En este trabajo se presenta un protocolo que detalla un modelo quirúrgico para la obtención de riñón en un modelo preclínico porcino para su posterior perfusión o trasplante con máquina.
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Artículo de método
Obtención de riñón en un modelo preclínico de animales grandes
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Resumen
Resumen
La perfusión mecánica ha evolucionado como una estrategia viable para la evaluación, el seguimiento, el tratamiento y la optimización de órganos ex vivo , así como para prolongar los tiempos de conservación. Los modelos de animales grandes han sido primordiales para el desarrollo y la optimización de estas tecnologías. Sin embargo, para garantizar la calidad del injerto y la reproducibilidad de los datos, se deben seguir técnicas quirúrgicas estandarizadas y clínicamente traducibles para la obtención de órganos y tejidos. Por lo tanto, aquí describimos un protocolo optimizado para la obtención de riñón en un modelo preclínico de cerdos. La recuperación del riñón se realiza utilizando cerdos de raza mixta (Yorkshire cross/mix). Brevemente, después de la desinfección estéril y el cubredo del campo quirúrgico, se realiza una incisión completa en la línea media para obtener un acceso óptimo a ambos riñones. El uréter, la vena renal y la arteria se disecan hasta su origen desde la vena cava inferior y la aorta, respectivamente. Después de la disección renal completa, el uréter se liga y se corta distalmente. A continuación, el animal donante se hepariniza completamente con 100 UI por kg/peso corporal. A continuación, la arteria renal se pinza cerca de la aorta y la vena renal se pinza cerca de la vena cava con una pinza vascular de Satinsky. A continuación, se reseca el injerto de riñón y se canulada inmediatamente la arteria renal. A continuación, se enjuagará el riñón con una solución de conservación helada y se almacenará en hielo hasta la perfusión mecánica o el trasplante. Por último, el muñón de la arteria renal se liga con una ligadura de seda 2-0 y la vena cava se cierra con una sutura de polipropileno 6-0. Esta técnica recupera riñones y simula un entorno de donante vivo (riñón único) o fallecido (riñón doble). La recuperación de un solo riñón ofrece la ventaja de realizar un autotrasplante posterior. En el modelo de donante fallecido, la sangre puede extraerse antes de la eutanasia insertando agujas de bolsa de sangre directamente en la aorta, desangrando así al animal y proporcionando sangre para la perfusión ex vivo con máquina.
Introducción
El trasplante de riñón es el tratamiento óptimo para la enfermedad renal terminal (IRT), ya que proporciona una mejor calidad de vida y resultados a largo plazo en comparación con la diálisis1. A pesar de los avances en la preservación de órganos, docenas de personas mueren cada día de ESRD mientras están en la lista de espera para un trasplante de riñón. La perfusión mecánica es un campo en crecimiento que aumenta los tiempos de conservación, lo que permite ampliar las redes de donantes y una asignación más eficiente de los órganos. Esta tecnología también permite la monitorización y optimización de órganos ex vivo, minimizando así los efectos de la lesión por isquemia-reperfusión (IRI). En comparación con el almacenamiento en frío estático (SCS), se ha demostrado que la perfusión de la máquina reduce significativamente la incidencia de retraso en la función del injerto 3,4. La perfusión mecánica también ha demostrado la revitalización de injertos marginales, que de otro modo no habrían cumplido con los criterios para el trasplante5. A pesar de los avances tecnológicos, la técnica de conservación más común sigue siendo el SCS en hielo. Otros experimentos y datos preclínicos pueden ayudar a que la perfusión con máquina sea un pilar de la preservación del riñón.
El modelo porcino para el trasplante de riñón está bien establecido y ha sido parte integral del desarrollo de la tecnología de preservación del riñón, especialmente la perfusión mecánica. A diferencia de los riñones unilobulillares de roedores, los riñones porcinos y humanos son multilobulares, de tamaño similar y comparten una anatomía arterial, venosa y urinaria análoga 6,7. Por lo tanto, el riñón porcino facilita una traducción directa al entorno clínico, especialmente en términos de dispositivos médicos y terapias farmacológicas. Además, los riñones porcinos muestran una fisiopatología de IRI similar a la de los riñones humanos8, lo que los hace ideales para estudios de preservación renal.
Con el fin de garantizar la calidad del injerto y la reproducibilidad de los datos, se deben seguir técnicas quirúrgicas estandarizadas y clínicamente traducibles para la obtención de órganos y tejidos. Por lo tanto, aquí describimos un protocolo optimizado para la obtención de riñón en un modelo preclínico de cerdos. Este protocolo permite la recuperación de riñones y simula un entorno de donante vivo (riñón único) o fallecido (riñón doble). La recuperación de un solo riñón ofrece la ventaja de realizar un autotrasplante posterior. En el modelo de recuperación renal dual, la extracción de sangre antes de la eutanasia es posible mediante la inserción de agujas de bolsa de sangre directamente en la aorta, exanguinando así al animal y proporcionando sangre para la perfusión ex vivo con máquina.
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Protocolo
Todos los procedimientos descritos fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso Institucional de la Universidad Johns Hopkins, una institución autorizada por el Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (USDA), asegurada por la Oficina de Bienestar de los Animales de Laboratorio (OLAW) y acreditada por la Asociación para la Evaluación y Acreditación del Cuidado de Animales de Laboratorio (AAALAC). Los animales se mantuvieron de acuerdo con la Ley de Bienestar Animal del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos, la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud y la Política del Servicio de Salud Pública de los Estados Unidos sobre el Cuidado y Uso Humanitario de los Animales de Laboratorio.
1. Animales y alojamiento
- Utilice cerdos Yorkshire (Sus scrofa domesticus) de 3 a 6 meses de edad, clínicamente sanos y de 20 a 40 kg, o similares, para este protocolo.
- Aloje a los animales en cercas de alambre con piso de listones.
2. Procedimiento preoperatorio y anestesia
- Ayunar al animal al menos 12 h antes del tiempo de sedación.
- Administrar simeticona oral (20 mg/kg) al menos 12 h antes de la cirugía y repetir la dosis al menos 1 h antes de la sedación para reducir la dilatación intestinal.
- Administrar ketamina (20-30 mg/kg) y xilacina (2-3 mg/kg) en una sola jeringa por vía intramuscular para evitar múltiples inyecciones.
- Transfiera al cerdo al área de preparación preoperatoria. Colocar un catéter intravenoso en una vena marginal del oído. Administrar 3-10 mg/kg/h de solución salina al 0,9% o de Ringer lactato durante todo el procedimiento.
- Una vez que el cerdo esté adecuadamente sedado, colocar un tubo endotraqueal (tubo endotraqueal con manguito de 6,0-6,5 mm para animales de 20-30 kg; 6,5-7,0 mm con manguito para 30-40 kg) para la administración de anestesia gaseosa y ventilación mecánica. Si es necesario, facilitar con una dosis de propofol (0,8-1,66 mg/kg) por vía intravenosa, administrada al efecto.
- Retire el pelo que se encuentra en el sitio quirúrgico y lo rodea con una maquinilla, así como un limpiador sucio del sitio quirúrgico, antes de trasladar al animal al quirófano.
- Transfiera el animal a la mesa de operaciones. Administrar cefazolina (20-22 mg/kg) por vía intravenosa 10 min antes del inicio de la cirugía y de nuevo cada 90 min intraoperatoriamente. Administrar pantoprazol (0,5-1 mg/kg) por vía intravenosa al inicio de la cirugía.
- Administrar un bloqueo local por vía subcutánea con lidocaína (hasta 2 mg/kg) para facilitar la adición de analgesia antes de la incisión.
- Prepare asépticamente el sitio quirúrgico, alternando entre clorhexidina o betadine y etanol al 70% o solución salina, al menos tres veces.
- Controle continuamente el volumen de líquidos, la frecuencia cardíaca, la presión arterial, la oximetría de pulso, la capnografía, la electrocardiografía y la temperatura rectal. Registre estos valores cada 10-15 minutos. Use una almohadilla térmica para la parte inferior del cuerpo y una manta de aire caliente para prevenir la hipotermia.
- Antes del inicio de la cirugía, confirme que el animal se encuentra dentro del plano apropiado de anestesia quirúrgica utilizando una combinación de tono de mandíbula, reflejo palpebral y parámetros enumerados en el paso anterior.
3. Procedimiento de extracción de riñón
- Preparar al animal para la cirugía, siguiendo los pasos descritos en la sección 2.
- Después de la desinfección estéril y el paño del campo quirúrgico, realizar una laparotomía mediana (25-30 cm) para obtener un acceso óptimo a ambos riñones. Inserte un retractor abdominal estándar.
- Cubra el colon y el intestino delgado con toallas empapadas en solución salina tibia. Retraiga los intestinos hacia el lado derecho para acceder al riñón izquierdo o hacia el lado izquierdo para acceder al riñón derecho.
- Abra el peritoneo que recubre el riñón y diseccione alrededor del riñón para liberar cualquier adherencia. Diseccionar el uréter hasta obtener 10-12 cm de longitud.
- Diseccionar la vena y la arteria renal hasta su origen desde la vena cava inferior y la aorta, respectivamente.
- Después de la disección renal completa, atar el uréter distalmente con una ligadura de seda 2-0 y cortar proximalmente a la ligadura. Deje abierto el extremo proximal del uréter para permitir el drenaje de la orina.
- Heparinizar al animal con heparina intravenosa (100 UI/kg) y esperar 2 min para asegurar una heparinización adecuada del riñón. Este paso debe repetirse antes de la resección de cada riñón.
- Pinzar la arteria renal y la vena renal cerca de la aorta y la vena cava inferior, respectivamente, con dos pinzas vasculares de Satinsky. Retire el injerto de riñón cortando la arteria renal y la vena cerca de las pinzas.
- Cánula inmediata de la arteria renal con una cánula de perfusión de punta roma de 3 mm. Enjuague el riñón con una solución helada de la Universidad de Wisconsin (UW) o una solución de conservación de custodiol histidina-triptófano-cetoglutarate (HTK).
- Retire la cánula de perfusión después de enjuagar con UW o HTK y coloque el riñón en una bolsa estéril llena de la misma solución de conservación helada que se usó para lavar el riñón. Coloque esta bolsa dentro de una segunda bolsa estéril para órganos. Posteriormente almacenar el órgano o iniciar la máquina de perfusión.
- Ligue el muñón de la arteria renal con una ligadura de seda 2-0. Cierre el muñón de la vena renal con una sutura continua de dos capas con polipropileno 6-0.
4. Procedimiento de extracción de sangre
- Si el procedimiento es terminal y se han realizado todas las demás intervenciones quirúrgicas, se procede a la extracción de sangre para la perfusión mecánica y a la eutanasia por exanguinación.
- Retraiga los intestinos hacia el lado derecho e identifique la aorta abdominal infrarrenal. Libere cualquier adherencia grande o tejido que cubra el vaso.
- Inserte la aguja de la bolsa de recolección de sangre directamente en la aorta. Cuelga la bolsa debajo del animal para facilitar el llenado. Una vez que la bolsa esté llena (aproximadamente 450 ml de sangre), retire la aguja de la aorta y mantenga la presión en el sitio de la punción.
- Para una segunda bolsa de sangre, inserte la nueva aguja 1-2 cm proximalmente al sitio de punción anterior. Repita con varias bolsas de sangre según sea necesario, moviendo 1-2 cm proximalmente con cada aguja.
- Una vez que se haya recolectado toda la sangre necesaria, induzca un paro cardíaco con inyección intravenosa de pentobarbital sódico/fenitoína sódica a una dosis de al menos 78 mg/kg del componente pentobarbital. Si existe la preocupación de que el pentobarbital interfiera con las pruebas posteriores del riñón, utilice cloruro de potasio (KCl) (75-100 mg/kg IV) como método químico alternativo de eutanasia si se administra a cerdos bajo anestesia. Verificar la muerte por falta de latidos cardíacos, ausencia de reflejo corneal y una disminución significativa de la temperatura corporal.
NOTA: Los órganos y tejidos restantes del cerdo sacrificado se pueden utilizar para otros fines de investigación o educativos de acuerdo con los principios de las 3R.
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Resultados
Nuestro grupo de investigación tiene una amplia experiencia de casi 15 años con modelos porcinos tanto de trasplante de órganos sólidos como de alotrasplante compuesto vascularizado 9,10,11,12,13,14,15,16,17
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Discusión
El modelo porcino para el trasplante de riñón ha sido vital para el desarrollo y la optimización de la tecnología de perfusión mecánica. Dadas las similitudes anatómicas, inmunológicas y fisiopatológicas con los riñones humanos 6,7,8, los riñones porcinos ofrecen una traducción facilitada a las pruebas clínicas y a la práctica.
El modelo d...
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Agradecimientos
Los autores desean agradecer a los numerosos técnicos veterinarios de la Facultad de Medicina de la Universidad Johns Hopkins por su asistencia técnica. También nos gustaría expresar nuestro agradecimiento a las Dras. Jessica Izzi y Amanda Maxwell, y a los numerosos residentes veterinarios, incluidos los Dres. Mallory Brown, Jessica Plunkard y Alexis Roach por brindar a nuestros animales una excelente atención clínica y supervisión veterinaria. Finalmente, nos gustaría agradecer a todos los miembros del Laboratorio de Alotrasplante Compuesto Vascularizado (VCA) de la Facultad de Medicina Johns Hopkins que han ayudado en cualquier capacidad con la obtención de riñón u otros procedimientos de obtención de órganos realizados en nuestro laboratorio. Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Diabetes y Enfermedades Digestivas y Renales (NIDDK, por sus siglas en inglés) R44DK136396.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Solución de etanol al 70% | Fisher Scientific | 04-355-122 | |
| Adson Tissue ForceA2:D30ps, 4,75", 1 x 2 dientes | Wexler Surgical | FL0081.1 | |
| Manta de salud animal Bair Hugger sobre el cuerpo | 3M | 53777 | |
| Unidad de Calentamiento Bair Hugger | 3M | 77500 | |
| Separador abdominal Balfour con cuchillas laterales fijas, 4" de profundidad, 10" de ampliación máxima | Suministro Médico MPM | 124-7017 | |
| Solución de betadina (5% de Providona-yodo) | Salud Animal de MWI | NDC-67618-155-01 | |
| Cefazolina para inyección, USP | Salud Animal de MWI | NDC-63323-237-10 | |
| Solución de clorhexidina | Salud Animal de MWI | NDC-30798-624-31 | |
| Custodia Solución de preservación de órganos HTK | Productos farmacéuticos esenciales | 25767073545 | |
| Pinzas de tejido DeBakey, 7,75", 2 mm Puntas | Wexler Surgical | FL0789.1 | |
| EUTHASOL (pentobarbital sódico y fenitoína sódica) | Virbac | NDC-051311-050-01 | |
| Inyección de Heparina Sódica, USP | Salud Animal de MWI | NDC-71288-402-10 | |
| Controlador de gestión de temperatura de perritos calientes | Augustine Surgical Inc. | WC71V | |
| Colchón calefactante para perritos calientes veterinarios | Augustine Surgical Inc. | V106 | |
| Bolsa de aislamiento Invisishield, 20" x 20" | Medline | DYNJSD1003 | |
| Portaagujas micro Jacobson, mandíbulas rectas, mango redondo, 7,25" | Wexler Surgical | NL0729.11 | |
| Solución inyectable de clorhidrato de ketamina | NexGen Pharmaceuticals | NC-0256 | |
| Esponjas de rego 18" x 18" | Medline | MDS231318LF | |
| Tijeras de disección Metzenbaum, 7" curvas | Wexler Surgical | SL5011.1S | |
| Tubo de succión no conductor con conectores ondulados, 1/4" x 10' | Medline | DYND50251 | |
| Pantoprazol sódico para inyección | Salud Animal de MWI | NDC-55150-202-00 | |
| Cánula de perfusión, flujo libre, punta roma de 3 mm | Soluciones de la Alianza MED | PER-3003S | |
| Yankauer de punta rígida de bulbo | Medline | DYND50130 | |
| Pinza Satinsky, mandíbulas atraumáticas DeBakey inclinadas de 30 mm, vástagos curvados, 10" | Wexler Surgical | AL2150.1 | |
| Asa de bisturí #3 | Instrumentos de Precisión Mundial | 500236 | |
| Servator B UW (Universidad de Wisconsin) | Soluciones Globales de Trasplantes | JFISERB10A R2 | |
| Unidad de Recogida Única Prellenada CPDA-1, 450 mL | Laboratorios Jorgensen | JO520 | |
| Corbata de sutura de seda de sofo, 2-0, negra, 18" | Covidien | S-195 | |
| Bisturí quirúrgico nº 10 | Instrumentos de Precisión Mundial | 500239 | |
| Sutura Surgipro II, 6-0, azul, 30", doble brazo, aguja CV-22 | Covidien | VP-733-X | |
| Tela quirúrgica de tres cuartos | Medline | DYNJP2414 | |
| Lápiz electroquirúrgico Valleylab con electrodos de acero inoxidable | Covidien | CVNE2516H | |
| Generador electroquirúrgico Valleylab Force FXc | Covidien | MFI-MDT-FORCE-FXC | |
| Electrodo de retorno polihesivo de paciente adulto Valleylab | Covidien | E7507-SD | |
| Solución inyectable de clorhidrato de xilazina | NexGen Pharmaceuticals | NC-0334 |
Referencias
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