Estudio de las interacciones entre las células mieloides y las células T con CAR in vitro e in vivo

La terapia con células T con receptor de antígeno quimérico autólogo (CART) ha logrado éxitos clínicos en el tratamiento de neoplasias hematológicas recidivantes o refractarias, lo que ha llevado a la aprobación de la FDA de EE. UU. de seis productos CART dirigidos al antígeno de maduración de células CD19 o B (BCMA)¹. A pesar de la impresionante actividad inicial de la terapia celular CART, la mayoría de los pacientes recaen dentro de los primeros 1-2 años después del tratamiento². Se han identificado varios mecanismos de resistencia a CART, incluida la aptitud subóptima de las células T, el escape de antígenos y la mala persistencia de CART, así como la inhibición mediada por el microambiente tumoral inmunosupresor (TME)^2,3. Las células mieloides, como los monocitos y los macrófagos, a menudo comprenden una parte significativa del TME y se ha demostrado que son inhibidores importantes de otras células inmunitarias, incluidas las células T ^4,5. Los efectos perjudiciales de las células mieloides en el contexto de la eficacia terapéutica de las células CART se han descrito en modelos preclínicos y en ensayos clínicos de tumores hematológicos y sólidos ^3,6. La inhibición mediada por mieloides puede ocurrir desde el comienzo del proceso de fabricación de CART: se ha demostrado que los monocitos en el producto de aféresis inicial inhiben la expansión de CART ex vivo ^7,8. Dada la evidencia acumulada de inhibición de CART mediada por mieloides, muchos estudios han tenido como objetivo diseñar células CART para atacar y eliminar macrófagos inmunosupresores en TME para mejores respuestas inmunes⁵. Sin embargo, los mecanismos detrás de las interacciones entre las células CART y los macrófagos inmunosupresores aún no están completamente dilucidados. Además, existen modelos limitados de xenoinjertos disponibles públicamente de estas interacciones. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de modelos que estudien las interacciones entre macrófagos humanos y células CART tanto in vitro como en modelos de ratón.

Aquí, describimos un método en el que las células CART (CART19) dirigidas a CD19 humanas se cocultivan con células tumorales CD19⁺ y macrófagos similares a M2 polarizados ex vivo . Además, informamos un modelo de ratón de xenoinjerto en el que los ratones inmunodeficientes se injertan subcutáneamente con células diana y macrófagos humanos, lo que permite la evaluación de inmunoterapias de interés en un entorno con macrófagos inmunosupresores. Específicamente, analizamos la proliferación específica del antígeno CART en presencia o ausencia de macrófagos inmunosupresores in vitro, mostrando una inhibición significativa en la expansión de células T tanto en placas transwell como en placas de cocultivo directo. En nuestro modelo de xenoinjerto, los ratones NSG fueron injertados subcutáneamente con células tumorales y macrófagos humanos suspendidos en Matrigel para la detección de la terapia. Este modelo animal demostró con éxito que los macrófagos humanos inmunosupresores diferenciados ex vivo pudieron promover la progresión tumoral en ratones NSG. Siguiendo este protocolo, se puede probar la eficacia de las terapias inmunosupresoras dirigidas a macrófagos, incluida la de medicamentos de moléculas pequeñas, productos biológicos y otras terapias basadas en células. Sin embargo, debido a las limitaciones del uso de ratones inmunodeficientes para estudiar el TME humano, los modelos propuestos son los más adecuados para estudios de prueba de concepto.

El protocolo a continuación sigue las pautas de la Junta de Revisión Institucional (IRB), el Comité Institucional de Bioseguridad (IBC) y el Departamento de Medicina Comparativa de Mayo Clinic según el protocolo A00001767 del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales.

1. Preparación de monocitos humanos clásicos para estudio in vitro

1. Aísle las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de donantes de sangre sanos como se describió anteriormente⁹. Brevemente, diluya la sangre completa con FBS al 2% en PBS en una proporción de volumen de 1: 1, seguido del aislamiento de PBMC en medio de gradiente de densidad.
2. Aísle los monocitos clásicos humanos (CD14 ⁺ CD16^-) de PBMC recolectados mediante la selección de perlas magnéticas negativas de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Tabla de materiales). Brevemente, lave la cantidad adecuada de PBMC con tampón de aislamiento y vuelva a suspender las celdas en el volumen indicado de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Etiquete las células, excepto los monocitos clásicos, con un cóctel de anticuerpos y microperlas magnéticas. Recolecte monocitos clásicos del flujo continuo, mientras retiene los no monocitos en las columnas.
   NOTA: Suponga que el 5% de los PBMC completos son monocitos clásicos y ajuste el número de células iniciales de PBMC en consecuencia. Guarde los PBMC restantes para la confirmación de la pureza de la población de monocitos en el paso 1.7. Los monocitos clásicos siempre deben aislarse de PBMC frescos sin criopreservación previa.
3. Cuente el número de monocitos aislados usando un contador de células (Tabla de materiales) y centrifugue las células a 300 x g a 4 ° C durante 5 min. Vuelva a suspender las células en el tampón de aislamiento celular para alcanzar 1 x 10⁶ células/ml como concentración final. Tome 100 μL de suspensión celular y transfiérala a una placa de fondo plano de 96 pocillos.
4. Transfiera 1 x 10⁵ PBMC a la misma placa como un control de compuerta negativo para confirmar la pureza de la población clásica de monocitos mediante citometría de flujo. Centrifugar las células a 300 x g a 4 °C durante 3 min. Mantenga los monocitos aislados en hielo durante los pasos 1.5-1.12.
5. Lavar resuspendiendo las células con 200 μL de tampón FACS y centrifugar las células a 300 x g a 4 °C durante 3 min. Decantar cuidadosamente los sobrenadantes.
6. Para cada muestra, preparar 50 μl de tampón FACS que contenga 0,3 μl de reactivo vivo/muerto (excitación a 405 nm), 0,5 μl de CD14¹⁰ antihumano conjugado con APC (1 ng/μl) y 0,5 μl de CD16 11 antihumano conjugado con^{PE (1} ng/μl; Tabla de materiales).
   NOTA: Para mantener la tinción consistente, haga una mezcla maestra para múltiples muestras de acuerdo con el número total de muestras. Transfiera 50 μL de solución de tinción a cada pocillo.
7. Agregue 50 μL de solución de tinción a cada pocillo y mezcle suavemente las células para evitar burbujas. Incube las células en la oscuridad a temperatura ambiente durante 15 min.
8. Agregue 200 μL de tampón FACS a cada pocillo y centrifugue las células a 300 x g a 4 °C durante 3 min. Decantar cuidadosamente los sobrenadantes.
9. Lavar añadiendo 200 μL de tampón FACS a cada pocillo y centrifugar las células a 300 x g a 4 °C durante 3 min. Decantar cuidadosamente los sobrenadantes y resuspender las células en 200 μL de tampón FACS. Analizar muestras en un citómetro de flujo (Tablas de materiales).
10. Población de Gate CD14⁺CD16^- . Asegúrese de que la población de CD14 ⁺ CD16 ^esté por encima del 90% de las células vivas para una pureza ideal. Gate CD14 ⁺ CD16^- población de singletes vivos.
    NOTA: Se supone que los usuarios están familiarizados con el análisis de citometría de flujo.

2. Diferenciación de macrófagos M0 de monocitos clásicos humanos

NOTA: La diferenciación de macrófagos similares a M2 de monocitos clásicos humanos está adaptada de una publicación anterior¹².

1. Centrifugar monocitos aislados a 300 x g a 4 °C durante 5 min y aspirar sobrenadantes. Vuelva a suspender las células en medios de cultivo celular para alcanzar una concentración final de 1 x 10⁶ células/ml.
2. Agregue GM-CSF recombinante humano para alcanzar una concentración final de 10 ng / mL (Tabla de materiales) y mezcle bien. Transfiera 100 μl de células a una placa de 48 pocillos tratada con cultivo de tejidos y agregue 50 μl adicionales de medios de cultivo celular. Asegúrese de que cada condición tenga 3 réplicas para la lectura final del día 11.
   NOTA: Los usuarios pueden agregar más grupos de experimentos en consecuencia. Este protocolo solo incluye cocultivos experimentales de células tumorales y células T con o sin macrófagos similares a M2 (Tabla 1).
3. Transfiera 100 μL de células a otra placa de 48 pocillos y agregue 50 μL adicionales de medios de cultivo celular para el fenotipado de macrófagos. Asegúrese de incluir un pocillo para el fenotipado de macrófagos M0 y otro para el fenotipado de macrófagos similares a M2.
4. Agregue 200 μL de PBS en los pocillos circundantes para evitar la evaporación del cultivo celular. Incubar monocitos a 37 °C durante 7 días para diferenciar las células en macrófagos M0.
5. Para estudiar las interacciones entre macrófagos diferenciados y células CART19 compatibles con donantes, aísle 1 x 10 7 células T de las PBMC del mismo donante y genere células CART19 siguiendo un procedimiento de producción de CART de 8 días como se describió anteriormente ^9,13,14.
   NOTA: Las células CART coestimuladas con el dominio de señalización CD28 se generan a partir de 5 x 10 6 células T como se describió anteriormente ^9,13,14. Paralelamente, se generan células T no transducidas (UTD) siguiendo el mismo proceso ^9,13,14. Las células T UTD se utilizarán como control negativo en la proliferación de células T para controlar la proliferación alogénica.

3. Diferenciación de macrófagos similares a M2 a partir de macrófagos M0 mediante cocultivo con células diana

1. El día 7, tome la placa de 48 pocillos con macrófagos M0 e incube en hielo durante al menos 30 min. Pipetea vigorosamente las células constantemente mientras mantienes la placa en hielo.
   NOTA: La duración de la incubación del hielo depende de la adherencia de los macrófagos, que puede ser diferente debido a la variación del donante. La primera mezcla es para recolectar macrófagos poco adherentes, por lo que un pipeteo de 5 minutos debería ser suficiente.
2. Transfiera las células desprendidas a un tubo cónico fresco de 15 ml (tabla de materiales) preenfriado en hielo. Agregue 200 μL de PBS helado a los pocillos de la placa de 48 pocillos y pipetee vigorosamente las células restantes cada 10 min hasta que la mayoría de los macrófagos se separen del fondo. Después de cada pipeteo, revise las células bajo un microscopio y ajuste el tiempo de incubación en hielo según sea necesario, con tiempos de incubación más largos para las células más adherentes.
3. Transfiera los macrófagos M0 desprendidos restantes al tubo cónico de 15 ml sobre hielo. Mezcle las células con cuidado y cuente las células en un contador de células.
4. Centrifugar las células a 300 x g a 4 °C durante 5 min y aspirar sobrenadantes. Vuelva a suspender en PBS helado para alcanzar una concentración final de 1 x 10⁶ células / ml.
5. Transfiera 200 μL de células a una placa de 96 pocillos de fondo plano (Tablas de materiales). Centrifugar las células a 300 x g a 4 °C durante 3 min. Decantar cuidadosamente los sobrenadantes. Como control de compuerta negativo, agregue un pozo adicional teñido con marcadores de la población parental solamente.
6. Agregue 100 μL de tampón FACS complementado con 1 μL de solución bloqueadora del receptor Fc a cada muestra. Incube las células durante 10 min a temperatura ambiente. Centrifugar las células a 300 x g a 4 °C durante 3 min. Decantar cuidadosamente los sobrenadantes.
   NOTA: Es importante preincubar los macrófagos con tampón de bloqueo del receptor Fc antes de la tinción real del marcador para evitar resultados falsos positivos.
7. Para el pocillo de muestra, prepare 50 μL de tampón FACS que contenga 0,3 μL de reactivo vivo/muerto (excitación a 405 nm), 0,5 μL de CD14¹⁰ antihumano conjugado con APC (1 ng/μL), 0,5 μL de CD206¹⁵ antihumano conjugado con APC/Cy7 (2 ng/μL) y 0,5 μL de CD163¹⁶ antihumano conjugado con PerCP (2 ng/μL; Tabla de materiales). Para el control de compuerta negativo, prepare 50 μl de tampón FACS que contenga 0,3 μl de reactivo vivo/muerto y 0,5 μl de CD14 antihumano conjugado con APC.
8. Agregue 50 μL de solución de tinción a cada pocillo y mezcle suavemente las células para evitar burbujas. Incube las células en la oscuridad a temperatura ambiente durante 15 min.
9. Agregue 200 μL de tampón FACS a cada pocillo. Centrifugar las células a 300 x g a 4 °C durante 3 min. Decantar cuidadosamente los sobrenadantes.
10. Lavar añadiendo 200 μL de tampón FACS. Centrifugar las células a 300 x g a 4 °C durante 3 min. Decantar cuidadosamente los sobrenadantes y resuspender las células en 200 μL de tampón FACS.
11. Ejecute muestras en un citómetro de flujo y controle la población de células CD14 ⁺ CD206 ⁺ CD163⁺ . Utilice la expresión de CD163 y CD206 en macrófagos M0 como línea de base para fenotipos similares a M2. Se espera una migración poblacional de CD163^bajo, CD206^bajo a CD163^alto o CD206^alto en macrófagos similares a M2. La magnitud del cambio de población puede depender de los donantes.
12. Prepare la línea celular tumoral de interés y cuente con un contador de células.
    NOTA: Este protocolo utiliza la línea celular de linfoma de células del manto CD19⁺ no adherente, JeKo-1, como objetivo. Otras líneas celulares tumorales y su capacidad para diferenciar macrófagos similares a M0 a M2 se pueden probar según sea necesario.
    1. Mantenga las células JeKo-1 con los medios de cultivo sugeridos por el proveedor (tabla de materiales) a 1 x 10⁶ células/ml en un matraz de cultivo de tejidos. Mezcle las células tumorales en el matraz y cuéntelas con un contador de células.
13. Centrifugar las células diana a 300 x g a 4 °C durante 3 min y aspirar sobrenadantes. Vuelva a suspender las células diana con medios de cultivo celular para alcanzar una concentración final de 2 x 10⁶ células/ml.
    NOTA: Prepare el número apropiado de células tumorales en función del número de grupos experimentales. Asegúrese de que haya 2 x 10⁵ células diana para cada grupo de cocultivo de macrófagos similares a M2, incluida la placa de fenotipado M2.
14. Transfiera 100 μL de células tumorales a grupos de cocultivo de macrófagos similares a M2 en la placa de 48 pocillos preparada el día 0 y pipetee suavemente para mezclar. Incubar las células a 37 °C durante otras 24 h.
    NOTA: Se ha probado una proporción de 2: 1 de macrófagos JeKo-1: M0 para la diferenciación de fenotipos similares a M2. Se pueden probar otras proporciones según sea necesario.
15. El día 8, coloque la placa de fenotipado similar a M2 en hielo, separe vigorosamente las células y prepárese para el fenotipado como se describe en los pasos 3.4-3.11.
    NOTA: Los macrófagos similares a M2 son mucho más adherentes que los macrófagos M0, por lo que se espera la necesidad de una incubación de hielo más larga. Este protocolo solo utiliza hielo y PBS helado para separar macrófagos y minimizar el estrés en las células.
16. Combine los archivos de citometría de flujo del fenotipado M0 del día 7 con fenotipado similar a M2. Gate CD206 y CD163 de la población de células madre CD14⁺ de la muestra de macrófagos M0 y aplique la misma estrategia de compuerta a la muestra de macrófagos similares a M2 para visualizar el cambio de población.
17. Para introducir células T en los cocultivos, coseche las células T CART19 y UTD del día 8 generadas en el paso 2.5 y transfiera las células a tubos cónicos de 50 ml. Mezclar bien con una pipeta y contar con un contador de células.
18. Centrifugar las células a 300 x g a 4 °C durante 5 min y aspirar los sobrenadantes con cuidado. Vuelva a suspender las células T CART o UTD en medios de cultivo celular para alcanzar una concentración final de 2 x 10⁶ células/ml.
19. Prepare la línea celular tumoral y cuente con el contador de células. Centrifugar las células a 300 x g a 4 °C durante 5 min y aspirar los sobrenadantes.
20. Vuelva a suspender las células tumorales con medios de cultivo celular para alcanzar una concentración final de 2 x 10⁶ células/ml. Transferir 100 μL de células tumorales a pocillos de cocultivo sin macrófagos similares a M2 (Tabla 1).
21. Transfiera 100 μL de células T CART o UTD a los pocillos de cocultivo adecuados (Tabla 1). El cocultivo final con macrófagos similares a M2 debe tener células tumorales, células T y macrófagos en una proporción de 2:2:1. Utilice cocultivos sin macrófagos como controles.
22. Para mantener el volumen final constante en todos los grupos, agregue otros 100 μL de medios de cultivo celular a los pocillos sin macrófagos. Incubar las células a 37 °C durante 3 días.
    NOTA: Si se utilizan células CART alogénicas, los usuarios deben incluir células T UTD compatibles con el donante en los cocultivos como un control adecuado para detectar cualquier expansión de células T inducida por alogeneidad. En este caso, las células T CART y UTD criopreservadas previamente generadas deben descongelarse y recuperarse adecuadamente, seguidas de al menos 3-4 h de reposo antes de agregarlas a los cocultivos.

4. Análisis de la proliferación de cocultivos específicos de antígenos

1. El día 11, coloque la placa de cocultivo sobre hielo y pipetee vigorosamente las células. Mezcle bien las células y transfiéralas a tubos de microcentrífuga de 1,5 ml.
   NOTA: La lectura principal de los cocultivos es cuantificar la expansión de las células T, por lo que no es necesario separar los macrófagos a menos que los usuarios planeen analizar también otros marcadores en macrófagos en el mismo panel.
2. Agregue 200 μL de PBS helado en los pocillos de muestra y pipetee vigorosamente. Transfiera la solución restante a los mismos tubos de microcentrífuga.
3. Revise los pocillos bajo el microscopio (10x) para asegurarse de que las células en suspensión se estén recolectando por completo. Centrifugar las células a 300 x g a 4 °C durante 5 min y aspirar sobrenadantes.
4. Vuelva a suspender las células de todas las condiciones con 200 μL de tampón FACS y transfiéralas a una placa de 96 pocillos de fondo plano. Centrifugar las células a 300 x g a 4 °C durante 3 min. Decantar cuidadosamente los sobrenadantes.
5. Preparar 50 μL de tampón FACS que contenga 0,3 μL de reactivo vivo/muerto (excitación a 405 nm) y 0,5 μL de CD3¹⁷ antihumano conjugado con APC (1 ng/μL; Tabla de materiales) para cada pocillo de muestra. Agregue 50 μL de solución de tinción en cada pocillo y mezcle cuidadosamente las células con una pipeta para evitar burbujas.
   NOTA: En este paso, habrá gránulos de células grandes. Para asegurarse de que todas las células T se estén tiñendo, revise el fondo de la placa para confirmar que no queden gránulos de células después de mezclarlas bien.
6. Incube las células en la oscuridad a temperatura ambiente durante 15 min. Agregue 200 μL de tampón FACS a cada pocillo. Centrifugar las células a 300 x g a 4 °C durante 3 min. Decantar cuidadosamente los sobrenadantes.
7. Lavar añadiendo 200 μL de tampón FACS. Centrifugar las células a 300 x g a 4 °C durante 3 min. Decantar cuidadosamente los sobrenadantes y resuspender las células en 200 μL de tampón FACS.
8. Analizar muestras en un citómetro de flujo. Gate CD3⁺ y cuantifique el número absoluto de células CD3⁺ vivas como se indica a continuación:
   
9. Grafique el número absoluto de células CD3⁺ en cada condición usando GraphPad Prism.
   NOTA: Se espera que los cocultivos con macrófagos similares a M2 tengan un número absoluto mucho menor de células T CD3 que las condiciones en ausencia de macrófagos similares a M2.

5. Impacto de los macrófagos similares a M2 en las células CART en un sistema transwell

NOTA: Las placas de transpocillos separan físicamente los macrófagos similares a M2 de las células CART estimuladas y solo permiten que las moléculas solubles trafiquen entre los tipos de células, lo que permite a los usuarios estudiar la dinámica de las interacciones independientes del contacto entre los macrófagos y las células CART (Figura 1).

1. Aísle 1 x 10⁶ monocitos clásicos humanos y confirme la pureza de la población mediante citometría de flujo como se describe en los pasos 1.1-1.10. Centrifugar 1 x 10⁶ monocitos a 300 x g a 4 °C durante 5 min y aspirar sobrenadantes.
   NOTA: Es posible que los usuarios deseen generar células CART autólogas y UTD compatibles con donantes como se describe en el paso 2.5.
2. Vuelva a suspender las células en medios de cultivo celular para alcanzar una concentración final de 1 x 10⁶ células/ml. Agregue GM-CSF recombinante humano para alcanzar una concentración final de 10 ng/ml y mezcle bien.
3. Transfiera 200 μL de células resuspendidas al pocillo inferior de una placa transpocilla de 24 pocillos (0,4 μm) con 3 réplicas técnicas. Agregue 100 μL adicionales de medios de cultivo celular a cada pocillo y asegúrese de que el fondo del pocillo esté completamente cubierto. Agregue 300 μL de medios de cultivo celular a otros 3 pocillos para condiciones sin macrófagos (control positivo).
4. Agregue 200 μL de PBS en los pocillos circundantes para evitar la evaporación del cultivo celular. Incubar las células a 37 °C durante 7 días.
5. El día 7, prepare 1,4 x 10⁶ células tumorales JeKo-1 y transfiéralas a un tubo cónico de 15 ml. Centrifugar las células a 300 x g a 4 °C durante 5 min y aspirar los sobrenadantes.
6. Resuspender las células tumorales con medios de cultivo celular para alcanzar una concentración final de 2 x 10⁶ células/ml. Agregue 200 μL de células tumorales en los pocillos inferiores de todas las condiciones de muestra y mezcle bien. Incubar las células a 37 °C durante otras 24 h. Utilice pocillos de fondo con solo JeKo-1 como control positivo.
7. El día 8, coseche las células CART y UTD T del día 8 generadas en el paso 5.1. y resuspender las células T en medios de cultivo celular para alcanzar una concentración final de 1 x 10⁶ células/ml.
   NOTA: Si se utilizan células CART alogénicas, los usuarios deben incluir células T UTD compatibles con el donante en los cocultivos como se describe en el paso 3.22.
8. Cuente y prepare 1.4 x 10⁶ células JeKo-1. Transfiera las células tumorales a un tubo de centrífuga de 15 ml y baje las células a 300 x g a 4 °C durante 5 min.
9. Aspire sobrenadantes y vuelva a suspender las células en medios de cultivo celular para alcanzar una concentración final de 1 x 10⁶ células/ml. Transfiera 100 μL de células T preparadas y 100 μL de células tumorales a cada pocillo superior para todas las condiciones de la muestra.
10. Mezclar bien las células en el pocillo superior e incubar a 37 °C durante 3 días.
11. El día 11, mezcle las células en la cámara superior y transfiéralas a tubos de microcentrífuga de 1,5 ml. Lave los pocillos superiores con 200 μL de PBS y transfiera las células restantes a los tubos de microcentrífuga.
12. Centrifugar las células a 300 x g a 4 °C durante 5 min y aspirar sobrenadantes. Realice un ensayo de proliferación de células T como se describe en los pasos 4.4-4.9.
    NOTA: Los macrófagos similares a M2 polarizados por JeKo-1 pueden suprimir la proliferación de células T específicas de antígeno de manera independiente del contacto. Se pueden analizar otros modelos tumorales según sea necesario.

6. Establecimiento de un modelo de xenoinjerto con macrófagos humanos y tumores en ratones NSG

1. Aísle 1 x 10⁷ monocitos clásicos humanos y confirme la pureza mediante citometría de flujo como se describe en los pasos 1.1-1.10. Use ratones NSG injertados con JeKo-1 solo como control para confirmar los efectos protumorales de los macrófagos similares a M2, como se ilustra en la Figura 2.
   NOTA: Este protocolo injerta ratones NSG con 5 x 10⁵ macrófagos humanos por vía subcutánea. La recuperación de macrófagos después de desprenderse el día 7 es de aproximadamente el 50%. Los usuarios pueden ajustar el número de celdas en consecuencia y asegurarse de preparar celdas adicionales.
2. Centrifugar monocitos aislados a 300 x g a 4 °C durante 5 min y aspirar sobrenadantes. Vuelva a suspender las células en medios de cultivo celular para alcanzar una concentración final de 1 x 10⁶ células/ml.
3. Agregue GM-CSF recombinante humano para alcanzar una concentración final de 10 ng/ml y mezcle bien. Transfiera los monocitos a un matraz de cultivo de tejidos T25 e incube las células a 37 °C durante 7 días.
4. El día 7, pipetee vigorosamente las células en hielo cada 10 minutos y revise las células bajo un microscopio hasta que la mayoría de los macrófagos se desprendan. Transfiera las células a un tubo cónico de 15 ml con hielo, lave el matraz con PBS helado para aflojar las células restantes y combine las células en el tubo cónico.
5. Cuente las celdas en el contador de celdas. Centrifugar las células a 300 x g a 4 °C durante 5 min y aspirar sobrenadantes.
6. Lave y vuelva a suspender las células con 5 ml de PBS helado. Centrifugar las células a 300 x g a 4 °C durante 5 min y aspirar sobrenadantes.
7. Vuelva a suspender las células en PBS helado para alcanzar una concentración final de 2 x 10⁷ células/ml. Transfiera la solución celular a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y manténgala en hielo.
8. Prepare 1,5 x 10⁷ células de luciferasa ⁺ JeKo-1 y transfiera las células a un tubo cónico de 15 ml.
   NOTA: Debido al bajo número de células inyectadas, es necesario obtener imágenes de bioluminiscencia (BLI) para controlar la carga tumoral. El número de macrófagos y células tumorales para inyecciones subcutáneas se puede ampliar según sea necesario. Si los tumores son visibles y accesibles con calibre después de la inyección, se pueden usar células tumorales de tipo salvaje en su lugar.
9. Centrifugar las células a 300 x g a 4 °C durante 5 minutos y aspirar sobrenadantes. Vuelva a suspender las células en PBS helado para alcanzar una concentración final de 4 x 10⁷/ml.
10. Transfiera el mismo volumen de macrófagos y células tumorales a otro tubo de microcentrífuga nuevo de 1,5 ml y mezcle bien. Agregue el mismo volumen de matriz de membrana basal solubilizada en la solución de células mixtas y mezcle bien con hielo.
    NOTA: La matriz de la membrana basal debe descongelarse en hielo durante la noche para evitar la solidificación. En este punto, cada 100 μL de solución celular tiene 5 x 10⁵ macrófagos y 1 x 10⁶ JeKo-1 suspendidos en la matriz de la membrana basal, que utiliza la misma proporción de número de células utilizada en el protocolo de diferenciación de macrófagos in vitro similar a M2.
11. Como control, transfiera las células JeKo-1 restantes preparadas con el mismo volumen de PBS helado a un tubo de microcentrífuga nuevo de 1,5 ml, agregando el mismo volumen de la matriz de la membrana basal a la solución celular y mezclando bien con hielo.
12. Prepare 10 ratones NOD-SCID-γ-/- (NSG) hembras y machos de 6-8 semanas de edad (~ 20 g) para anestesia por inhalación con isoflurano al 2,5%. Introduzca la anestesia con isoflurano utilizando un aparato de anestesia inhalante para roedores. El isoflurano vaporizado se administra en una cámara y una etapa calentada con conos nasales.
13. Coloque a los ratones en la cámara de anestesia durante 1-2 minutos. Transfiera los ratones a los conos de la nariz en la etapa calentada una vez que se pierdan los reflejos posturales y derechos¹⁸. Mantenga a los ratones en la etapa de calentamiento durante todo el procedimiento. Aplique ungüento para los ojos en ambos ojos de los ratones para prevenir daños en la córnea debido a la pérdida del reflejo de parpadeo durante la anestesia.
14. Afeite con cuidado el flanco derecho de cada ratón para exponer la piel después de que los ratones hayan sido anestesiados. Cargue una jeringa de 0,5 ml con 100 μl de mezcla de células de macrófagos JeKo-1 y elimine con cuidado las burbujas de la solución.
15. Levante con cuidado la piel expuesta con la mano e inserte la aguja en la región levantada. Siga levantando la piel con la aguja y presione un dedo en el lugar de la inyección. Trate de no mover la aguja una vez insertada para evitar pinchazos accidentales y fugas de células.
16. Libere lentamente las células en la capa subcutánea y retire con cuidado la aguja. Repita las inyecciones subcutáneas para los 10 ratones NSG, con 5 ratones que reciben JeKo-1 y macrófagos y 5 ratones que reciben JeKo-1 solo.
17. Preparar D-luciferina (Tabla de materiales) a una concentración de 15 mg/ml. Cargue una jeringa de 0,5 ml con 200 μl de D-luciferina e inyecte en cada ratón por vía intraperitoneal.
18. Coloque ratones anestesiados en el escenario para BLI 10 minutos después de la inyección de D-luciferina. Realice BLI para cada ratón y registre como carga tumoral inicial (día 0). Vuelva a colocar a los ratones en sus jaulas.
    NOTA: Los usuarios deben asegurarse de que los ratones anestesiados no se dejen desatendidos hasta que recuperen la conciencia para mantener la decúbito esternal después del procedimiento de imágenes.
19. Monitorear la carga tumoral por BLI 2 veces por semana hasta que se alcancen los criterios de valoración experimentales o humanos. El criterio de valoración de supervivencia global se alcanza una vez que el volumen tumoral es igual o superior a 2000 mm³, calculado mediante la siguiente fórmula:
    
    NOTA: La duración de la monitorización del tumor se puede ajustar según el propósito de los experimentos y las lecturas deseadas. Debido a los tamaños tumorales extremadamente pequeños en las primeras 2-3 semanas, se recomienda BLI para la indicación de la carga tumoral. Una vez que los tumores se vuelven visibles y accesibles con un calibrador, se recomiendan mediciones de BLI y calibre para un análisis preciso del tumor.
20. Para estudiar las interacciones entre macrófagos humanos injertados y células CART19 autólogas en ratones NSG, generar e injertar macrófagos humanos diferenciados ex vivo como se describe en los pasos 6.1-6.16. Aísle las células T autólogas del mismo donante de sangre en el paso 6.1 siguiendo el protocolo de fabricación de CART de 8 días como se describió anteriormente ^9,13,14.
    NOTA: Cada ratón NSG se trata con 2 x 10⁶ células CART19. Los usuarios deben generar al menos 2 x 10⁷ células CART para tratar a 10 ratones. Las células CART se criopreservan el día 8 y se almacenan hasta que JeKo-1 / macrófagos se injertan en los ratones, 5 días después de las inyecciones subcutáneas.
21. Después de 5 días de inyecciones de tumores/macrófagos, aleatorice los ratones según BLI como se describe en los pasos 6.17-6.18. Descongele y prepare las células CART como se describe en el paso 3.22. Lave las células CART con PBS y centrifugue las células a 300 x g a 4 °C durante 5 min.
22. Vuelva a suspender las células CART en PBS para alcanzar una concentración final de 2 x 10⁷ células/ml. Cargue una jeringa de 0,5 ml con 100 μl de células CART preparadas e inyecte en cada ratón injertado por tumor por vía intravenosa a través de la vena de la cola.
23. Monitorear la carga tumoral por BLI una vez a la semana durante 4 semanas.
    NOTA: Debido a las funciones inmunosupresoras de los macrófagos humanos injertados, se espera una alteración de las actividades antitumorales de CART y una mayor carga tumoral en ratones inyectados con JeKo-1/macrófagos.

7. Confirmación del fenotipo similar a M2 en los macrófagos humanos injertados mediante tinción de inmunofluorescencia

1. Para confirmar el fenotipo similar a M2 inducido por JeKo-1 en macrófagos humanos injertados descritos en el paso 6 mediante tinción de inmunofluorescencia, siga los pasos 6.1-6.19 y amplíe el número de macrófagos inyectados y luciferasa ⁺ JeKo-1 a 5 x 10⁶ células y 1 x 10⁷ células por ratón NSG, respectivamente.
   NOTA: Los usuarios deben asegurarse de que el volumen final de inyección para cada ratón sea de 100 μL.
2. El día 7, eutanasia a los ratones NSG por CO₂, realice la luxación cervical y confirme la pérdida de reflejos corneales como se describió anteriormente¹⁹. Coloque a los ratones en el banco de trabajo con los tumores hacia arriba. Rocíe etanol al 70% en los sitios del tumor y recolecte cuidadosamente los tumores injertados con tijeras y fórceps.
3. Transfiera los tejidos tumorales a tubos cónicos de 50 ml llenos de 20-30 ml de paraformaldehído al 4% para su fijación como se describió anteriormente²⁰. Criopreservación y criosección de tejidos tumorales para tinción de inmunofluorescencia según un protocolo previamente publicado²⁰.
4. Tiña los portaobjetos de tejido tumoral con el anticuerpo CD206 anti-humano de ratón conjugado con AF546 (1:50) y el anticuerpo iNOS anti-humano de conejo conjugado con AF647 (1:100) diluido en tampón de tinción de inmunofluorescencia, seguido de tinción y preservación del núcleo como se describió anteriormente²¹.
   NOTA: Para obtener resultados óptimos de tinción, los usuarios deben realizar la titulación de anticuerpos en consecuencia, especialmente cuando se utilizan diferentes líneas de células tumorales.
5. Adquiera imágenes de inmunofluorescencia con microscopía confocal a 40x. Para confirmar que los macrófagos humanos injertados desarrollan un fenotipo similar a M2, espere ver la expresión de CD206 humano y la expresión mínima de iNOS humano.

El objetivo de este protocolo es establecer modelos in vitro e in vivo para estudiar las interacciones entre macrófagos inmunosupresores humanos y células CART debido a la naturaleza compleja y dinámica de las interacciones y los limitados modelos de xenoinjerto existentes. Siguiendo el protocolo, los monocitos clásicos humanos aislados se diferencian para adquirir fenotipos similares a M2 y volverse funcionalmente inmunosupresores.

Para confirmar la pureza de los monocitos clásicos humanos aislados, ejecute muestras teñidas en un citómetro de flujo y analice mediante compuerta en la población humana CD14 + CD16- (Figura 3A-B). El aislamiento exitoso de monocitos dará al menos un 90% de población CD14 + CD16- de la población parental de células vivas. Para fenotipificar y confirmar macrófagos diferenciados similares a M2, se espera un cambio de población de CD163bajo CD206bajo a CD163alto o CD206alto cuando se comparan macrófagos M0 con macrófagos similares a M2 (Figura 4). Una demostración exitosa de la proliferación específica del antígeno CART afectada negativamente por macrófagos inmunosupresores debería mostrar una reducción significativa en la proliferación de CART (Figura 5A). Según nuestros datos, los macrófagos diferenciados por JeKo-1 también son capaces de inhibir la proliferación específica del antígeno CART de manera independiente del contacto en un ensayo transwell (Figura 5B). Un modelo de xenoinjerto exitoso en ratones NSG injertados con macrófagos inmunosupresores humanos debería mostrar una progresión tumoral mucho más rápida que los ratones injertados solo con células tumorales (Figura 6). Para confirmar aún más el fenotipo similar a M2 en macrófagos humanos injertados en ratones NSG, se debe observar la expresión de CD206 humano y la expresión mínima de iNOS humano en los macrófagos mediante tinción de inmunofluorescencia (Figura 7A-D). Se espera que los macrófagos humanos inmunosupresores injertados perjudiquen las actividades antitumorales in vivo de CART19 en los ratones NSG (Figura 8).

Figura 1: Esquema del ensayo transwell que estudia las interacciones independientes del contacto entre las células CART y los macrófagos. Los monocitos clásicos se diferencian en macrófagos similares a M2 en la cámara inferior de una placa de transpocillos como se describe en el protocolo. Las células CART19 y JeKo-1 se cocultivan en una proporción de 1:1 en el pocillo superior durante 3 días, seguido de un análisis de proliferación específico de antígeno CART mediante citometría de flujo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Esquema de modelo de ratón NSG de xenoinjerto injertado con macrófagos inmunosupresores humanos y células tumorales. Los monocitos clásicos se diferencian en macrófagos M0 como se describe en el protocolo. Los macrófagos M0 se separan cuidadosamente y se mezclan con luciferasa + JeKo-1 en una proporción de 1: 2 en Matrigel. Como grupo de control, la luciferasa + JeKo-1 se mezclan con PBS en una proporción de volumen de 1: 1 en Matrigel. Los ratones NSG se injertan por vía subcutánea con células tumorales y macrófagos o solo con células tumorales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Confirmación clásica de la pureza de la población de monocitos mediante citometría de flujo. Los monocitos clásicos humanos (CD14 + CD16-) se aíslan de PBMC frescos mediante la selección de perlas magnéticas negativas siguiendo las instrucciones del fabricante. Tanto las PBMC como los monocitos aislados se procesan para la tinción por citometría de flujo como se describe en el protocolo. (A) Estrategia de compuerta de PBMC humanos teñidos como control. (B) Estrategia de activación de monocitos clásicos humanos purificados teñidos. Se muestran los resultados representativos del flujo y las estrategias de compuerta. El aislamiento ideal de monocitos clásicos debe tener una pureza del >90%. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Análisis de fenotipos similares a M2 en macrófagos después de la diferenciación. Los macrófagos M0 y los macrófagos similares a M2 diferenciados por JeKo-1 están preparados para la expresión de CD163 y CD206 mediante citometría de flujo como se describe en el protocolo. Un cambio de población representativo se muestra como una media superposición de histograma. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Los macrófagos similares a M2 inhiben la proliferación específica del antígeno CART19 de manera independiente del contacto. (A) JeKo-1, macrófagos similares a M2 y células T se cocultivan en una proporción de 2: 1: 2 durante 3 días como se describe en el protocolo. El número absoluto de células CD3+ vivas se mide mediante citometría de flujo. Se muestra un análisis representativo de la proliferación. Se muestran la media y el SEM. Se analizaron un total de 3 réplicas biológicas. Se utiliza ANOVA de dos vías, *p < 0,05, ***p < 0,001. (B) Los macrófagos similares a M2 se separan físicamente de las células CART19 estimuladas por antígenos en una placa de transpocillos (0,4 μm) como se describe en el protocolo. Se muestra un análisis representativo de la proliferación. Se muestran la media y el SEM. Se analizaron un total de 3 réplicas biológicas. Se utiliza ANOVA de dos vías; **p < 0,01, ****p < 0,0001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Los macrófagos diferenciados promueven la progresión tumoral subcutánea en el xenoinjerto NSG. Los ratones NSG se injertan por vía subcutánea con macrófagos M0 diferenciados por monocitos clásicos combinados con células JeKo-1 o JeKo-1 solas, como se describe en el protocolo. La carga tumoral a lo largo del tiempo se controla mediante imágenes de bioluminiscencia (BLI). Se muestran la media y el SEM. Se utiliza ANOVA de dos vías, ***p < 0,001. Mφ = macrófago. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7: Confirmación de fenotipos similares a M2 en macrófagos humanos injertados en ratones NSG. Los ratones NSG se injertan por vía subcutánea con 5 x 106 macrófagos humanos diferenciados ex vivo y 1 x 107 luciferasa + JeKo-1. Los tumores se recolectan y preparan para la tinción de inmunofluorescencia 7 días después de la inyección del tumor o macrófago. (A) CD206 humano o (B) iNOS se tiñe con anticuerpo anti-humano de ratón conjugado con AF547 (rojo) o anticuerpo anti-humano de conejo conjugado con AF647 (magenta), respectivamente; (C) luciferasa + JeKo-1 generado en el laboratorio también expresa GFP (verde); (D) DAPI se presenta en azul. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 

Figura 8: Inhibición inmunosupresora mediada por macrófagos de las actividades antitumorales in vivo de CART19. Los ratones NSG se inyectan por vía subcutánea con 5 x 10 5 macrófagos polarizados ex vivo humanos y 1 x 106 luciferasa + JeKo-1 o 1 x 106 luciferasa + JeKo-1 solo. Los ratones son tratados con 2 x 106 CART19 por vía intravenosa por la vena de la cola 5 días después de las inyecciones tumorales. La carga tumoral se indica mediante BLI durante 4 semanas. Se muestran la media y el SEM. Se utiliza ANOVA de dos vías, *p < 0,05. Mφ = macrófago. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Condiciones de interés de CART19, macrófagos y cocultivo de JeKo-1. En el ensayo de cocultivo de 48 pocillos, las células CART19 o UTD se cocultivaron con macrófagos similares a M2 y células JeKo-1 en una proporción de 2:1:2 durante 3 días. En el ensayo transwell, los macrófagos similares a M2 se sembraron en la cámara inferior, mientras que las células CART19 o UTD estimuladas por JeKo-1 se sembraron en la cámara superior.

SSK es un inventor de patentes en el campo de la inmunoterapia con CAR que están licenciadas a Novartis (a través de un acuerdo entre Mayo Clinic, la Universidad de Pensilvania y Novartis), MustangBio (a través de Mayo Clinic) y Sendero (a través de Mayo Clinic). RLS y SSK son inventores de patentes en el campo de la inmunoterapia con CAR que tienen licencia para Humanigen (a través de Mayo Clinic). KY, RLS, TH, BK, ES y SSK son inventores de patentes en el campo de la inmunoterapia con CAR que tienen licencia para Immix. SSK recibe fondos de investigación de Kite, Gilead, Juno, BMS, Novartis, Humanigen, MorphoSys, Tolero, Sunesis / Viracta, LifEngine Animal Health Laboratories Inc., Incyte y Lentigen. SSK ha participado en reuniones consultivas con Kite/Gilead, Humanigen, Juno/BMS, Capstan Bio y Novartis. SSK ha formado parte de la junta de seguridad y monitoreo de datos con Humanigen y Carisma. SSK se ha desempeñado como consultor para Torque, Calibr, Novartis, Capstan Bio, Carisma y Humanigen.