la investigación de T6SS, sino que también sienta las bases científicas para comprender los complejos mecanismos de las interacciones bacterianas y desarrollar nuevas estrategias terapéuticas antibacterianas.

Protocol

1. Fuentes de cepas y plásmidos

1. Utilice la cepa estándar de A. baumannii ATCC 17978, E. coli (pZY01) y la cepa clínica de A. baumannii aislada del Departamento de Medicina de Laboratorio del Primer Hospital de la Universidad de Jilin.
2. Utilice el plásmido pZY01-GFP (portador de un gen de resistencia a la kanamicina, capaz de expresarse de manera estable en A. baumannii), que fue modificado y conservado en el laboratorio, y el plásmido pGEN-luxCDABE comprado comercialmente (que lleva un gen de resistencia a la ampicilina).
3. Cultivo de A. baumannii y E. coli en un medio Luria-Bertani (LB) o en un medio mínimo que contenga: 50 mM de tampón de fosfato potásico (pH 7,4), 15 mM (NH₄)₂SO₄, 2 mM de MgSO₄, 0,2% (p/v) de succinato de sodio como única fuente de carbono y 0,01% (p/v) de extracto de levadura¹². Añadir antibióticos a las siguientes concentraciones cuando sea necesario: E. coli: ampicilina (100 μg/mL) y kanamicina (50 μg/mL); A. baumannii: estreptomicina (100 μg/mL).
   NOTA: E. coli (pZY01) y E. coli (pZY01-GFP) expresan resistencia a la kanamicina. La E. coli (pZY01) no tiene un marcador fluorescente, por lo que se puede denominar E. coli en el siguiente texto.

2. Preparación de cepas bacterianas antes del experimento

1. Recupere las cepas bacterianas del congelador a -80 °C 2 días antes del experimento. Inocular las cepas bacterianas en placas de agar LB que contengan los antibióticos correspondientes. Incubar las placas durante la noche a 37 °C.
   NOTA: Asegúrese de que todas las células retengan los plásmidos al comienzo del experimento.
2. Elija dos colonias individuales independientes de cada cepa bacteriana 1 día antes del experimento. Inocular cada colonia por separado en dos tubos individuales que contengan 5 mL de medio líquido LB. Incubar los cultivos durante la noche a 37 °C con agitación a 200 rpm. Utilice estos cultivos para experimentos posteriores.
   NOTA: Optimice el tiempo de incubación en función de la tasa de crecimiento bacteriano para garantizar que se obtenga una cantidad adecuada de biomasa bacteriana.

3. Preparación de cepas de E. coli (GFP)/ E. coli (luciferasa)

1. Transformación
   1. Añadir 50 ng de ADN plasmídico (pZY01-GFP o pGEN-luxCDABE, cuantificado mediante NanoDrop en A260/A280) en 100 μL de células competentes para E. coli DH5α, respectivamente, y mezclar suavemente.
   2. Incubar en hielo durante 30 min, choque térmico a 42 °C durante 60 s y colocar inmediatamente en hielo durante 30 s.
   3. Añadir 700 μL de caldo LB sin antibióticos e incubar a 37 °C agitando a 180 rpm durante 2 h.
2. Enchapado y cultivo
   1. Centrifugar a 420 × g durante 2 min, desechar el sobrenadante y volver a suspender el pellet celular en 100 μL de caldo LB sin antibióticos.
   2. Extienda el producto de transformación pZY01 (GFP) en placas de agar LB que contengan 50 μg/mL de kanamicina.
   3. Extienda el producto de transformación pGEN-luxCDABE en placas de agar LB que contengan 100 μg/mL de ampicilina. Incubar a 37 °C durante la noche.
3. Verificación de clones positivos
   1. Elija colonias individuales y extraiga el ADN como plantillas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) al día siguiente. Realizar la amplificación por PCR y verificar mediante electroforesis en gel de agarosa.
   2. Confirme las cepas positivas y etiquételas como E. coli (GFP) y E. coli (luciferasa).
      NOTA: Asegúrese de que la calidad de las células competentes sea alta para una transformación eficiente. Evite el exceso de líquido bacteriano durante el enchapado para evitar interferencias con el aislamiento de una sola colonia.

4. Western blot

1. Preparación de la muestra
   1. Recoja los cultivos bacterianos y centrifugue (1500 × g, 10 min, 4 °C) para separar el pellet celular y el sobrenadante.
   2. Agregue una cantidad adecuada de tampón de carga tanto al pellet de celda como al sobrenadante. Hervir a 100 °C en un baño de metal durante 10 min. Centrifugar (1500 g, 10 min, 4 °C) y recoger los sobrenadantes como muestras de proteínas.
   3. Mida la concentración de proteínas utilizando el ácido bicinconínico (BCA) o el método de Bradford y ajústelo a la misma concentración.
2. Electroforesis en gel de dodecil sulfato de sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE)
   1. Prepare geles SDS-PAGE de concentraciones apropiadas (por ejemplo, 12% de gel separador, 5% de gel apilante)¹³.
   2. Cargue 20 μg de muestras de proteínas en los pocillos de gel junto con un marcador de proteínas previamente teñido de 1-2 μL. Realice la electroforesis a 100-120 V hasta que el indicador de azul de bromofenol llegue al fondo del gel.
      NOTA: Tampón de funcionamiento: Tris 25 mM, glicina 192 mM, SDS 0,1% (p/v), agua destilada a 1 L.
3. Transferencia (Western Blotting)
   1. Retire el gel de las placas de vidrio y sumérjalo en el tampón de transferencia. Prepare una membrana de difluoruro de polivinilideno (PVDF) o nitrocelulosa (NC), active la membrana de PVDF con metanol y luego sumérjala en tampón de transferencia.
      NOTA: Tampón de transferencia: 25 mM Tris, 192 mM de glicina, 20% de metanol
   2. Ensamble el aparato de transferencia en una estructura de "sándwich" (papel de filtro-gel-membrana-papel de filtro). Transfiera a 100 V durante 60-90 min (ajuste el tiempo según el peso molecular de la proteína; Las proteínas de la célula huésped (HCP) tienen un peso molecular de aproximadamente 17 kDa).
      NOTA: Coloque el tanque de transferencia en agua helada y agregue bolsas de hielo para mantener una temperatura baja. Si el tiempo de transferencia es largo, reemplace las bolsas de hielo a mitad de camino.
4. Bloqueante
   1. Después de la transferencia, coloque la membrana en una solución bloqueadora de leche descremada al 5%. Bloquear a temperatura ambiente (RT) en un agitador durante 1 h o toda la noche a 4 °C.
5. Incubación primaria de anticuerpos
   1. Lave la membrana tres veces con solución salina tamponada con Tris (TBS) que contiene un 0,1% de tampón Tween 20 (TBST), 5 min cada vez. Incubar la membrana con anticuerpos primarios diluidos (anticuerpo anti-Hcp de ratón, dilución 1:1000; anticuerpo anti-isocitrato deshidrogenasa (ICDH) de ratón, dilución 1:1000) a 4 °C durante la noche o RT durante 2 h.
6. Incubación secundaria de anticuerpos
   1. Lave la membrana con tampón TBST 3 veces, 5 min cada una. Incubar la membrana con anticuerpo secundario diluido (IgG antiratón conjugada con peroxidasa de rábano picante [HRP], dilución 1:3000) a RT durante 2 h.
7. Detección
   1. Lave la membrana con tampón TBST 3 veces, 5 min cada una. Prepare el sustrato quimioluminiscente ECL y aplíquelo uniformemente a la membrana.
   2. Detecte señales utilizando un sistema de imágenes de quimioluminiscencia y capture imágenes (la proteína HCP tiene un peso molecular de aproximadamente 17 kDa, ICDH es una enzima metabólica citoplasmática con un peso molecular esperado de aproximadamente 45 kDa en A. baumannii).
      NOTA: ICDH es un marcador de control de calidad importante que solo se puede detectar en la fracción de gránulos celulares (que contiene bacterias intactas) y no en la fracción sobrenadante (que contiene proteínas secretadas), lo que demuestra que no se produjo lisis celular durante la preparación de la muestra. La secreción de Hcp (17 kDa) solo debe ser visible en los sobrenadantes de las cepas activas en T6SS.

5. Preparación de placas de 96 pocillos con medio agar LB

1. Agregue rápidamente medio de agar LB libre de antibióticos esterilizado en autoclave, precalentado, en una placa estéril de 96 pocillos, 50 μL por pocillo. Deje que la placa se asiente en RT durante al menos 1 h para garantizar la solidificación completa del medio.
2. Utilice placas de paredes negras con un fondo transparente para detectar la fluorescencia de GFP.
3. Utilice placas de 96 pocillos a prueba de luz para detectar la fluorescencia de luciferasa a fin de evitar la interferencia de fluorescencia entre pocillos.
   NOTA: Evite generar burbujas al agregar el medio para garantizar un espesor uniforme del gel, lo que promueve un contacto y crecimiento bacteriano óptimos.

6. Ensayo de matanza de A. baumannii

1. Ensayo de matanza estándar
   1. Cultivo de cepas mutantes WT^R- y ΔtssM durante la noche a 37 °C con agitación en medio LB suplementado con 100 μg/mL de estreptomicina, cultivo de E. coli por separado en medio LB que contiene 50 μg/mL de kanamicina en condiciones idénticas.
   2. Lave los cultivos bacterianos dos veces con PBS estéril y vuelva a suspenderlos en un medio LB fresco y libre de antibióticos. Ajuste el OD₆₀₀ a 1.0 para la estandarización.
   3. Mezcle las cepas mutantes WT^R- y ΔtssM con E. coli en una proporción de 1:1.
   4. Colocar 10 μL de la suspensión bacteriana mezclada en placas de agar LB sin antibióticos e incubar a 37 °C durante 6 h.
   5. Raspe las manchas bacterianas y vuelva a suspenderlas en 1 mL de PBS. Realice cinco diluciones en serie de 10 veces.
   6. Coloque 10 μL de las suspensiones bacterianas diluidas en placas LB que contengan kanamicina e incube durante la noche a 37 °C.
   7. Analice la actividad antibacteriana dependiente de T6SS de las cepas mutantes WT,^R- y ΔtssM mediante el recuento de colonias.
      NOTA: Asegúrese de mezclar bien las suspensiones bacterianas para evitar errores experimentales. Realice al menos tres réplicas independientes para cada muestra a fin de garantizar la fiabilidad de los datos.
2. Detección cuantitativa de la actividad de T6SS mediante marcaje con luciferasa
   1. Estandarizar el OD₆₀₀ de E. coli (luciferasa), mutantes WT^R-, ΔtssM y otras cepas (por ejemplo, ATCC 17978, E. coli, Ab#40, Ab#170, Ab#180) a 1.0. Agregue 5 μL de suspensión bacteriana a una placa de 96 pocillos que contenga agar LB sin antibióticos. Después de secar al aire en la oscuridad, mida la bioluminiscencia basada en luciferasa para verificar la especificidad de luminiscencia de E. coli (luciferasa).
   2. Realizar una dilución en serie de 5 veces de E. coli (luciferasa). Coloque 10 μL de la suspensión bacteriana diluida en una placa de 96 pocillos con agar LB y una placa vacía de 96 pocillos (ambas a prueba de luz). Mida la bioluminiscencia basada en luciferasa para evaluar la sensibilidad del método de detección basado en luciferasa y confirmar si el agar LB interfiere con la señal de luminiscencia.
   3. Mezcle E. coli (luciferasa) con mutantes WT^R-, ΔtssM y 20 cepas clínicas (OD₆₀₀ estandarizado a 1.0) en una proporción de 1:1. Diluya 10 veces, agregue 5 μL a una placa de 96 pocillos y configure tres réplicas técnicas.
   4. Después de secar al aire en la oscuridad, mida la bioluminiscencia. Incubar a 37 °C en la oscuridad durante 4-6 h, luego medir la bioluminiscencia nuevamente (longitud de onda de emisión: 562 nm).
   5. Evaluar cuantitativamente la actividad antibacteriana dependiente de T6SS comparando los valores de bioluminiscencia antes y después del cocultivo.
      NOTA: Asegúrese de mezclar bien las suspensiones bacterianas para evitar errores experimentales. Realice al menos tres réplicas independientes para cada muestra a fin de garantizar la fiabilidad de los datos. Utilice la prueba t de Student para el análisis estadístico.
3. Detección de la actividad de T6SS mediante el etiquetado GFP
   1. Siga el mismo procedimiento que el experimento de marcaje de luciferasa (longitud de onda de excitación: 480 nm, longitud de onda de emisión: 509 nm).
   2. Mezcle E. coli (GFP) con mutantes WT^R- y ΔtssM (OD₆₀₀ estandarizado a 1.0) en una proporción de 1:1. Coloque 10 μL en placas de agar LB sin antibióticos. Después del secado al aire en RT, capture imágenes utilizando el canal de fluorescencia GFP (programa Alex488, excitación: 488 nm, emisión: 509 nm) de un sistema de imágenes multifuncional.
   3. Incubar a 37 °C en la oscuridad durante 4-6 h y volver a capturar imágenes. Evaluar la actividad de T6SS en función de los cambios en la intensidad de fluorescencia de las manchas bacterianas.
      NOTA: Realice todos los pasos en la oscuridad para evitar interferencias con las señales de fluorescencia. Asegure una mezcla completa de las suspensiones bacterianas para evitar errores experimentales. Realice al menos tres réplicas independientes para cada muestra a fin de garantizar la fiabilidad de los datos.
4. Detección de citometría de flujo
   1. Mezcle los mutantes WT^R- con E. coli (GFP) y ΔtssM con E. coli (GFP) en una proporción de 1:1. Tome una cantidad adecuada de la suspensión bacteriana mezclada y dilúyala hasta una concentración adecuada (normalmente OD₆₀₀ de 0,1-0,5) utilizando PBS estéril o tampón 1×.
      NOTA: El tampón 1× se refiere al tampón de tinción por citometría de flujo (1×), los ingredientes incluyen: 1× PBS (137 mM de NaCl, 2,7 mM de KCl, 10 mM de Na₂HPO₄, 1,8 mM de KH₂PO₄, pH 7,4), complementado con: 2-5% (v/v) de FBS inactivado por calor (o 1% de BSA como alternativa), 2 mM de EDTA.
   2. Centrifugar la suspensión bacteriana mixta diluida a 300 x g durante 2 min y desechar el sobrenadante. Vuelva a suspender el pellet en 1 ml de PBS estéril o 1× tampón y mezcle suavemente. Filtre la solución resuspendida a través de un filtro de celdas de 35 μm para eliminar los agregados y garantizar una suspensión de una sola celda.
   3. Encienda el citómetro de flujo, precaliente el láser y calibre el instrumento.
      1. Ajuste los parámetros de detección: utilice un láser de 488 nm para excitar la GFP. Canal de detección: FL1 (normalmente un filtro de 530/30 nm para la detección de fluorescencia GFP). Establezca los parámetros de dispersión directa (FSC) y dispersión lateral (SSC) para distinguir las células bacterianas.
      2. Utilice E. coli no marcada como control negativo, ajuste el voltaje y la ganancia, y asegúrese de que la población negativa de GFP esté en la línea de base de la señal de fluorescencia.
   4. Mezcle suavemente la muestra filtrada y transfiera 100 μL a un tubo de citometría de flujo.
      1. Analice las muestras utilizando los siguientes ajustes del instrumento: Establezca el umbral FSC-H en 19.000 para excluir los residuos, con valores de ganancia de 100 (FSC), 110 (SSC) y 80 (FITC).
      2. En el caso de la compuerta, se excluyen inicialmente los desechos y las señales no objetivo en el diagrama de dispersión FSC-A frente a SSC-A, seguido de un análisis de población en el canal FITC. Adquirir un mínimo de 10.000 eventos de la población objetivo (definida por las características FSC/SSC) para cada muestra.
   5. Analice los datos utilizando software de citometría de flujo (por ejemplo, FlowJo, BD FACSDiva).
      1. Trace diagramas de dispersión FSC vs. SSC para controlar la población bacteriana objetivo. Traza histogramas de fluorescencia FL1 para distinguir las poblaciones positivas y negativas para GFP.
      2. Calcule el porcentaje de células GFP positivas y la intensidad media de fluorescencia (MFI).
   6. Centrifugar el resto de la suspensión bacteriana mezclada a 300 g durante 2 min y desechar el sobrenadante. Vuelva a suspender el pellet en 10 μL de agua estéril y colóquelo en placas de agar LB sin antibióticos.
   7. Incubar a 37 °C en la oscuridad durante 5 h, luego raspar las manchas bacterianas y volver a suspenderlas en 500 μL de 1× PBS. Tome 100 μL de la solución resuspendida, diluya adecuadamente y realice la detección por citometría de flujo, repitiendo los pasos 6.4.4-6.4.5.
   8. Comparar el porcentaje de células GFP positivas y la intensidad de fluorescencia antes y después del cocultivo. Evaluar el efecto letal de los mutantes WT^R- y ΔtssM en E. coli (GFP).
      NOTA: Asegúrese de que la suspensión sea de una sola célula para evitar que la agregación de células afecte a los resultados de la detección. Calibre el instrumento antes de la detección para garantizar la precisión y la reproducibilidad de las señales de fluorescencia. Evite exponer las muestras a una luz intensa durante el experimento para evitar el apagado de la fluorescencia de GFP. Realice al menos tres réplicas para cada muestra a fin de garantizar la fiabilidad de los datos.

Results

Los métodos tradicionales para detectar la actividad de T6SS suelen consistir en el cultivo conjunto de cepas de depredadores y objetivos en placas de agar LB sin antibióticos durante 5 h, seguido de un raspado de las manchas bacterianas, una resuspensión de las mismas y la realización de diluciones en serie. A continuación, la suspensión bacteriana diluida se coloca en placas de agar selectivas. Al contar las colonias de la cepa objetivo en las placas al día siguiente, se puede evaluar cualitativamente la actividad de T...

Discussion

El sistema de secreción de tipo VI (T6SS) es una compleja maquinaria multiproteica cuyas funciones se realizan principalmente a través de la secreción de proteínas efectoras. Estas proteínas efectoras median la competencia interbacteriana matando o inhibiendo otras especies bacterianas, proporcionando así a la bacteria huésped una ventaja competitiva en las comunidades microbianas¹⁵. Más allá de su papel en la competencia, los estudios han demostrado que T6SS está...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10%, 15% SDS-PAGE Kit de Preparación de Gel	Epizyme	PG112-20
° C Congelador	Haier	HYCD-290
37 ° C Incubadora	Bluepard 181254254
4 ° C Frigorífico	Haier	HYC390-80
° C Congelador		Haier DW-86L726G(726L)
Placa de 96 pocillos	JET	TCP010096
Agar	Biofrox	8211KG001
Persulfato de amonio (APS)	Thermo	7727-54-0
Gabinete de seguridad biológica	ESCO	AC2-4S1
Balanza electrónica	Sartorius AG	BSA124S-CW
Aparato de electroforesis	BIO-RAD	POWER
máquina de hielo en escamas	GRANT	XB70
Citómetro de flujo	BECKMAN COULTER	AW38143
tampón de tinción por citometría de flujo Sistema de	Proteintech	PF00018
	BIO-RAD	Gel Doc 2000
Glycine	Zike	ZK-L2577
Centrífuga de alta velocidad	Eppendorf	5405IN106358
HRP conjugado con HRP Anticuerpo secundario Proteintech		SA00001-2
LB Caldo	Solarbio	L8291
Centrífuga de alta velocidad y baja temperatura	Thermo	17R
Metanol	Thermo	R40121
Micro UV-Vis Espectrofotómetro	Thermo	Nanodrop one
Microcentrífuga	allsheng	Mini-6k
Lector de microplacas	Bio-Tek	H1M
NuPAGE LDS Tampón de muestra	Thermo	NP0007
Solución tampón de fosfato (PBS)	Zike	ZK-L1649
Precision Plus Protein Dual Color Standards	Bio-Rad	1610374
SDS Tampón de carga de muestras	Beyotime	poo15L
Leche desnatada en polvo	Thermo	LP0033B
sulfato de dodecilo de sodio (SDS)	Zike	zk6885
Baño de agua termostático	JingHong	DK-420S
aparato	de transferencia Bio-Rad	PowerPac HC
Tris(hidroximetil)aminometano (Tris)	Zike	ZK-L2557
aparato de electroforesis vertical	Bio-Rad	Mii-PROTEAN Tetra