Modelo de obstrucción ureteral unilateral para la investigación de la fibrosis intersticial renal

Resumen

Este protocolo describe un método para inducir la obstrucción ureteral unilateral (UUO) en ratones para estudiar la progresión de la fibrosis tisular en la nefropatía obstructiva. Incluye procedimientos quirúrgicos, cuidados postoperatorios y métodos para la evaluación de la fibrosis.

Resumen

La fibrosis renal es el resultado patológico final de la enfermedad renal crónica (ERC) progresiva. El modelo de obstrucción ureteral unilateral (UUO) es ampliamente utilizado para dilucidar los mecanismos moleculares y celulares que subyacen a la fibrosis intersticial renal y para identificar posibles dianas terapéuticas. Este modelo se establece en ratones a través de la ligadura quirúrgica de un uréter unilateral, un procedimiento relativamente sencillo y fácil de realizar. Sin embargo, se sabe que el modelo de ratón UUO exhibe una variabilidad e inconsistencia significativas, influenciadas por factores como la tensión del ratón, la edad, el sexo, el tipo de anestesia, la duración de la cirugía, la temperatura corporal durante el procedimiento, las habilidades quirúrgicas del operador, las condiciones de alimentación y el estado de salud general de los ratones. Las variaciones en las técnicas quirúrgicas, la colocación de las suturas y la duración de la obstrucción contribuyen a la variabilidad de los resultados. Además, el muestreo inconsistente de riñones obstruidos aumenta aún más la variabilidad en la evaluación de la fibrosis renal. Este estudio describe el proceso de desarrollo del modelo de ratón UUO y la evaluación de la fibrosis intersticial, discute los desafíos técnicos que contribuyen a la imprevisibilidad del modelo y propone posibles soluciones. Estos conocimientos tienen como objetivo establecer un enfoque más estandarizado y universalmente aplicable para investigar la fibrosis renal.

Introducción

La enfermedad renal crónica (ERC) afecta a más del 10% de la población mundial y su prevalencia está aumentando¹. Diversas afecciones del tracto urinario, como anomalías anatómicas congénitas, nefrolitiasis, hiperplasia prostática y tumores vesicales, pueden provocar obstrucción ureteral². Como resultado, el modelo de ratón de obstrucción ureteral unilateral (UUO) es una herramienta clave para identificar nuevos mecanismos de fibrosis intersticial renal, comprender la progresión de la enfermedad y evaluar posibles estrategias de tratamiento. Ha sido ampliamente utilizado para investigar el origen de los miofibroblastos, los subgrupos de (mio)fibroblastos, el metabolismo de las células tubulares y la detención del ciclo celular, la transición epitelio-mesénquima parcial y otros procesos relacionados 3,4,5,6,7,8.

Además de la fibrosis intersticial renal inducida por UUO, otros modelos de fibrosis intersticial renal en roedores que se usan comúnmente incluyen modelos inducidos por toxinas, como los que usan ácido aristolóquico, ácido fólico y adenina, así como modelos inducidos quirúrgicamente como la nefrectomía 5/6 y la lesión por isquemia-reperfusión (IRI). El modelo UUO ofrece varias ventajas sobre los modelos alternativos de fibrosis renal. Por ejemplo, la fibrosis renal inducida por toxinas requiere un período de modelado relativamente largo (aproximadamente 1-2 meses), y sus efectos secundarios tóxicos en otros órganos pueden complicar la investigación de los mecanismos de fibrosis ^9,10,11. Los modelos inducidos quirúrgicamente, como la nefrectomía 5/6, pueden provocar una hemorragia renal significativa e infección, lo que aumenta el riesgo de mortalidad postoperatoria. Además, el grado de fibrosis intersticial inducida se correlaciona directamente con el volumen de tejido renal resecado, lo que dificulta la reproducción consistente del mismo grado de fibrosis en^{cada ratón}.

El modelo IRI renal es un método primario para inducir la lesión renal aguda a la ERC y tiene una relevancia clínica significativa. La gravedad de la fibrosis puede modularse ajustando el tiempo isquémico y la temperatura corporal; sin embargo, en comparación con el modelo UUO, es más complejo quirúrgicamente y la inducción de fibrosis intersticial requiere una mayor duración¹³. En comparación con estos modelos, el modelo UUO tiene varias ventajas, incluida una duración de modelado corta, una variabilidad mínima, repetibilidad y un procedimiento quirúrgico relativamente simple. El modelo de ratón UUO, que no involucra toxinas, se crea ligando un uréter, lo que lleva a una nefropatía obstructiva en dos semanas. Esto da lugar a hidronefrosis, dilatación tubular y fibrosis intersticial, muy parecida al proceso patológico observado en los seres humanos¹⁴. La gravedad de la fibrosis (leve, moderada o grave) se puede controlar ajustando la duración del experimento.

Aunque el modelo de ratón UUO es más sencillo de realizar que otros modelos inducidos por insultos para investigar la ERC, varios factores pueden afectar significativamente su estabilidad. Estos factores incluyen la tensión del ratón, la edad, el sexo, el tipo de anestesia, la duración de la cirugía, la temperatura corporal durante la cirugía, las habilidades quirúrgicas del operador, y las condiciones de alimentación y el estado de salud de los ratones^15,16.

Minimizar el estrés quirúrgico y la infección mientras se realiza el procedimiento de manera constante y organizada bajo anestesia es esencial para crear un modelo de ratón UUO reproducible. Además, la investigación sobre los mecanismos y las posibles dianas terapéuticas de la ERC puede verse comprometida por operadores inexpertos, lo que conduce a una mayor pérdida de ratones y a una mayor heterogeneidad del modelo. Para abordar estos desafíos, se describen los aspectos técnicos clave del proceso quirúrgico (antes, durante y después del procedimiento), destacando los problemas críticos que requieren atención. Además, se detalla la metodología de evaluación para el modelo de ratón UUO para proporcionar a los investigadores un enfoque coherente y fiable.

Protocolo

Todos los procedimientos con animales se llevan a cabo de acuerdo con las pautas de la agencia y son aprobados por el Comité Institucional de Ética Animal de la Universidad Médica de Nanjing. Para eliminar las diferencias de sexo y cepa y garantizar la comparabilidad de los resultados, solo se utilizan ratones machos CD1 de 8 a 10 semanas de edad y con un peso de 22 a 25 g. Los detalles de los reactivos y equipos utilizados en este estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Preparación de animales e instrumentos

1. Autoclave todos los instrumentos quirúrgicos antes de la cirugía.
2. Pesar y anestesiar a los ratones (siguiendo los protocolos aprobados institucionalmente). Conecte correctamente el dispositivo de anestesia inhalatoria y coloque los ratones en la cámara de inducción con isoflurano al 2% mezclado con oxígeno a 1-2 L/min. Luego, coloque la nariz del ratón en el cono de la nariz con un suministro constante de anestesia. Confirme el nivel adecuado de sedación evaluando la falta de respuesta a un pinzamiento del dedo del pie.
   NOTA: Comprobar regularmente la frecuencia respiratoria y evaluar el nivel de anestesia utilizando el reflejo pedal de los ratones. Ajuste el isoflurano según corresponda.
3. Coloque el mouse sobre una almohadilla térmica electrónica en posición supina con la cabeza y el cuello extendidos para mantener abiertas las vías respiratorias. Asegure las patas con cinta adhesiva baja.
4. Utilice un termómetro para controlar la temperatura ambiente y manténgala a 37-38 °C. Inserte una sonda rectal y mantenga la temperatura corporal central de los ratones alrededor de 36,5-37 °C durante el procedimiento.
5. Aplique ungüento oftálmico en los ojos para prevenir la lesión de la xerosis corneal.
6. Afeitar el vello sobre la zona quirúrgica con crema depilatoria y desinfectarlo con solución de betadine tres veces.

2. Procedimiento quirúrgico

NOTA: Una vez que la temperatura corporal se estabilice en el punto de ajuste y el reflejo de pellizco del dedo del pie esté ausente, inicie los siguientes procedimientos quirúrgicos.

1. Use una cuchilla quirúrgica para hacer una incisión quirúrgica vertical de aproximadamente 1 a 1.5 centímetros desde la vejiga hasta el borde inferior izquierdo de las costillas para exponer la cavidad abdominal.
2. Mueva el intestino hacia el lado derecho de la cavidad abdominal usando un hisopo de algodón humedecido con solución salina normal estéril para exponer el riñón izquierdo, ubicado debajo de la parte posterior del bazo y adyacente a la columna vertebral.
3. Use pinzas de iris curvadas para limpiar la grasa y el tejido conectivo que rodea el uréter izquierdo. Después de un aislamiento suave, ligar el uréter izquierdo cerca del polo inferior del riñón con una sutura trenzada de seda 3/0. Realizar una segunda ligadura del uréter izquierdo entre la primera ligadura y la vejiga.
   NOTA: Para minimizar la variabilidad entre los ratones, asegúrese de que la posición de ligadura permanezca constante en todos los sujetos. Utilice las pinzas de la mano izquierda para colocar la sutura en las puntas de las pinzas de la mano derecha y deslice la sutura de nuevo por debajo del uréter¹⁷. Evite incluir exceso de grasa y tejido conectivo en la ligadura, ya que esto puede provocar una obstrucción renal incompleta. Para ello, acaricia suavemente el uréter con bastoncillos de algodón secos.
4. Vuelva a colocar cuidadosamente los intestinos en la cavidad peritoneal. Sutura las capas de músculo y piel por separado con una sutura trenzada de seda 3/0.
   NOTA: Suturar la piel y las capas musculares juntas puede causar la ruptura de la herida de sutura y daño a las vísceras abdominales.
5. Cuando opere en varios ratones, limpie los instrumentos quirúrgicos con agua corriente y etanol al 75% antes de pasar al siguiente ratón.

3. Cuidados y seguimiento postquirúrgico

1. Inyecte 0,5 mL de solución salina normal tibia por vía intraperitoneal para prevenir la deshidratación.
2. Vuelva a colocar a los ratones en una jaula limpia hasta que recuperen la conciencia completa.
3. Administrar buprenorfina (50 μg/kg) por inyección subcutánea durante 3 días. Monitoree a los ratones diariamente para detectar signos de falta de aseo, disminución de la alimentación y postura anormal.

4. Evaluaciones postoperatorias

1. Histología
   1. Eutanasia a los ratones con una sobredosis de isoflurano (siguiendo los protocolos aprobados institucionalmente). Extraer los riñones obstruidos y contralaterales no obstruidos¹⁸ después de la eutanasia.
   2. Utilice el área de la sección transversal más grande de la sección renal para el examen histológico.
   3. Fijar los tejidos renales en paraformaldehído al 4% y cortar las muestras obtenidas en secciones de 4 μm.
   4. Teñir secciones de riñón con ácido peryódico-Schiff (PAS), tinción tricrómica de Masson (MTS) o tinción roja de Sirius para detectar lesión tubular renal y fibrosis renal.
   5. Seleccione diez campos aleatorios de las secciones de riñón bajo un microscopio óptico con un aumento de 200×.
   6. Calcule la proporción del área azul con colágeno positivo utilizando el software ImageJ.
2. Western blot
   1. Extraiga aproximadamente 20 mg de tejido renal del mismo polo de riñones UUO utilizando tampón de ensayo de radioinmunoprecipitación (RIPA)¹⁸.
   2. Cuantificar la concentración de proteínas mediante un ensayo de ácido bicincónico¹⁹.
   3. Cargue cantidades iguales de muestras de proteínas en geles Bis-Tris al 4%-10% para la electroforesis y transfiéralas a membranas de difluoruro de polivinilideno (PVDF).
   4. Bloquee las membranas de PVDF con leche al 5% en Tris-Buffered Saline Tween (TBST) e incube con anticuerpos primarios durante la noche a 4 °C.
   5. Lavar las membranas de PVDF con TBST e incubarlas con anticuerpos secundarios a temperatura ambiente durante 1 h.
   6. Detecte los niveles de proteínas utilizando un método de quimioluminiscencia mejorada (ECL) y analícelos utilizando el software ImageJ, con gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) como control de carga.
3. Función renal
   1. Anestesiar a los ratones con isoflurano inhalado (ver paso 1.2).
   2. Recolectar muestras de sangre retroorbitalmente después de la anestesia.
   3. Centrifugar las muestras de sangre a 3.000 x g durante 15 minutos a temperatura ambiente.
   4. Mida la creatinina sérica y el nitrógeno ureico en sangre (BUN) utilizando un analizador químico seco automático para controlar la función renal.

Resultados

Histología
La tinción con ácido peryódico-Schiff (PAS) reveló dilatación tubular, pérdida de los bordes en cepillo, formación de yesos e hinchazón epitelial tubular. La tinción tricrómática de Masson y rojo de Sirius mostró fibrosis intersticial después de UUO, en contraste con los túbulos compactos normales con lúmenes discernibles observados en el grupo simulado. El grado de fibrosis intersticial renal, indicado por áreas azules en la tinción tricrómica de Masson y áreas rojas en la tinción roja de ...

Discusión

Se proporciona un procedimiento integral para establecer el modelo UUO, un enfoque ampliamente utilizado para investigar la fibrosis intersticial renal. Además, se demuestra la identificación y evaluación del modelo, incluyendo evaluaciones de la función renal y alteraciones histológicas. Se discuten las variables que contribuyen a la heterogeneidad del modelo y los factores técnicos modificables.

La susceptibilidad a la UUO varía significativamente según la e...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Jeringa de 1 ml	Mingankang	/
4/0	Jinhuan Medical	F401
75% Etanol	Lircon	6303060031
Bomba de aire Bomba de aire	RWD Life Science	R510-29
Cámaras de inducción de anestesia	RWD Life Science	V102-V
Cortadora de pelo animal	Jinke	/
Solución de betadina	Lircon	6303030036
Buprenorfina (analgésico)	RWD Life Science	/
Pinzas de iris curvado	jinke	/
Almohadilla térmica electrónica	Reptizoo	AHM23
pinzas rectas finas	Jinke	/
Recipiente de filtro de gas	RWD Life Science	R510-31-6
Almohadillas de gasa	Winner Medical	601-026576
Tijeras de iris	Jinke	/
Isoflurano (anestésico)	RWD Life Science	R510-22-10
Máquina de anestesia animal de salida múltiple	RWD Life Science	R550IE
Portaagujas	jinke	/
ungüento oftálmico	Dechra NDC	17033-211-38
Hisopo de algodón estéril	Winner Medical	601-015213
Solución salina estéril	Shimen	H20066533

de sutura quirúrgica