El presente protocolo describe un método quirúrgico estandarizado para la inducción de aneurismas carotídeos en un modelo murino a través de una sola operación quirúrgica.
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Artículo de método
Un modelo murino de formación de aneurismas carotídeos
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Resumen
Resumen
Los aneurismas cerebrales están presentes en aproximadamente el 2% -5% de la población y representan un importante problema de salud pública debido a sus altas tasas de mortalidad y morbilidad al romperse. A pesar de los avances en la investigación, el desarrollo de modelos animales efectivos y reproducibles sigue siendo un desafío. Entre los modelos disponibles, los aneurismas inducidos quirúrgicamente se utilizan ampliamente; sin embargo, la complejidad técnica de estos procedimientos a menudo limita su accesibilidad. Estos métodos requieren una amplia experiencia quirúrgica y se asocian con tasas más altas de mortalidad intraoperatoria o formación inconsistente de aneurismas, lo que puede comprometer la confiabilidad de los resultados experimentales. Para abordar estas limitaciones, este artículo en video presenta un procedimiento quirúrgico simplificado para inducir aneurismas carotídeos en ratones, realizado en una sola sesión. Este enfoque simplificado ha demostrado una impresionante tasa de éxito del 87% en la inducción de aneurismas carotídeos en ratones hembra. Al reducir los desafíos técnicos y mejorar la reproducibilidad, este método proporciona una alternativa práctica y confiable para la investigación de aneurismas cerebrales. Su adopción generalizada podría facilitar estudios estandarizados, acelerar el desarrollo de estrategias terapéuticas y, en última instancia, avanzar en nuestra comprensión de la fisiopatología del aneurisma.
Introducción
Los aneurismas cerebrales son dilataciones localizadas en las paredes de los vasos sanguíneos cerebrales, que afectan aproximadamente al 2% al 5% de la población general. La ruptura de estos aneurismas puede provocar hemorragia subaracnoidea, que conlleva altas tasas de mortalidad y morbilidad 1,2. Comprender la patogénesis de los aneurismas cerebrales e identificar posibles objetivos terapéuticos requiere modelos animales confiables y reproducibles que imiten la enfermedad humana. Este artículo presenta un método quirúrgico estandarizado para inducir aneurismas carotídeos en ratones, ofreciendo una alternativa práctica y eficiente a los modelos intracraneales más exigentes técnicamente3.
El desarrollo de esta técnica está motivado por los desafíos asociados con los modelos de aneurismas cerebrales existentes. Los modelos de aneurisma intracraneal, aunque ampliamente utilizados, requieren procedimientos quirúrgicos complejos y están limitados por el pequeño calibre de los vasos intracraneales, lo que dificulta su utilidad para probar dispositivos endovasculares y otras intervenciones 4,5. Además, las variaciones en los métodos utilizados en los estudios, como las diferencias en las concentraciones de elastasa y los tiempos de exposición, reducen la reproducibilidad y dificultan las comparaciones entre estudios. Al estandarizar el procedimiento, esta técnica aborda estas limitaciones y proporciona una alta tasa de éxito de la inducción de aneurismas con un riesgo quirúrgico mínimo.
En comparación con los métodos alternativos, el modelo de aneurisma carotídeo ofrece varias ventajas distintas. En primer lugar, el procedimiento quirúrgico simplificado reduce las barreras técnicas, haciéndolo más accesible a una gama más amplia de laboratorios. En segundo lugar, el mayor calibre de la arteria carótida en comparación con los vasos intracraneales facilita la prueba de enfoques terapéuticos, incluidos los dispositivos endovasculares. Estudios previos han demostrado variaciones de este modelo con resultados prometedores, pero los protocolos inconsistentes han limitado la reproducibilidad 6,7. Nuestro enfoque refina estos métodos, logrando una tasa de éxito del 87% en ratones hembra y asegurando la consistencia en todos los experimentos.
En el contexto más amplio de la literatura, los modelos animales para aneurismas cerebrales son fundamentales para comprender los mecanismos de la enfermedad, evaluar objetivos terapéuticos y desarrollar estrategias de intervención. Se han desarrollado modelos en varias especies, incluidos el pez cebra, las ratas, los conejos y los perros, cada uno con ventajas y limitaciones únicas 3,8. Este modelo de aneurisma carotídeo complementa el repertorio existente al ofrecer un equilibrio entre viabilidad técnica y relevancia para las enfermedades humanas, lo que lo convierte en una opción ideal para los investigadores que buscan un modelo confiable y reproducible para estudios preclínicos.
Este método es particularmente adecuado para laboratorios que buscan investigar los fundamentos moleculares y biomecánicos de la formación de aneurismas, probar agentes farmacológicos o evaluar dispositivos endovasculares. Los investigadores deben considerar si las características anatómicas y fisiológicas de este modelo se alinean con sus objetivos experimentales específicos. Al proporcionar un protocolo estandarizado y reproducible, esta técnica tiene como objetivo avanzar en la investigación de aneurismas cerebrales y fomentar una mayor consistencia entre los estudios en el campo.
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Protocolo
El protocolo animal fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IS00022015) de la Universidad de Pittsburgh. Para los experimentos se utilizaron ratones hembra C57BL/6J de tipo salvaje (WT), de 6 a 8 semanas de edad. Los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.
1. Preparación de animales
- Inducir anestesia.
- Coloque el ratón en una cámara de inducción y administre gas isoflurano a una concentración del 3%-4% para la inducción utilizando un sistema vaporizador de anestesia (siguiendo protocolos aprobados institucionalmente). Ajuste el caudal a 1,0-1,5 L/min de oxígeno.
- Vigile al animal para detectar signos de anestesia completa (p. ej., falta de respuesta a estímulos externos y frecuencia respiratoria reducida).
- Traslado al sitio quirúrgico.
- Una vez que el ratón esté completamente anestesiado, transfiéralo a la estación quirúrgica mientras mantiene la anestesia con isoflurano a una concentración de mantenimiento del 1-3% y un caudal de oxígeno de 0,8-1,0 L / min. Asegúrese de que el mouse esté conectado al sistema de administración de anestesia a través de un cono nasal.
- Mantenimiento de la temperatura.
- Coloque el ratón sobre una almohadilla térmica preajustada a 36 °C. Conecte una sonda de temperatura para controlar continuamente la temperatura corporal durante todo el procedimiento. Ajuste la configuración de la almohadilla térmica si es necesario para mantener una temperatura estable.
2. Preparación para la cirugía
- Inmovilizar al animal.
- Coloque el ratón en posición supina. Use tiras de cinta quirúrgica para asegurar suavemente cada extremidad a la plataforma quirúrgica, asegurándose de que el cuerpo se estabilice sin tensión indebida.
- Afeita el área del cuello.
- Con una maquinilla quirúrgica pequeña, afeite el pelaje de la región del cuello (área de aproximadamente 2 cm x 2 cm). Elimine el vello suelto con una gasa quirúrgica estéril.
- Esterilice el sitio quirúrgico.
- Aplique dos rondas de solución de povidona yodada en el área del cuello con aplicadores con punta de algodón, seguidas de dos rondas de etanol al 70%. Deje que el área se seque al aire entre aplicaciones para garantizar una esterilización adecuada.
3. Etapa I: Ligadura de la arteria carótida común
- Confirme la anestesia.
- Realice una prueba de pellizco del dedo del pie con pinzas romas. La falta de retraimiento o movimiento reflejo confirma una anestesia adecuada.
- Realice una incisión en la línea media.
- Con unas tijeras quirúrgicas, haga una incisión vertical de 1 cm a lo largo de la línea media del cuello, comenzando justo debajo de la línea de la mandíbula. Cortar la dermis y la fascia subyacente.
- Exponga la glándula submandibular.
- Use pinzas romas para movilizar la glándula submandibular lateralmente, teniendo cuidado de no dañar los tejidos circundantes. Levante suavemente la glándula y sepárela del esternón mediante una disección roma.
- Asegure la glándula con un pequeño retractor estéril o un clip para mantener un campo quirúrgico despejado.
- Exponer el músculo esternocleidomastoideo (SCM).
- Identificar visualmente el músculo esternocleidomastoideo ipsilateral (SCM). Use fórceps romos para levantar el músculo suavemente y enhebre una sutura de seda trenzada 5-0 debajo. Refleje el músculo lateralmente tirando suavemente de la sutura para exponer la vaina carotídea.
- Aísle la arteria carótida.
- Abra la vaina carotídea con unas pinzas afiladas. Separe cuidadosamente la arteria carótida de la vena yugular adyacente y el nervio vago.
- Para mejorar la visibilidad, inserte un manguito o retractor de silicona estéril debajo de la arteria carótida. Evite causar traumatismos en la arteria o las estructuras circundantes.
- Ligue la arteria carótida.
- Con pinzas afiladas, saque la arteria carótida y enhebre una sutura 9-0 debajo. Haga un nudo doble seguro para ligar la arteria, asegurando la tensión adecuada para ocluir el flujo sanguíneo sin dañar el vaso. Recorte los extremos de sutura para minimizar la irritación del tejido.
- Cierre la incisión.
- Aproxime los bordes de la piel con sutura de nailon estéril (5-0) o grapas quirúrgicas. Aplique una presión suave con una gasa estéril para asegurar la hemostasia.
4. Cuidados postoperatorios
- Vigila al animal.
- Observe al animal diariamente para detectar signos clínicos de complicaciones como ruptura prematura del aneurisma (evidenciada por letargo repentino o hematoma), accidente cerebrovascular, convulsiones o pérdida de peso significativa (>10% del peso inicial).
- Sacrificar rápidamente a los animales (siguiendo los protocolos aprobados institucionalmente) que presenten síntomas graves para minimizar el dolor y la angustia.
- Cuidado de heridas
- Inmediatamente después de la cirugía, aplique gel de lidocaína al 4% en el sitio de la incisión para aliviar el dolor local. Aplique una capa delgada de ungüento antibiótico (por ejemplo, bacitracina) para prevenir infecciones. Repita el cuidado de la herida diariamente durante al menos 3 días o hasta que la herida muestre signos de curación.
- Entorno de recuperación
- Coloque al animal en una jaula de recuperación limpia con ropa de cama suave. Asegure el acceso a líquidos calientes o a un gel de hidratación para ayudar a la recuperación. Monitoree hasta que el animal esté completamente despierto y móvil, luego devuélvalo a su alojamiento estándar.
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Resultados
Un total de 15 ratones hembra de tipo salvaje (WT) se sometieron al procedimiento de inducción del aneurisma siguiendo el protocolo estandarizado descrito (Figura 1). Dos semanas después de la cirugía, la formación de aneurismas se logró con éxito en aproximadamente el 87% de los ratones, como lo confirmó el examen morfológico macroscópico (Figura 2 y Figura 3). Esto...
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Discusión
El modelo de aneurisma carotídeo inducido por ligadura de la arteria carótida fue descrito inicialmente en la década de 1970 por Yasargil y Matsuda, quienes utilizaron injertos venosos para inducir el desarrollo de aneurismas 9,10. Las modificaciones posteriores a esta técnica, incluida la adición del tratamiento con elastasa y la ligadura carotídea, han permitido la generación de aneurismas carotídeos más grandes de una manera m...
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Sutura trenzada absorbible 5-0 | Ethicon / Ethilon | J463G | |
| Sutura monofilamentosa no absorbible 5-0 | Ethicon / Ethilon | 8698G | |
| Sutura monofilamento no absorbible 9-0 | Ethicon / Ethilon | 2829G | |
| Compresas para preparar alcohol | Medline | CUR45585RB | |
| Animal Pocket Pro Shaver | Wahl | 9861-900 | |
| Pinzas Dumont #5 | Roboz | RS-5058 | |
| Pinzas de titanio Dumont; Patrón #5 | Roboz | RS-5050 | |
| Pinzas Graefe | Roboz | RS-5138 | |
| Pinzas de tejido Graefe | Roboz | RS-5155 | |
| lidocaína, 4%, tópica | Medline | 52565-009-50 | |
| Micro-clip recto, 5 mm | Roboz | RS-5420 | |
| Tijeras micro-diseccionadoras | Roboz | RS-5610 | |
| Micro-sclip recto, 8 mm | Roboz | RS-5424 | |
| Pinzas para mosquitos, 4" | Roboz | RS-7100 | |
| Guantes de nitrilo | Fisherbrand | 19-130-1597 | |
| Penicilina-estreptomicina | Thermo Fisher | 15140122 | |
| Elastasa pancreática porcina | Worthington | LS002274 | |
| Povidona-yodo | Medline | MDS093943 | |
| tijeras, extrafinas | Roboz | RS-5880 | |
| Tijeras, vale | Roboz | RS-5840 | |
| Solución salina estéril al 0,9% | Baxter | 2B1324X | |
| Aplicador de algodón estéril | Dynarex | 4303 | |
| Toallas quirúrgicas desechables estériles, azules | Medline | MDT2168202H | |
| Impermeabilización transparente Tegaderm | 3M | 1624W |
Referencias
- Vlak, M. H., Algra, A., Brandenburg, R., Rinkel, G. J. Prevalence of unruptured intracranial aneurysms, with emphasis on sex, age, comorbidity, country, and time period: A systematic review and meta-analysis. Lancet Neurol. 10 (7), 626-636 (2011).
- van Gijn, J., Kerr, R. S., Rinkel, G. J. E. Subarachnoid haemorrhage. Lancet. 369 (9558), 306-318 (2007).
- Strange, F., Gruter, B. E., Fandino, J., Marbacher, S. Preclinical intracranial aneurysm models: A systematic review. Brain Sci. 10 (3), 134(2020).
- Frösen, J. Smooth muscle cells and the formation, degeneration, and rupture of saccular intracranial aneurysm wall - A review of current pathophysiological knowledge. Transl Stroke Res. 5 (3), 347-356 (2014).
- Frösen, J., et al. Remodeling of saccular cerebral artery aneurysm wall is associated with rupture: Histological analysis of 24 unruptured and 42 ruptured cases. Stroke. 35 (10), 2287-2293 (2004).
- Tulamo, R., Frösen, J., Hernesniemi, J., Niemelä, M. Inflammatory changes in the aneurysm wall: A review. J Neurointerv Surg. 2 (2), 120-130 (2010).
- Hashimoto, N., et al. Experimental induction of cerebral aneurysms in monkeys. J Neurosurg. 67 (6), 903-905 (1987).
- Lv, X., Zhang, H., Kong, W., Liang, S., Zhang, H. Evaluation of an antithrombotic surface-coated flow diverter in a rabbit model without dual antiplatelet drugs. World Neurosurg. 192, e155-e162 (2024).
- Yasargil, M. G., Fox, J. L. The microsurgical approach to intracranial aneurysms. Surg Neurol. 3 (1), 7-14 (1975).
- Nishikawa, M., Yonekawa, Y., Matsuda, I. Experimental aneurysms. Surg Neurol. 5 (1), 15-18 (1976).
- Hoh, B. L., et al. A novel murine elastase saccular aneurysm model for studying bone marrow progenitor-derived cell-mediated processes in aneurysm formation. Neurosurgery. 66 (3), 544-550 (2010).
- Staarmann, B., Smith, M., Prestigiacomo, C. J. Shear stress and aneurysms: A review. Neurosurg Focus. 47 (1), E2(2019).
- Dolan, J. M., Kolega, J., Meng, H. High wall shear stress and spatial gradients in vascular pathology: A review. Ann Biomed Eng. 41 (7), 1411-1427 (2013).
- Aoki, T., Nishimura, M. The development and the use of experimental animal models to study the underlying mechanisms of CA formation. J Biomed Biotechnol. 2011, 535921(2011).
- Starke, R. M., et al. Critical role of TNF-α in cerebral aneurysm formation and progression to rupture. J Neuroinflammation. 11, 77(2014).
- Hussain, S., et al. Search for biomarkers of intracranial aneurysms: A systematic review. World Neurosurg. 84 (5), 1473-1483 (2015).
- Broderick, J. P. Jr Unruptured intracranial aneurysms: Epidemiology, natural history, management options, and familial screening. Lancet Neurol. 13 (4), 393-404 (2014).
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