Artículo de método

Predicción y validación de la regulación de la lesión de los podocitos y el tratamiento de la enfermedad renal diabética por Yinhuo Tang

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DOI:

10.3791/67939

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20 de junio de 2025

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1Nephropathy Department, the Affiliated Hospital to Changchun University of Chinese Medicine, 2College of Integrated Chinese and Western Medicine, Changchun University of Chinese Medicine

En este artículo

Resumen

Utilizando farmacología de redes y validación experimental, este protocolo revela el mecanismo de acción de Yinhuo Tang (YHT) en el tratamiento de la enfermedad renal diabética (DKD) y cómo YHT reduce el daño de los podocitos en ratones DKD a través de la inhibición de la vía de señalización PI3K/AKT/NF-κB.

Resumen

La enfermedad renal diabética (EUD) es una enfermedad renal crónica caracterizada por proteinuria masiva y disminución de la tasa de filtración glomerular. La principal característica patológica de la enfermedad renal diabética es la microangiopatía renal, y ~40% de los pacientes diabéticos desarrollarán enfermedad renal. Las proteínas asociadas a los podocitos CD2AP y WT-1 desempeñan un papel crucial en el mantenimiento de la función normal de los podocitos y la integridad de la barrera de filtración glomerular. Cuando la estructura o función del podocito se altera, debido a la inflamación, el estrés oxidativo u otras agresiones patológicas, el diafragma de hendidura y el citoesqueleto de actina se dañan, lo que lleva a una mayor permeabilidad de la barrera de filtración glomerular y da lugar a proteinuria. Yinhuo Tang (YHT) es una receta de medicina tradicional china que tiene la función de reducir la proteinuria y retrasar el deterioro de la función renal; sin embargo, el mecanismo de la YHT en el tratamiento de la enfermedad renal diabética no está claro. En este trabajo, basado en farmacología de redes y experimentos con animales, examinamos la glucosa en sangre, la función hepática, la función renal, los lípidos en sangre, la patología renal, los niveles de expresión de las proteínas marcadoras de podocitos CD2AP y WT-1, así como la vía de señalización PI3K/AKT/NF-κB en ratones db/db después de la administración de YHT durante 8 semanas. Nuestros resultados muestran que la YHT reduce los niveles de expresión de factores inflamatorios mediante la inhibición de la vía de señalización PI3K/AKT/NF-κB, reduciendo así el daño de los podocitos para que desempeñe un papel en el retraso de la progresión de la enfermedad renal diabética.

Introducción

La enfermedad renal diabética (ERD) es una complicación prevalente y grave de la diabetes, y sigue siendo la principal causa de insuficiencia renal terminal en todo el mundo1. La enfermedad progresa a través de una serie de procesos patológicos complejos, como el agrandamiento glomerular, la expansión mesangial, la fibrosis tubulointersticial y la acumulación excesiva de componentes de la matriz extracelular 2,3. A pesar de las mejoras en el control de la diabetes, las terapias actuales tienen como objetivo principal controlar los niveles de glucosa en sangre y la presión arterial, lo que solo retrasa la progresión de la enfermedad renal diabética en lugar de revertir sus cambios patológicos subyacentes. Esto subraya la necesidad apremiante de opciones de tratamiento más integrales y efectivas 4,5.

La medicina tradicional china (MTC) se ha convertido en una terapia alternativa prometedora en el tratamiento de enfermedades crónicas como la DKD 6,7,8. La medicina tradicional china hace hincapié en un enfoque de tratamiento holístico, que puede abordar la naturaleza compleja y multiobjetivo de la enfermedad renal dal. Entre varias formulaciones de MTC, se ha demostrado que Yinhuo Tang (YHT) posee múltiples funciones fisiológicas, como nutrir el yin (para complementar el volumen de sangre), tonificar el riñón (para mejorar la función renal), eliminar el calor (para suprimir la inflamación) y someter el yang (para reducir la presión arterial)9,10,11. Sin embargo, aún no se ha logrado una comprensión completa de los mecanismos por los cuales YHT alivia la enfermedad renal dalenal.

La proteína CD2AP relacionada con el podocito es una proteína clave en el podocito, crucial para mantener la integridad de la barrera de filtración, mientras que WT-1 desempeña un papel crítico en el desarrollo renal y la fibrosis 12,13,14,15,16. Por lo tanto, la función normal de estas dos proteínas es vital para la función normal de filtración glomerular. La literatura existente sugiere que estas dianas están implicadas en la progresión de la enfermedad renal diabética, y planteamos la hipótesis de que los componentes activos de la YHT pueden interactuar con estas dianas para ejercer efectos terapéuticos. Este estudio tiene como objetivo confirmar estas interacciones y proporcionar información más profunda sobre cómo YHT modula las vías de la enfermedad renal coronaria.

En este estudio, empleamos una combinación de farmacología de red y experimentos con animales para explorar los mecanismos terapéuticos de YHT en la enfermedad renal crónica. La farmacología en red, que integra herramientas bioinformáticas para analizar las complejas interacciones entre los compuestos activos y las dianas biológicas, nos permite explorar la naturaleza multi-diana y multi-vía de la acción de YHT 17,18,19. Los métodos tradicionales de descubrimiento de fármacos a menudo hacen hincapié en las intervenciones de un solo objetivo. Por el contrario, la farmacología en red sirve como una herramienta predictiva que ayuda a identificar posibles vías y dianas moleculares, ofreciendo información preliminar sobre los posibles mecanismos de acción de las terapias complejas. Si bien no reemplaza los rigurosos pasos experimentales y regulatorios necesarios para el desarrollo de medicamentos, la farmacología en red puede guiar la generación de hipótesis y agilizar la investigación en etapas tempranas20.

En última instancia, este estudio tiene como objetivo cerrar la brecha entre la medicina tradicional y la moderna, proporcionando evidencia científica para la integración de la MTC en el tratamiento de la enfermedad renal diabética. Los resultados de esta investigación pueden ayudar a desarrollar estrategias de tratamiento más eficaces y seguras para la enfermedad renal dalizada, ofreciendo una alternativa a la atención estándar que a menudo está limitada por los efectos secundarios. Al dilucidar los mecanismos moleculares de la YHT y validar su potencial terapéutico, esperamos demostrar la amplia aplicabilidad de la MTC en el tratamiento de la enfermedad renal diabética.

Protocolo

Se seleccionaron para este estudio un total de treinta ratones diabéticos espontáneos tipo II (C57BL/Ksj db/db) de 6 semanas de edad y seis ratones control machos no diabéticos (db/m) con el mismo fondo genético. Los ratones se alojaron durante 2 semanas en un entorno estéril de grado SPF en el Centro de Experimentos Animales de la Universidad de Medicina Tradicional China de Changchun (número de licencia: SYXK (JI) 2023-0014). Durante este período, se les proporcionó una dieta de mantenimiento regular y agua estéril. La glucemia en ayunas se midió en los ratones db/db al principio y al final del período de 2 semanas, y solo se incluyeron en el experimento aquellos con resultados superiores a 11,1 mmol/L en ambas pruebas. El estudio fue aprobado por el Comité de Ética de la Universidad de Medicina Tradicional China de Changchun (número de identificación: 2024147).

1. Preparación de medicamentos

  1. Preparación de YHT (Tabla 1)
    1. Seleccione Rehmannia glutinosa (30 g), Ophiopogon japonicus (10 g), Morindae Officinalis Radix (10 g), Poria cocos (15 g) y Schisandra chinensis (6 g), y enjuague las hierbas con agua para eliminar las impurezas y el polvo de la superficie. A continuación, mezcle 71 g de hierbas crudas con 710 mL de agua destilada y sumérjalas en ollas de cerámica durante 60 min
    2. Después de hervir a 100 °C, baje la temperatura de la decocción a 80 °C durante 60 minutos y luego filtre las heces a través de dos capas de gasa médica. Almacene el líquido en el frigorífico a 4 °C.
    3. Agregue 710 mL de agua destilada a las heces anteriores y repita el remojo de los pasos 1.1.1 y 1.1.2 una vez; almacene el líquido en un refrigerador a 4 °C.
    4. Mezcle los dos líquidos medicinales anteriores de los pasos 1.1.2 y 1.1.3 y colóquelos en la bandeja de material del liofilizador al vacío. Ponga en marcha la bomba de vacío para eliminar el aire de la cámara de liofilización, ajuste la temperatura a -40 °C y manténgala durante 6 h para congelar el agua de la solución del medicamento en estado sólido. A continuación, ajuste la temperatura a -20 °C durante 36 h para sublimar el agua en forma de cristales de hielo en gas. Por último, ajuste la temperatura a 40 °C, manténgala durante 24 h para eliminar la humedad restante de la solución del medicamento, apague la bomba de calefacción y vacío, y retire el polvo liofilizado (polvo YHT).
    5. Pesar 0,4615 g, 0,923 g y 1,846 g de polvo de YHT liofilizado, suspender en 1 mL de solución salina y hacer la suspensión de YHT con las concentraciones de 0,4615 g/mL, 0,923 g/mL y 1,846 g/mL, respectivamente.
  2. Preparación de Valsartán
    1. Añadir valsartán (10,29 mg) en 50 mL de PEG300 y agitar bien hasta que se disuelva completamente.
    2. Añadir 50 mL de solución salina a la solución del paso 1.2.1 y agitar bien para homogeneizar y obtener una solución de valsartán con una concentración de 10,29 mg/mL.

2. Tratamientos farmacológicos

NOTA: El experimento se dividió en seis grupos: el grupo de control normal (CON), el grupo modelo (MOD), el grupo de control positivo de valsartán (POS), el grupo de dosis baja del YHT (YH-L), el grupo de dosis media del YHT (YH-M) y el grupo de dosis alta del YHT (YH-H). Los seres humanos adultos necesitan 71 g de YHT al día. De acuerdo con la fórmula de conversión de la dosis experimental de medicamentos para ratones y humanos, la dosis diaria para ratones fue de ~ 9,23 g / kg:

Dosis experimental equivalente para ratones (g/kg) = dosis humana (g)/peso corporal (70 kg) × 9,1

  1. Sujete firmemente la parte posterior de los ratones con la mano no dominante de modo que sus cabezas, cuellos y cuerpos estén en línea recta (para evitar forcejeos) y coloque la aguja de sonda nasogástrica de 1 ml adecuadamente en un ángulo similar a la curvatura fisiológica del esófago de los ratones. Empuje la aguja sonda nasogástrica a través de la comisura de la boca de los ratones, presiónela hacia abajo en la lengua, presiónela contra el paladar y empújela suavemente hacia adentro en el estómago.
  2. Empuje lentamente el medicamento con el dedo índice de la mano dominante y retire la aguja verticalmente para completar la operación de sonda nasogástrica.
    NOTA: La dosis del medicamento fue de 10 mL/kg durante un total de 4 semanas.
    1. Administrar 10 ml∙kg-1∙día-1 solución salina por sonda nasogástrica a ratones CON y MOD.
    2. Administrar 10,29 mg∙kg-1∙día-1 suspensión de valsartán por sonda nasogástrica a los ratones del grupo POS.
    3. Administrar las siguientes dosis de YHT por sonda nasogástrica a estos grupos: 4,615 g∙kg-1∙día-1 al grupo YH-L; 9,23 g∙kg-1∙día-1 al grupo YH-M; 18.46 g∙kg-1∙día-1 al grupo YH-H.

3. Evaluación de la eficacia de YHT

  1. Detección de índices bioquímicos en sangre y orina
    1. Después de 8 semanas de administración continua del fármaco, recoja 24 horas de orina de ratones utilizando una jaula metabólica, centrifugue la orina recolectada a 7.992 × g durante 10 minutos, retire el sobrenadante y mida el nivel de proteínas en la orina con el kit de prueba de proteínas urinarias.
    2. Agarre la parte posterior del mouse con la mano no dominante para fijar el mouse y use el dedo meñique y el dedo anular de la misma mano no dominante para fijar la cola del mouse. Esteriliza la punta de la cola del ratón con bolas de algodón de vapor de yodo. Con la mano dominante, sostenga una aguja de recolección de sangre para perforar rápidamente la punta de la cola del ratón, apriete desde la raíz de la cola del ratón hasta la punta de la cola y deje caer la sangre sobre el papel de prueba de glucosa en sangre.
    3. Con la mano no dominante, agarre la cola del ratón, mientras asegura el área escapular con el pulgar y el índice, asegurándose de que el abdomen del mouse mire hacia arriba. Con la mano dominante, sostenga una jeringa de 1 ml llena de sodio fenobarbital. Inserte la aguja (de 3-5 mm de profundidad) en la cavidad abdominal en un ángulo de 30-45°, apuntando a la región entre el ombligo y las extremidades posteriores, con la aguja dirigida hacia la cabeza. Retire lentamente el émbolo de la jeringa para verificar si hay sangre; Si se aspira sangre, vuelva a colocar la aguja en consecuencia.
    4. Inyecte lentamente la solución de pentobarbital sódico para asegurar una administración uniforme y retire la jeringa una vez completada la inyección. Espere 10 minutos, luego, con pinzas en la mano dominante, pellizque suavemente los dedos de las extremidades traseras del ratón para verificar si hay una respuesta. Si aún se observa una respuesta, administre una pequeña dosis adicional (10 mg/kg) según sea necesario.
      NOTA: Suponiendo que un ratón pesa 60 g y que la solución de fenobarbital es del 1% p/v, 0,06 mL es la dosis adicional que se debe administrar en caso de cualquier respuesta.
    5. Use tijeras para recortar los bigotes y el pelo alrededor de los ojos de los ratones, usando la mano no dominante para presionar la piel alrededor de los ojos de los que se deben quitar los globos oculares para que sobresalgan. Esterilice la piel alrededor de los globos oculares con etanol, use pinzas para extraer rápidamente los globos oculares para que la sangre gotee en los tubos de microcentrífuga (1,5-2 mL), incube los tubos a temperatura ambiente durante 10 minutos, centrifugue los tubos durante 10 minutos a 7,992 × g y extraiga la solución sobrenadante.
    6. Mida los niveles de expresión de creatinina sérica (Scr), nitrógeno ureico en sangre (BUN), albúmina (ALB), alanina aminotransferasa (ALT), aspartato aminotransferasa (AST), triglicéridos (TG) y colesterol total (TC) en suero de acuerdo con las instrucciones del kit.
  2. Separación de tejidos renales
    1. Después de la toma de muestras de sangre, fije los ratones en la placa quirúrgica en posición supina, corte el pelo de la región torácica anterior de los ratones, esterilice la región torácica anterior con etanol, corte la piel abdominal con tijeras y empuje a un lado los intestinos delgado y grueso para exponer los riñones.
    2. Retire el tejido del riñón de ratón, use pinzas hemostáticas para separar sin rodeos el periostio y coloque el riñón izquierdo en un congelador a -80 °C para su almacenamiento y el riñón derecho en un tubo de 20 ml que contenga una solución de paraformaldehído al 4% para fijar el riñón.
    3. Retire los riñones derechos del formaldehído después de 24 h, enjuague brevemente con agua destilada durante 5 minutos, deshidrate con un gradiente de etanol anhidro (100% → 95% → 85% → 75%, 5 min cada uno), transparente con xileno degradado (2 x 10 min), incruste en cera de parafina y deje que los bloques de cera se solidifiquen a temperatura ambiente21. A continuación, mételo en el congelador a -20 °C durante la noche.
    4. Retire el bloque de cera, córtelo en rodajas de 3 μm de grosor, colóquelo en agua para que se despliegue, luego sáquelo con un portaobjetos y colóquelo en un horno de temperatura constante a 40 °C para hornear durante 30 minutos y luego almacenarlo para su posterior análisis
  3. Análisis histopatológico renal
    1. Retire el riñón derecho, realice el desparafinado de xileno en gradiente y la deshidratación con etanol anhidro como se indicó anteriormente (paso 3.2.3) y lávese con agua destilada.
    2. Realice la tinción de acuerdo con las instrucciones de los kits de tinción de hematoxilina y eosina (H&E), tinción de ácido peryódico-Schiff (PAS) y tinción de Masson.
    3. Vuelva a realizar la deshidratación de etanol anhidro en gradiente y la transparencia del xileno como en el paso 3.2.3.
    4. Después de secar a temperatura ambiente, monte las secciones de tejido en los portaobjetos con un cubreobjetos utilizando goma neutra como medio de montaje. Observe los portaobjetos y obténgales una imagen bajo un microscopio óptico con un aumento de 400x.
  4. Análisis inmunohistoquímico del tejido renal
    1. Extraer el riñón derecho, desparafinar y deshidratar las secciones como se describe en el paso 3.2.3, colocarlas en una solución tampón de citrato de sodio de 10 mM (pH 6,0) y calentar (125 °C, 103 kPa) durante 5 min para la reparación del antígeno. Después de 10 minutos, retire las secciones, enfríe a temperatura ambiente y lávelas 3 x 5 minutos en 1x PBS.
    2. Coloque las secciones en una solución de peróxido de hidrógeno al 3% durante 10 minutos para bloquear la peroxidasa endógena y lave 3 x 5 min en PBS.
    3. Añade un 10% de suero de cabra gota a gota a las secciones, asegurándote de que el suero de cabra cubra uniformemente toda la sección. Coloque las secciones en una caja húmeda, incube a 37 °C durante 30 min y lave 3 x 5 min con PBS.
    4. Añada gota a gota los anticuerpos primarios COI-I (1:200), α-SMA (1:200), WT-1 (1:200), CD2AP (1:200) (ver Tabla de Materiales) e incube en una caja húmeda a 4 °C en el refrigerador durante la noche.
    5. Retirar la sección, lavar con PBS 3 x 5 min, añadir anticuerpo secundario (1:3.000) gota a gota, incubar a 37 °C durante 60 min y lavar con PBS durante 3 x 5 min.
    6. Agregue la solución de desarrollo de color 3,3'-diaminobenzidina (DAB) durante 10 minutos, lave la solución de desarrollo de color con agua destilada, incube con 100 μL de hematoxilina durante 5 minutos a temperatura ambiente y enjuague con agua destilada durante 5 minutos.
    7. Deshidrate, transparente y selle como se describe en el paso 3.2.3, y recoja las imágenes con un microscopio óptico.
  5. Análisis cuantitativo de la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (qRT-PCR)
    1. Tome ~ 100 mg de tejido renal congelado en un tubo homogeneizador de 10 ml, triélelo con un mortero hasta que no haya una masa de tejido obvia y luego agregue 1 ml de reactivo de extracción de ARN para la homogeneización.
    2. Añadir 250 μL de cloroformo, agitar en un mezclador de vórtice durante 10 s, incubar en hielo durante 5 min, centrifugar a 15.984 × g durante 10 min a 4 °C y pipetear la fase acuosa superior a un tubo nuevo.
    3. Añadir 500 μL de isopropanol a la fase acuosa, mezclar bien con un mezclador de vórtice durante 10 s e incubar la mezcla en hielo durante 5 min. A continuación, centrifugar a 15.984 × g durante 10 min. Retire con cuidado el sobrenadante y lave el pellet de ARN con 1 mL de etanol al 75%. Después de un breve vórtice, vuelva a centrifugar a 15.984 × g durante 10 minutos. Deseche el etanol y deje que la pastilla de ARN se seque al aire a temperatura ambiente.
    4. Agregue 30 μL de agua de pirocarbonato de dietilo para disolver el ARN y mida la absorbancia de la solución de ARN a 260 nm y 280 nm usando un espectrofotómetro para calcular la concentración de ARN.
      NOTA: La pureza del ARN se evalúa mediante la relación A260/A280 . Una relación ideal A260/A280 debe estar entre 1,8 y 2,0, lo que indica una buena pureza de ARN. Si la relación es inferior a 1,8, puede sugerir la presencia de contaminación por proteínas o fenol, y se requiere una purificación adicional, como la realización de una extracción adicional de fenol-cloroformo o una precipitación de etanol para eliminar los contaminantes.
    5. Mezclar 3 μg de ARN total, 4 μL de 4 gDNA Wiper Mix y ddH2O libre de ARNasa hasta un volumen final de 16 μL, centrifugar a 1.250 × g durante 10 s e incubar a 42 °C durante 2 min. Añadir 4 μL de transcriptasa inversa 5x a 16 μL de la solución anterior, centrifugar a 1.250 × g durante 10 s. Realice el programa de transcripción inversa a 50 °C (15 min) → 85 °C (5 s) → 4 °C (10 min). Almacene el ADNc sintetizado a -20 °C.
    6. Retire la solución de ADNc del congelador y realice la predesnaturalización a 90 °C (10 min), seguido de 40 ciclos de 94 °C (30 s) → 60 °C (30 s) → 72 °C (24 s), y finalmente lisar en el orden de 95 °C (15 s) → 60 °C (60 s) → 95 °C (350 s, 60 °C aumentar gradualmente a 95 °C a una velocidad de 0,1 °C/s).
    7. Calcular la expresión relativa de WT-1, CD2AP, PI3K, AKT, NF-κB e IL-1β utilizando el método 2-ΔΔCt basado en el valor Ct de cada muestra con Gapdh como referencia interna (ΔΔCt = valor Ct del gen diana - valor Ct del gen de referencia interno) (ver Tabla 2).
  6. Análisis del ensayo Western blot (WB)
    1. Tome ~ 100 mg de tejido renal congelado en un tubo homogeneizador de 10 mL, seguido de 500 μL de solución de lisis (inhibidor de la proteasa: inhibidor de la fosfatasa: RIPA= 1:1:100) y triélelo con un mortero lo suficiente hasta que no haya una masa de tejido evidente.
    2. Incubar el tubo en hielo durante 30 min, centrifugar a 15.984 × g durante 10 min, y aspirar el sobrenadante.
    3. Determine la concentración de proteínas de cada muestra mediante el ensayo BCA. En función de las concentraciones medidas, pipetee cantidades iguales de proteína total (por ejemplo, 30 μg) de cada grupo en tubos nuevos y ajuste el volumen final con PBS para garantizar la consistencia. A continuación, agregue 5 tampones de carga de proteínas, hierva a 100 °C durante 10 minutos y luego retire y enfríe a temperatura ambiente.
    4. Utilice electroforesis en gel SDS-PAGE al 12,5% para separar las proteínas. Primero, use 80 V para hacer que la muestra pase lentamente a través del gel de concentración, luego ajuste el voltaje a 120 V hasta que la muestra corra hasta el fondo del gel de separación y apague la unidad.
    5. Remoje el papel de filtro en el tampón de transferencia de membrana, use pinzas para sujetar una esquina de la membrana de PVDF y sumérjala en metanol para activarla. Retire el gel, use una placa de plástico para cortar el gel concentrado y el fondo del gel de separación, y luego, de acuerdo con la estructura de sándwich del papel de filtro / gel / membrana de PVDF / papel de filtro para configurar el dispositivo de transferencia de membrana (gel como polo negativo, membrana de PVDF como polo positivo), coloque la configuración en un tanque de transferencia de membrana lleno de tampón de transferencia preenfriado, rodéelo con cubitos de hielo para mantener una temperatura baja, y realice la transferencia a una corriente constante de 200 mA.
      NOTA: Decida el tiempo de transferencia de acuerdo con el peso molecular de la proteína (cuanto mayor sea el peso molecular, mayor será el tiempo de transferencia).
    6. Coloque la membrana de PVDF en el tampón de bloqueo, agite el tampón de bloqueo durante 90 minutos a temperatura ambiente y lave con TBST (50 mL de 20x TBS y 0,5 mL de Tween-20 por L de TBST) durante 3 x 5 min.
    7. Uso de diluyente de anticuerpo primario diluido anticuerpo primario: WT-1 (1:1.000), CD2AP (1:1.000), P-PI3K (1:1.000), P-AKT (1:1.000), P-NF-κB (1:1.000) e IL-1β (1:1.000), agregue el anticuerpo primario en la membrana de PVDF e incube en una caja húmeda en un refrigerador a 4 °C durante la noche (consulte la tabla de materiales).
    8. Retire la membrana de PVDF del refrigerador a 4 °C, lave con TBST durante 3 x 5 min, use diluyente de anticuerpo secundario diluya el anticuerpo secundario (1:10000), agregue la incubación de anticuerpos secundarios a temperatura ambiente durante 60 min, lave con TBST durante 3 x 5 min, coloque la membrana de PVDF en el generador de imágenes de quimioluminiscencia y agregue uniformemente el líquido luminiscente ECL gota a gota (A: B = 1:1).

4. Análisis farmacológico de red de YHT para el tratamiento de DKD

  1. Cribado de principios activos y dianas de YHT
    1. Determinar los principios activos de Radix Rehmanniae Praeparata, Morindae Officinalis Radix, Poria y Schisandra Chinensis utilizando la base de datos TCMSP (https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php) y de Maitake de la base de datos BATMAN-TCM (http://bionet.ncpsb.org/batmantcm). Establezca la biodisponibilidad oral (OB) ≥ 30% y la similitud con el fármaco (DL) ≥ 0,18 como criterios de selección para identificar los ingredientes activos.
    2. Busque en la base de datos de TCMSP (https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php) los objetivos de acción de los ingredientes activos de los MTC anteriores.
    3. Resta importancia a los objetivos de los ingredientes activos anteriores e intégralos en una lista para su posterior análisis. Estandarizar los nombres de las dianas utilizando la base de datos de proteínas Uniprot (https://www.uniprot.org).
  2. Construcción de la red diana de los principios activos de YHT
    1. Importe los ingredientes activos y sus objetivos correspondientes en el software: Construya la red "ingrediente activo-objetivo" seleccionando Archivo | Importación | Red y carga de los datos relevantes.
    2. Realice un análisis de topología de red navegando a Herramientas | Análisis de redes | Analice la red para visualizar las relaciones entre los fármacos, los ingredientes activos, los objetivos y las enfermedades. En la visualización de red, los nodos representan los ingredientes activos y los bordes representan las interacciones entre los ingredientes activos y los objetivos.
  3. Cribado de dianas relacionadas con DKD
    1. Utilizando la enfermedad renal diabética como término de búsqueda y estableciendo la especie como humana, se seleccionan los objetivos relacionados con la DKD de las siguientes bases de datos: base de datos GeneCards (https://www.genecards.org); Base de datos OMIM (http://www.omim.org); Base de datos TTD (https://www.ttd.cn); Base de datos DrugBank (http://www.drugbank.ca); Base de datos DisGeNET (http://www.disgenet.org).
    2. Después de obtener los resultados de las cinco bases de datos, combínelas en una hoja de cálculo y elimine los duplicados mediante la función Eliminar duplicados en el menú Datos , asegurándose de que solo se conserven los nombres únicos de los destinos relacionados con DKD.
  4. Construcción de PPI (interacción proteína-proteína) y cribado de dianas principales
    1. Utilice el software de hoja de cálculo para identificar los objetivos de intersección de YHT y DKD ingresando la lista de objetivos YHT en una columna y la lista de objetivos DKD en otra. Aplique formato condicional para resaltar las entradas comunes en ambas columnas, identificando así los destinos de intersección.
    2. Abra el sitio web de la base de datos de cadenas (https://cn.string-db.org/), seleccione Entrada | Pegar/Cargar para importar los datos por lotes y establecer el umbral Grado ≥ 1 para filtrar los objetivos libres (objetivos sin interacciones) en la red.
    3. Seleccionar archivo | Importación | e importe los objetivos de intersección filtrados en el software para crear la visualización final.
    4. Vaya a Análisis de red | Analice la red y filtre los objetivos principales de YHT-DKD en función del valor de grado.
  5. Análisis funcional de ontología génica (GO) y análisis de enriquecimiento de la vía de la enciclopedia de genes y genomas de Kioto (KEGG)
    1. Abra la plataforma Metascape visitando http://metascape.org/gp/index.html, seleccione Iniciar análisis para comenzar, pegue la lista de objetivos para YHT y DKD en el cuadro de entrada de la sección Análisis personalizado , establezca la especie en Homo sapiens en el menú desplegable, elija Análisis personalizado y establezca el umbral de valor P en <0.01, y haga clic en Enviar para ejecutar el análisis.
    2. Una vez que se devuelvan los resultados de Metascape, vaya a http://www.bioinformatics.com.cn/, seleccione Herramientas | término GO de enriquecimiento, pegue los términos GO de los resultados y haga clic en Enviar para generar gráficos de burbujas. Visualice los 10 términos GO principales clasificándolos según el valor P.
    3. Ordene las rutas KEGG en función del valor P de los resultados del análisis de Metascape. Vaya al mismo sitio web de Microbiology (http://www.bioinformatics.com.cn/), seleccione go kegg pathway enrichment, pegue las 10 mejores rutas KEGG seleccionadas y haga clic en Enviar para visualizar los diagramas de burbujas KEGG.

5. Análisis estadístico

  1. Si los datos siguen una distribución normal y las varianzas son homogéneas, utilice el ANOVA de un factor. Si las varianzas no son homogéneas, utilice la prueba T3 de Dunnett o una prueba t de muestra independiente.
  2. Para los datos que no siguen una distribución normal, utilice la prueba de suma de rangos de métodos no paramétricos.
  3. Considere que P < 0,05 son estadísticamente significativos.

Resultados

Mejora de la glucosa en sangre, la función hepática y renal, y los trastornos del metabolismo lipídico en ratones con DKD
Después de 8 semanas de administración, diferentes dosis de YHT redujeron significativamente los niveles de glucosa en sangre aleatoria, UTP 24 h, Scr y BUN, mejoraron la función renal (Figura 1A-D); aumentó el nivel de ALB; redujeron los niveles de ALT y AST; mejora de la función hepática (Figura 1E-G); redujeron los niveles de TC y TG; y mejoró la regulación del metabolismo lipídico (Figura 1H,I). Los resultados anteriores indicaron que el YHT tenía efectos protectores sobre la glucosa en sangre, la función hepática y renal, y la regulación lipídica.

Mejoría de la lesión histopatológica renal en ratones con DKD
Para probar si la YHT podía mejorar la lesión renal en ratones con DKD, se examinó el alcance de la lesión patológica en los tejidos renales mediante tinción de H&E, PAS y Masson, así como IHC. La tinción con H&E y PAS reveló atrofia glomerular, ensanchamiento de la región de la túnica albugínea, hinchazón y desprendimiento de células epiteliales tubulares, infiltración de células inflamatorias intersticiales y depósito evidente de glucógeno glomerular en el grupo MOD (Figura 2A,B). La tinción de Masson mostró un aumento significativo de las fibras de colágeno azul en los riñones del grupo MOD en comparación con el grupo CON (Figura 2C,D). IHQ mostró que los porcentajes de áreas positivas para COI-I y α-SMA fueron significativamente más altos en el grupo MOD que en el grupo CON (Figura 2E-G). Por el contrario, después del uso de YHT y POS, la atrofia glomerular, el ensanchamiento de la zona anclada, la hinchazón y el desprendimiento de las células epiteliales tubulares, el grado de infiltración de células inflamatorias intersticiales y el depósito de glucógeno glomerular se aliviaron significativamente; el área de fibras de colágeno azul se redujo significativamente; y los porcentajes de áreas positivas para COI-I y α-SMA disminuyeron significativamente. Los resultados anteriores indicaron que YHT podría atenuar la lesión patológica renal y la fibrosis renal en ratones con DKD.

Atenuación de la lesión de los podocitos en ratones DKD
El daño de las células del pie en ratones DKD se observó mediante IHC, PCR y WB. Los resultados de IHQ mostraron que los niveles de expresión de las proteínas marcadoras funcionales de las células del pie, CD2AP y WT-1, disminuyeron significativamente en el grupo MOD en comparación con el grupo CON, lo que indica que las células renales del pie estaban dañadas. El tratamiento con YHT aumentó los niveles de expresión de CD2AP y WT-1 y redujo el daño a las células del pie (Figura 3A-C). Los resultados de la PCR y WB mostraron que los niveles relativos de expresión de ARNm y proteínas de las proteínas marcadoras funcionales de las células del pie, CD2AP y WT-1, disminuyeron significativamente en el grupo MOD en comparación con el grupo CON, y los niveles relativos de expresión de ARNm y proteínas de CD2AP y WT-1 aumentaron significativamente después del tratamiento con YHT (Figura 3D-H). Los resultados anteriores indicaron que YHT podría atenuar la lesión de los podocitos en ratones DKD.

Elucidación de las posibles dianas y vías de señalización relacionadas con los efectos de la YHT sobre la enfermedad renal diabética a través de la farmacología en red
Los ingredientes activos de YHT (291) se examinaron a través de las bases de datos TCMSP y BATMAN-TCM, de los cuales 39 ingredientes activos cumplieron los criterios de OB ≥ 30% y DL ≥ 0,18. Se realizaron búsquedas en los ingredientes activos en la base de datos para identificar sus dianas, y tras fusionar y eliminar los valores duplicados, se obtuvieron un total de 303 dianas (Figura 4A). Después de fusionar los resultados de cinco bases de datos, incluidas GeneCards, OMIM, TTD, Drugbank y DisGeNET, y eliminar los valores duplicados, finalmente se obtuvieron 1.867 objetivos relacionados con DKD. A continuación, se utilizó http://www.bioinformatics.com.cn/ para interceptar los ingredientes activos YHT cribados con los objetivos DKD, lo que dio como resultado 84 objetivos que se cruzaban (Figura 4B). Estos 84 objetivos se importaron al software Cytoscape para dibujar un diagrama de red PPI, y se identificaron posibles objetivos clave para el tratamiento YHT de la DKD, incluidos AKT, IL-1 β, CASP3, APOE y JUN (Figura 4C). El análisis de enriquecimiento funcional de GO arrojó un total de 1.246 ítems, lo que indica que YHT puede ejercer efectos terapéuticos sobre la enfermedad renal diabética mediante la regulación de procesos biológicos como la respuesta a la hormona y las funciones moleculares, incluida la actividad de homodimerización de proteínas y la actividad de oxidorreductasa, así como componentes celulares como balsas de membrana y microdominios de membrana (Figura 4D). Se obtuvieron un total de 263 resultados de enriquecimiento de KEGG, principalmente involucrando la vía de señalización AGE-RAGE en complejos diabéticos, enfermedad hepática alcohólica, lípidos y vía de aterosclerosis. Con base en el valor P, se seleccionaron los 10 mejores resultados para dibujar un gráfico de burbujas de visualización KEGG (Figura 4E). La vía de señalización AGE-RAGE está altamente enriquecida en complejos diabéticos, y múltiples objetivos centrales en el PPI, como PI3K, AKT e IL-1β, están enriquecidos en esta vía. Por lo tanto, se seleccionó esta vía de señalización para su posterior validación.

Atenuación de la lesión de los podocitos mediante la inhibición de la vía de señalización PI3K/AKT/NF-κB
Los niveles de expresión de genes y proteínas relacionados con la vía de señalización PI3K/AKT/NF-κB se examinaron más a fondo mediante PCR y WB. Los resultados de la PCR mostraron que los niveles relativos de expresión de ARNm de Pi3k, Akt, Nf-κb e Il-1β en el grupo MOD fueron significativamente elevados en comparación con el grupo CON y disminuyeron significativamente después de la administración de YHT (Figura 5A-D). Los resultados del WB mostraron que los niveles relativos de proteínas de P-PI3K, P-AKT, P-NF-κB e IL-1β también estaban significativamente elevados en el grupo MOD en comparación con el grupo CON, mientras que disminuyeron significativamente después de la administración de YHT (Figura 5E-I). Estos resultados sugirieron además que YHT podría inhibir la vía de señalización PI3K/AKT/NF-κB al atenuar la lesión de los podocitos en ratones DKD.

figure-results-1
Figura 1: Mejora de la glucosa en sangre, las funciones hepáticas y renales, y los trastornos del metabolismo lipídico en ratones con DKD. Efectos del YHT sobre (A) la glucosa en sangre aleatoria; (B-D) función renal, incluyendo proteínas urinarias de 24 horas, creatinina en sangre y nitrógeno ureico; (E-G) función hepática, incluyendo albúmina sérica, alanina aminotransferasa y aspartato aminotransferasa; y la regulación del metabolismo de los lípidos (H,I), incluidos el colesterol total y los triglicéridos. Los datos se expresan como medias ± desviaciones estándar de seis muestras independientes, en comparación con el grupo en blanco, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, y en comparación con el grupo modelo, #p < 0,05, ##p < 0,01, ###p < 0,001, estas notaciones estadísticas se utilizan de manera consistente en todas las figuras. Abreviaturas: YHT = yinhuo Tang; DKD = enfermedad renal diabética; ALB = albúmina; ALT = alanina aminotransferasa; AST = aspartato aminotransferasa; CT = colesterol total; TG = triglicéridos; CON = grupo de control; MOD = grupo de modelos; POS = valsartán Grupo de control positivo; YH-L = grupo de dosis baja de la YHT; YH-M = grupo de dosis media de la YHT; YH-H = grupo de dosis alta del YHT. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-2
Figura 2: Mejoría del daño histopatológico de los riñones en ratones con enfermedad renal coronaria. (A,B) Histología renal mediante tinción de H&E y PAS (barra de escala = 20 μm); (C) tinción de Masson para observar el grado de fibrosis renal y (D) análisis semicuantitativo mediante el software ImageJ; (E-G) Análisis semicuantitativo de los niveles relativos de expresión de COI-I y α-SMA en tejidos renales utilizando IHQ y software ImageJ (barra de escala = 20 μm). Abreviaturas: YHT = yinhuo Tang; DKD = enfermedad renal diabética; H&E = tinción de hematoxilina y eosina; PAS = Tinción de ácido peryódico-Schiff; COI-I = Colágeno tipo I; α-SMA = actina de músculo α-liso; CON = grupo de control; MOD = grupo de modelos; POS = valsartán Grupo de control positivo; YH-L = grupo de dosis baja de la YHT; YH-M = grupo de dosis media de la YHT; YH-H = grupo de dosis alta del YHT. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-3
Figura 3: Atenuación de la lesión de los podocitos en ratones DKD. (A-C) IHQ detectó los niveles relativos de expresión de CD2AP y WT-1 en tejidos renales (barra de escala = 20 μm); (D,E) La PCR detectó la expresión relativa de ARNm de CD2AP y WT-1 en los tejidos renales, y el análisis semicuantitativo se realizó con el software Image J; (F-H) WB detectó los niveles relativos de expresión proteica de CD2AP y WT-1 en tejidos renales, y el análisis semicuantitativo se realizó mediante el software ImageJ. análisis cuantitativo utilizando el software Image J. Abreviaturas: YHT = yinhuo Tang; DKD = enfermedad renal diabética; IHQ = inmunohistoquímica; WB = Western blot; CD2AP = proteína asociada a CD2; WT-1 = tumor de Wilms 1; CON = grupo de control; MOD = grupo de modelos; POS = valsartán Grupo de control positivo; YH-L = grupo de dosis baja de la YHT; YH-M = grupo de dosis media de la YHT; YH-H = grupo de dosis alta del YHT. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-4
Figura 4: Análisis farmacológico de red de YHT para el tratamiento de la enfermedad renal diabética. (A) Gráfico objetivo de ingrediente activo-enfermedad de YHT para el tratamiento de la enfermedad renal dal. (B) Diagrama de Venn de los objetivos que se cruzan de YHT y DKD. El color naranja representa el número de objetivos relevantes para DKD; el color verde representa el número de dianas terapéuticas de los ingredientes activos YHT; y la parte que se cruza representa el número de objetivos que se intersectan (el número de objetivos de YHT para DKD). (C) Diagrama de red PPI de los objetivos que se cruzan de YHT y DKD. (D) Análisis de enriquecimiento de GO de los 10 objetivos más importantes de YHT para el tratamiento de la enfermedad renal diabética. (E) Análisis de enriquecimiento KEGG de los 10 objetivos más importantes para el tratamiento de YHT de la enfermedad renal diabética. Abreviaturas: YHT = yinhuo Tang; DKD = enfermedad renal diabética; PPI = interacción proteína-proteína; GO = Ontología de genes; KEGG = Enciclopedia de Genes y Genomas de Kioto; CON = grupo de control; MOD = grupo de modelos; POS = valsartán Grupo de control positivo; YH-L = grupo de dosis baja de la YHT; YH-M = grupo de dosis media de la YHT; YH-H = grupo de dosis alta del YHT. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 5: Atenuación de la lesión de los podocitos mediante la inhibición de la vía de señalización PI3K/AKT/NF-κB. (A-D) PCR para detectar la expresión relativa de ARNm de Pi3k, Akt, Nf-κb e Il-1β en tejidos renales. (E-I) WB para detectar los niveles relativos de expresión proteica de P-PI3K, P-AKT, P-NF-κB e IL-1β en tejidos renales, y se realizó un análisis semicuantitativo utilizando el software ImageJ. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Composición de Yinhuo Tang. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 2: Detalles de los cebadores qRT-PCR. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Discusión

Uno de los pasos críticos en este protocolo es el uso de la farmacología de red para identificar los componentes activos de YHT y predecir sus interacciones con los objetivos relacionados con DKD. Este paso implica el análisis de datos biológicos a gran escala utilizando herramientas bioinformáticas como bases de datos (por ejemplo, TCMSP, DrugBank y GeneCards) para mapear las vías moleculares y las posibles redes biológicas afectadas por YHT. Esta predicción fue seguida por una validación experimental a través de modelos animales de DKD, donde se probaron los efectos hipotéticos de YHT en estas vías. La integración de las predicciones computacionales con los datos es un aspecto crucial de nuestro enfoque, ya que mejora la fiabilidad de nuestros hallazgos y cierra la brecha entre las predicciones teóricas y los resultados prácticos. Además, el uso de modelos animales es otro paso crítico en la validación de los efectos terapéuticos de YHT. La enfermedad renal diabética en animales imita de cerca la progresión de la enfermedad humana, lo que permite una evaluación eficaz del impacto de la YHT tanto en el daño glomerular como en la fibrosis renal. El seguimiento meticuloso de los marcadores de función renal como Scr, BUN y proteinuria, junto con las evaluaciones histopatológicas, es esencial para evaluar la eficacia terapéutica de la YHT.

Si bien nuestro protocolo combina potentes métodos computacionales y experimentales, existen varias limitaciones. En primer lugar, el enfoque de farmacología de red se basa en gran medida en los datos disponibles en bases de datos públicas, y puede haber sesgos o falta de información con respecto a ciertos componentes de las vías relacionadas con YHT o DKD. Aunque hicimos referencias cruzadas de varias bases de datos para mitigar este problema, es posible que se pasen por alto algunas interacciones relevantes. En segundo lugar, este estudio solo exploró el mecanismo de YHT en la reducción de la lesión de los podocitos a nivel de animales de experimentación, y se necesitan experimentos celulares y estudios clínicos de muestras grandes para validar los resultados experimentales. Por último, la farmacología en red mostró que el tratamiento de la enfermedad renal diabética con YHT también se asoció con la enfermedad hepática alcohólica, el metabolismo de los lípidos y la aterosclerosis, y la regulación de la lipólisis en los adipocitos. Este estudio solo verificó si la modulación de la vía de señalización PI3K/AKT/NF-κB por YHT podría retrasar la progresión de la DKD; Los resultados necesitan una mayor exploración.

La vía de señalización PI3K/AKT/NF-κB es una importante vía de señalización intracelular involucrada en la regulación de una variedad de procesos biológicos como el crecimiento celular, la proliferación, la supervivencia y las respuestas inflamatorias22. Los estudios han demostrado que desempeña un papel importante en la progresión de la lesión del pediculocito23,24. NF-κB es un componente importante de la vía PI3K/Akt y participa en la transmisión de una variedad de señales intracelulares y en la expresión de múltiples genes. La inhibición de la vía de señalización PI3K/AKT conduce a la degradación de la proteína inhibidora de NF-κB IκB, que a su vez conduce a la fosforilación de NF-κB y su entrada en el núcleo, y a la producción de una variedad de quimiocinas y factores inflamatorios, lo que conduce a la lesión de los podocitos y a la fibrosis intersticial renal25. Algunos estudios han demostrado que la inhibición de la activación de la vía de señalización PI3K/AKT/NF-κB puede suprimir eficazmente las respuestas inflamatorias y la fibrosis renal, retrasando así la progresión de la enfermedad renal diabética26.

Los estudios han demostrado que los trastornos del metabolismo lipídico desempeñan un papel importante en la aparición y progresión de la enfermedad renal diabética27,28. Los pacientes con enfermedad renal diabética a menudo muestran un metabolismo anormal de los lípidos, incluidos niveles elevados de LDL, TG y acumulación de ácidos grasos. Estas alteraciones están estrechamente relacionadas con cambios patológicos como la glomeruloesclerosis y la fibrosis tubulointersticial 29,30. Las investigaciones indican que los trastornos del metabolismo lipídico pueden promover la progresión de la enfermedad renal diabética a través de múltiples vías de señalización31,32. En primer lugar, la vía de señalización mTOR es una vía clave en la regulación del metabolismo de los lípidos; Su sobreactivación conduce a lesión podocitaria y proteinuria 33,34. Un ambiente rico en grasas puede promover la acumulación de lípidos a través del eje PI3K/AKT/mTOR, induciendo la apoptosis de los podocitos y, en última instancia, exacerbando el deterioro de la función renal 35,36,37. En segundo lugar, la proteína quinasa activada por AMP (AMPK), un regulador crítico del metabolismo energético celular, protege al riñón de las alteraciones metabólicas al promover la oxidación de ácidos grasos, inhibir la síntesis de lípidos y reducir la lipotoxicidad 38,39,40. La inactivación de AMPK se considera un mecanismo importante en la progresión de la DKD. Los activadores de la AMPK, como la metformina, han mostrado importantes efectos renoprotectores y representan una diana terapéutica prometedora para la DKD41.

Por último, los estudios han demostrado que los receptores activados por proliferadores de peroxisomas α/γ (PPARα/γ) desempeñan un papel esencial en la regulación del metabolismo lipídico y la enfermedad renal diabética42,43. La activación de PPARα promueve la oxidación de ácidos grasos y reduce la acumulación de lípidos en el riñón, mientras que PPARγ mejora la sensibilidad a la insulina y ejerce efectos antiinflamatorios44,45. Los agonistas de PPAR, como los fibratos, han mostrado beneficios clínicos potenciales en la reducción de la proteinuria en pacientes con EKD46. En conclusión, los trastornos del metabolismo lipídico influyen en la progresión patológica de la enfermedad renal rendida a través de múltiples vías de señalización. Las interacciones entre estas vías forman una compleja red patológica. Dirigirse al metabolismo de los lípidos podría proporcionar nuevas estrategias terapéuticas para la enfermedad renal diabética.

La familia de las caspasas (CASP), una familia de proteasas específicas de cisteína, es un grupo de proteasas que se encuentran ampliamente en las células y están principalmente involucradas en la regulación de la apoptosis y las respuestas inflamatorias47,48. Los miembros de la familia CASP comparten similitudes estructurales y generalmente existen como zimógenos, que se activan a través de una cascada de reacciones, desencadenando así la apoptosis, la piroptosis y otros procesos de muerte celular programada49. Entre ellas, CASP3, un miembro de la familia de las caspasas (CASP) con una estructura conservada típicamente presente como un zimógeno, es una proteasa clave en la fase de ejecución de la apoptosis que cataliza la escisión de proteínas celulares específicas, desempeñando así un papel crítico en la regulación del crecimiento celular normal y el mantenimiento de la homeostasis interna50,51. La caspasa-8 actúa como iniciador de cascadas apoptóticas y participa en la modulación de las respuestas inflamatorias a través de la activación de NPK, que es un factor clave en la regulación del crecimiento celular. La caspasa-8 actúa como iniciador de la cascada apoptótica y también participa en la regulación de la respuesta inflamatoria mediante la activación de vesículas inflamatorias como NLRP1 y NLRP3, desencadenando así la piroptosis celular52. Sobre la base del importante papel de la vía de señalización CASP en la mediación de la apoptosis y la piroptosis en células pedunculadas, se justifican exploraciones más profundas sobre la relación entre YHT, CASP3/8, células pediculadas y DKD en el futuro.

En comparación con los enfoques convencionales de descubrimiento de fármacos que suelen hacer hincapié en mecanismos de un solo objetivo bien definidos para la claridad y la previsibilidad de la regulación, nuestra estrategia basada en la farmacología de la red permite una exploración sistemática de las interacciones multiobjetivo inherentes a las formulaciones de MTC como YHT. Si bien esta complejidad refleja la naturaleza holística de la medicina tradicional china y su potencial amplitud terapéutica, también subraya el desafío de los efectos no deseados fuera del objetivo, que requieren una validación e interpretación cuidadosas. Al considerar la naturaleza multi-objetivo y multi-vía de la acción de YHT, proporcionamos una comprensión más holística de sus efectos terapéuticos en el tratamiento de la DKD. Además, la farmacología en red permite predecir las posibles interacciones farmacológicas y los efectos secundarios, lo que es crucial para garantizar la seguridad y la eficacia de las terapias multicomponente. Los tratamientos actuales para la enfermedad renal diabética se centran en gran medida en controlar los síntomas o ralentizar la progresión, en lugar de abordar los mecanismos subyacentes de la enfermedad. Al integrar herramientas bioinformáticas modernas con validación experimental, este estudio subraya la importancia de la biología de sistemas en la mejora de la eficacia de la medicina tradicional china, particularmente en enfermedades crónicas como la enfermedad renal diabética.

De cara al futuro, esta técnica es muy prometedora para ampliar el alcance de la farmacología de red en la investigación de la medicina tradicional china, especialmente en el tratamiento de enfermedades complejas como la enfermedad renal diabética. Nuestro enfoque podría aplicarse para explorar otras fórmulas de MTC o hierbas individuales por su potencial terapéutico en el tratamiento de enfermedades renales, enfermedades cardiovasculares y trastornos metabólicos. Además, esta metodología podría extenderse para investigar la reutilización de fármacos mediante la identificación de nuevos usos para los medicamentos existentes en el tratamiento de la enfermedad renal diabética. Otra posible aplicación de nuestro enfoque se encuentra en la medicina personalizada. Al incorporar datos específicos del paciente, la farmacología de red podría utilizarse para adaptar las estrategias de tratamiento de la MTC en función de los perfiles moleculares individuales, mejorando la eficacia del tratamiento y minimizando los efectos adversos.

Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por la Fundación Provincial de Ciencias Naturales de Jilin (No.20210101201JC).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Etanol anhidroChina National Pharmaceutical Group Chemical Reagent Co., Ltd
Universidad de Medicina Tradicional China de ChangchunSYXK (JI) 2023-0014
Base de datos BATMAN-TCMhttp://bionet.ncpsb.org/batmantcm - Kit de
ensayo de proteínas BCASolarbioPC0020
Tampón de bloqueoBeyotimeP0023B
Macetas de cerámicaMideaMD-DG30E103
Sistema de imágenes de quimioluminiscenciaHangzhou Shenhua Technology Co., LtdSH-523
CloroformoChina National Pharmaceutical Group Chemical Reagent Co., Ltd10006818
Cytoscape 3.8.0 software----
Kit de reactivos DABServicebioG1212-200T
ratones db/dbNanjing Junke Biological sociedad limitadaSCXK (Su) 2020-009
Afinidadsolución de sustrato ECLKF8003
Olla eléctrica de baño de agua a temperatura constanteFisaff Instrument (Hebei) Co., LtdDK-20000-IIIL
Fuente de alimentación del instrumento de electroforesisBeijing Longfang Tecnología Co., LtdLF-600S Homogeneizador
de vidrioSolarbioYA0852
Portaobjetos de vidrioNantong Meiweide Life Science Co., LtdPC2-301
Cabra Anti-Conejo IgG HRP (anticuerpo secundario)AfinidadS00011:3000 para IHC, 1:10000 para WB
HematoxilinaWuhan Lingsi Biotechnology Co., LtdG1140
Centrífuga refrigerada de alta velocidad Hunan Kecheng Instrument Equipment Co., LtdH1-16KR
HiScript II Q RT SuperMix para qPCR (+limpiador de ADNg)VAZYMER223-01
Agitador horizontalJiangsu Haimen Qilin Bell Instrument Manufacturing Co., LtdTS-1
Sistema de imagenNikonNikon DS-U3
Agitador de calentamiento magnético digital inteligenteHangzhou Miou Instrument Co., LtdTP-350E +
IsopropanolChina National Pharmaceutical Group Reagent Co., Ltd80109218
(20-120KD)GenScriptM00521
Kit de tinciónMasson Gasa médica BASO
Jianerkang Medical--
Metascape plataformahttp://metascape.org/gp/index.html--
MetanolThermo67-56-1
Sitio web de microbiologíahttp://www.bioinformatics.com.cn/-microscopio
NikonECLIPSE Ci
de microondasGalanz Electrical Appliance Co., LtdP70D20TL-P4
Molinillo de tejido de muestra múltipleShanghai Jingxin Industrial Desarrollo Co., LtdTissuelyser-24L
Balanza electrónica analítica multifuncionalChangzhou Lucky Electronic Equipment Game CompanyFA1204
Resina neutraWuhan Lingsi Biotechnology Co., LtdG8590
Suero de cabra normalSolarbioSL038
hornoShanghai Huitai Instrument Manufacturing Co., LtdDHG-9140A
Centrífuga de palmaWuhan Lingsi Biotechnology Co., LtdD1008E
Kit de tinción PASBASOBA4114B
Rebanadora patológicaShanghai Leica Instrument Co., LtdRM2016
PBSSolarbioP1020
Instrumento de PCRHangzhou Miou Instrument Co., LtdPR-96
Pistola de pipetasDragonKE0003087/KA0056573
Tampón de dilución de anticuerpos primariosBeyotimeP0023A
Complejo inhibidor de la fosfatasa proteicaMeilunbioMB12707-1
(0,22 μ m)SolarbioISEQ00010
Diluyente rápido de anticuerpos primarios/secundariosSolarbioA1811
Conejo anti-CD2APAfinidadDF22981:200 para IHC, 1:1000 para WB
Conejo anti-COI-IAfinidadDF121491:200 para IHC, 1:1000 para WB
Conejo anti-IL-1 y beta;AfinidadAF51031:1000 para WB
Rabbit anti-P-AKTAfinidadAF00161:1000 para WB
Rabbit anti-P-NF-Κ bAfinidadAF32191:1000 para WB
Conejo anti-P-PI3KAfinidadAF32421:1000 para WB
Conejo anti-WT-1AfinidadDF63311:200 para IHC, 1:1000 para WB
Conejo anti-α-SMAAfinidadAF10321:200 para IHC, 1:1000 para WB
Conejo anti-β-ActinaAfinidadAF70181:1000 para WB
Sistema de PCR en tiempo realABIQuantStudio 6
Tampón de lisis RIPAMeilunbioMA0151
DDH2O sin RNasaSolarbioR1600
Tampón de dilución de anticuerpos secundariosBeyotimeP0023D
Portaobjetos y cubreobjetosJiangsu Shitai Experimental Equipment Co., Ltd10212432C
SPSS 26.0 software----Sitio web de
cadenas https://cn.string-db.org/--Instrumento de
agua súper puraZhiang Instrument (Shanghai) Co., LtdClever-S15
Taq Plus DNA PolymerasaTIANGENET105-02
TCMSP database https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php-
tejidosHermosa paredMB-96
TrizolAmbion15596-026
Tween 20China National Pharmaceutical Group Chemical Reagent Co., Ltd30189328
Espectrofotómetro visible ultra micro UVHangzhou Miou Instrument Co., LtdND-100
Base de datos de proteínas Uniprothttps://www.uniprot.org--
Microscopio óptico verticalNikonNikon Eclipse CI
Kit de prueba de proteínas urinariasNanjing Jiancheng Bioengineering Research InstituteC035-2
liofilizador al vacíoNingbo Xinzhi Biotechnology Co.A01-1-NA0959
Tanque de electroforesis verticalBeijing 61 Fábrica de instrumentosDYCZ-24DN
Mezclador de vórticeWuhan Lingsi Biotechnology Co., LtdMX-F
Tampón de bloqueo occidentalSolarbioSW3010
xilenoChina National Pharmaceutical Group Chemical Reagent Co., Ltd10023418
YihongWuhan Lingsi Biotecnología Co., LtdE8090
Centro de Experimentación Animal 10009218 de marcador de BA4079B horno Membrana de PVDF la base de datos de Molinillo de

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