Establecimiento y comparación de métodos de detección de actividad de T6SS basados en fluorescencia en Acinetobacter baumannii

Wenjing Yang; Jing Jie; Chunxiuli Li; Dong Chen; Shuang Zhao; Sanwei Gu; Jiancheng Xu; Lei Song

doi:10.3791/67772

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Artículo de método

Establecimiento y comparación de métodos de detección de actividad de T6SS basados en fluorescencia en Acinetobacter baumannii

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DOI:

10.3791/67772

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20 de junio de 2025

Wenjing Yang¹ , Jing Jie² , Chunxiuli Li² , Dong Chen² , Shuang Zhao² , Sanwei Gu^*² , Jiancheng Xu^*¹ , Lei Song^*²

¹Clinical Laboratory, Center for Infectious Diseases and Pathogen Biology, The First Hospital of Jilin University, ²Department of Respiratory Medicine, Center for Infectious Diseases and Pathogen Biology, The First Hospital of Jilin University

^* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

En este trabajo se propone un método de detección cuantitativo basado en el marcaje fluorescente (especialmente luciferasa) para evaluar de forma eficiente y precisa la actividad de la T6SS bacteriana, que es adecuado para el análisis de alto rendimiento de cepas clínicas.

Resumen

El Sistema de Secreción Tipo VI (T6SS) es un mecanismo crucial que media las interacciones intercelulares en bacterias Gram-negativas, particularmente en especies patógenas como Acinetobacter baumannii. Estudios previos han demostrado que el plásmido grande pAB3 en la cepa ATCC 17978 de A. baumannii codifica una proteína similar a TetR que inhibe la expresión de los genes T6SS centrales. Por el contrario, la cepa WT^R- , que carece de pAB3, puede expresar y secretar de manera estable la proteína efectora T6SS Hcp y exhibe la capacidad de matar E. coli. El gen tssM , uno de los genes centrales de T6SS, es esencial para su actividad; su eliminación conduce directamente a la inactivación de T6SS. Sin embargo, los métodos tradicionales de detección de actividad T6SS, como los ensayos de eliminación, adolecen de un bajo rendimiento y una sensibilidad insuficiente. Para abordar estas limitaciones, hemos desarrollado métodos de detección cuantitativa basados en el marcaje fluorescente.

Para mejorar la detección de la actividad de T6SS, desarrollamos tres métodos de marcaje fluorescente: (1) Un método de detección cuantitativo basado en el marcaje con luciferasa, que se caracteriza por su alta especificidad, sensibilidad y reproducibilidad, lo que lo hace adecuado para el análisis de alto rendimiento; (2) Un método de detección basado en el marcaje de proteínas fluorescentes verdes (GFP), que, a pesar de ser susceptible a las interferencias ambientales, ofrece la ventaja de un alto rendimiento; (3) Detección por citometría de flujo, que puede evaluar cuantitativamente la viabilidad bacteriana pero es operativamente compleja y costosa. Después de una comparación exhaustiva, el método de etiquetado basado en luciferasa demostró ser el más preciso, sensible y fácil de usar. Cuando se aplicó a 20 aislados clínicos de A. baumannii, se confirmó que este método evaluó de manera rápida y precisa la actividad de T6SS.

Introducción

El sistema de secreción tipo VI (T6SS) es un importante sistema de secreción de proteínas en bacterias gramnegativas, ampliamente involucrado en la competencia bacteriana, el antagonismo contra los huéspedes eucariotas y la regulación de las respuestas inmunitarias del huésped ^1,2. Al inyectar proteínas efectoras tóxicas en las bacterias vecinas o células eucariotas, T6SS ayuda a las bacterias a mantener una ventaja competitiva en entornos complejos. En los últimos años, el importante papel de T6SS en la adaptabilidad bacteriana, la patogenicidad y las interacciones microbiana....