Artículo de método

Un modelo de ratón único para la evaluación cuantitativa de la formación de biopelículas en implantes quirúrgicos en abscesos subcutáneos

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DOI:

10.3791/68067

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6 de junio de 2025

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1Department of Orthopaedic Surgery, Orthopaedic Trauma Institute (OTI), University of California, San Francisco (UCSF), 2Rosies Base, LLC, 3Department of Neurological Surgery, Weill Institute for Neurosciences, Brain and Spinal Injury Center (BASIC), University of California, San Francisco (UCSF)

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe un modelo experimental único de infecciones relacionadas con implantes que permite la incubación simultánea de dos implantes con bacterias en condiciones idénticas dentro de un solo ratón. También permite una evaluación precisa de la formación de biopelículas en las superficies de los implantes utilizando métodos analíticos comparativos optimizados, demostrando técnicas avanzadas para evaluar las propiedades antimicrobianas de los biomateriales.

Resumen

Para desarrollar un nuevo biomaterial con propiedades antibacterianas para procedimientos quirúrgicos ortopédicos, es crucial establecer un modelo animal experimental de infecciones relacionadas con implantes que imite de cerca el estado patológico. Además, se requiere una comparación cuantitativa con muestras de control para evaluar la formación de biopelículas en los materiales. Sin embargo, los modelos animales actuales, que implican implantar a cada individuo con un solo material, pueden producir resultados inconsistentes debido a la heterogeneidad del estado de infección entre los sujetos. Además, cuantificar con precisión la formación de biopelículas en materiales in vivo sigue siendo un desafío, y los hallazgos pueden carecer de fiabilidad. Para abordar estos problemas, este estudio demostró un modelo de ratón único de infección relacionada con implantes que permite la incubación simultánea de dos implantes con bacterias en un entorno cerrado dentro de un solo ratón, formando un absceso subcutáneo encapsulado. Inicialmente se creó una bolsa de aire madura debajo de la piel de la espalda. Se conectaron dos cables de acero inoxidable y se colocaron en la bolsa, seguido de la inoculación de Xen 36, una cepa bioluminiscente de Staphylococcus aureus. A los 14 días de la inoculación, se había formado un absceso subcutáneo alrededor de los alambres. La biopelícula se eliminó por completo de la superficie de cada alambre y las suspensiones bacterianas disueltas se midieron con precisión utilizando métodos optimizados para evaluar la formación de biopelícula en el implante, determinar las unidades formadoras de colonias y realizar análisis cuantitativos de la reacción en cadena de la polimerasa. Aprovechando el operón lux de las bacterias bioluminiscentes, se utilizaron los niveles de expresión relativa de luxA y 16S rRNA para determinar la carga bacteriana dentro de la biopelícula en cada cable. Este enfoque analítico comparativo optimizado permite evaluaciones precisas de la formación de biopelículas en dos cables en condiciones de infección uniformes dentro de un solo modelo de ratón y puede facilitar el avance de biomateriales con propiedades antibacterianas.

Introducción

Las infecciones relacionadas con implantes siguen siendo un desafío importante en los entornos clínicos porque pueden causar altas tasas de morbilidad y mortalidad en cirugía ortopédica a pesar de los avances en la técnica quirúrgica y el diseño de implantes1. Aunque la incidencia de infecciones asociadas con implantes quirúrgicos ha disminuido significativamente debido a los estándares modernos de control aséptico en el entorno del quirófano y a los protocolos adecuados para la profilaxis antibiótica perioperatoria, la incidencia de infecciones relacionadas con los implantes en la cirugía primaria sigue siendo del 2%-5%2.

El principal mecanismo subyacente de las infecciones relacionadas con los implantes es la formación de una biopelícula en las superficies del implante, que protege a los microorganismos de los antibióticos y del sistema inmunitario, lo que dificulta la erradicación de la infección 3,4. Dado que la adhesión bacteriana a la superficie del implante es crucial durante la primera etapa de la formación de la biopelícula, minimizar la adhesión bacteriana y la posterior formación de la biopelícula es una estrategia esencial para reducir el riesgo de infecciones relacionadas con el implante. A pesar de las propiedades antibacterianas de varias tecnologías de implantes, estas no han sido ampliamente utilizadas clínicamente debido a eventos adversos, como toxicidad celular y alergias 5,6,7,8. Por lo tanto, todavía existe una necesidad clínica insatisfecha de implantes antibacterianos que armonicen la seguridad, la eficacia, la estabilidad y la durabilidad para reducir el riesgo de infecciones relacionadas con los implantes. La investigación y el desarrollo de implantes con propiedades antibacterianas podrían hacer avanzar la tecnología quirúrgica para superar estos problemas.

La evaluación de las propiedades antibacterianas de diversos biomateriales utilizando modelos animales pequeños es esencial antes de proceder a modelos animales más grandes y ensayos clínicos9. Numerosos estudios han demostrado modelos de ratón aplicables de infecciones relacionadas con implantes utilizando una bacteria bioluminiscente, que contiene el operón luxABCDE 10,11,12,13,14,15. Si bien estos modelos aceleran la investigación para desarrollar implantes o tecnologías antibacterianas, tienen ciertas limitaciones. En primer lugar, a menudo se requieren conocimientos avanzados y equipos especializados, como rayos X o sistemas de imagen dedicados, para evaluar la carga bacteriana en los implantes colocados en modelos de ratón de forma directa y precisa. En segundo lugar, si bien los implantes recolectados generalmente evalúan un implante solitario en un solo sitio de infección por animal, las condiciones de infección y las respuestas inmunológicas pueden variar entre individuos, lo que puede conducir a variabilidad en los resultados de las evaluaciones comparativas. Por lo tanto, al comparar los efectos antibacterianos de varios biomateriales in vivo, es más beneficioso implantarlos e inocularlos con bacterias en entornos uniformes para abordar estos problemas. Además, es fundamental optimizar la metodología actual y realizar evaluaciones cuantitativas con reproducibilidad y precisión aprovechando las características del modelo animal y las bacterias utilizadas.

Este estudio presenta un nuevo enfoque experimental para infecciones relacionadas con implantes in vivo que permite mediciones precisas para evaluar la formación de biopelículas en las superficies de dos implantes dentro de un solo modelo de ratón a través de métodos analíticos comparativos inter e intraindividuales. La biopelícula de cada implante se puede cuantificar utilizando métodos optimizados para visualizar la biopelícula en el implante, determinar las unidades formadoras de colonias (UFC) y el análisis cuantitativo de la reacción en cadena de la polimerasa (qPCR) de una cepa bioluminiscente de Staphylococcus aureus, Xen 36. El estudio previo demostró que un nuevo implante metálico posee una prometedora eficacia antibacteriana in vivo contra Staphylococcus aureus utilizando este enfoque integral16. Esta metodología se puede implementar fácilmente en un entorno de laboratorio estándar y puede acelerar la investigación en el desarrollo de biomateriales antibacterianos.

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Protocolo

Todos los procedimientos con animales son aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de California en San Francisco (UCSF) y se realizan en una instalación BSL2 después de consultar y aprobar el Programa de Riesgos de Bioseguridad de la UCSF, administrado por el Departamento de Salud y Seguridad Ambiental de la UCSF. Se utilizaron ratones machos y hembras C57BL/6 (12-16 semanas de edad, 25-50 mg). Los detalles de los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Preparación de bacterias

  1. Utilice el Staphylococcus aureus Xen36 (ATCC49525) bioluminiscente como patógeno.
    NOTA: Esta cepa se obtiene de la American Type Culture Collection (Manassas, VA) y utiliza de manera única un operón luxABCDE , que está optimizado e integrado en el plásmido nativo del huésped. Xen36 también utiliza el gen de resistencia a la kanamicina vinculado al operón lux .
  2. Añadir una pequeña cantidad de caldo de glicerol congelado de Xen 36 y añadir los trozos a 5 mL de caldo de soja tríptico (TSB) medio que contenga 200 μg/mL de kanamicina.
  3. Incubar el cultivo durante la noche a 37 °C en una incubadora agitadora (200 rpm).
  4. Estrelle Xen36 en placas de agar TSB (TSB en agar 1,5%) que contengan 200 μg/mL de kanamicina e incube durante la noche a 37 °C.
  5. Aislar colonias individuales de Xen36 y cultivar en 5 mL de TSB que contengan 200 μg/mL de kanamicina durante la noche a 37 °C en una incubadora agitadora (200 rpm).
  6. Mida la absorbancia del cultivo resultante a 630 nm.
  7. Diluir el cultivo y hacer un cultivo Xen36 de 1,0 x 108 UFC/mL basado en la absorbancia a 630 nm.
    NOTA: Una medición de absorbancia a 630 nm (frente a un blanco TSB) de 0,5 equivale aproximadamente a 1,0 x 108 UFC/ml de Xen36.
  8. Diluya el cultivo y haga un cultivo Xen36 de 1,0 x 105 UFC/mL.

2. Preparación de implantes conectados

  1. Utilice dos alambres en forma de varilla compuestos de acero inoxidable (SUS316L de grado quirúrgico disponible en el mercado, cada uno de 8 mm de largo y 0,5 mm de diámetro.
  2. Conecte los dos cables verticalmente insertándolos en ambos extremos de una punta de pipeta de 20 μL cortada a una longitud de aproximadamente 3 mm.
    NOTA: Inserte los cables conectados verticalmente en la punta de la aguja de 18 G (Figura 1). Asegúrese de que los cables estén firmemente asegurados por la punta de la pipeta para evitar la desconexión.
  3. Esterilizar los cables en autoclave antes de implantarlos quirúrgicamente en los ratones.

3. Creación de una bolsa subcutánea madura

NOTA: 7 días antes de la inoculación bacteriana, cree la bolsa de aire de la siguiente manera:

  1. Anestesiar al ratón (C57BL/6) con isoflurano al 2% por vía inhalatoria (siguiendo protocolos aprobados institucionalmente).
    NOTA: Evalúe el nivel adecuado de anestesia observando la frecuencia respiratoria, el tono muscular, el pellizco de los dedos de los pies, el reflejo corneal y el color de las membranas mucosas. Use ungüento oftálmico en los ojos para prevenir la sequedad mientras está bajo anestesia.
  2. Transfiera el ratón anestesiado a la cama quirúrgica y afeite la región dorsal cervical/torácica del ratón.
  3. Frotar y esterilizar toda la región con etanol al 70% y povidona yodada.
  4. Llene una jeringa de 10 ml con aire estéril y coloque una aguja de 27 g en la salida.
  5. Pellizca y eleva suavemente la base del cuello del ratón para crear espacio entre el tejido subcutáneo y la fascia.
  6. Coloque la aguja en la línea media entre las escápulas del ratón e inyecte 3 mL de aire estéril por vía subcutánea para crear la bolsa de aire (Figura 2).
    NOTA: Mientras inyecta aire, sostenga ambos lados de la espalda con la mano opuesta para asegurarse de que el aire se extienda al centro de la espalda, creando una bolsa en el medio.
  7. Regrese el ratón a una jaula calentada con una almohadilla térmica y vigílelo de cerca hasta que se haya recuperado de la anestesia.
  8. Inyecte 3 mL de aire estéril como se describió anteriormente para mantener el inflado de la cavidad y crear una bolsa madura cada 2 días.
    NOTA: Antes de cada inflado, aspire el aire de la bolsa para confirmar la colocación correcta de la punta de la aguja. Retire con cuidado la jeringa de la aguja, dejando la punta de la aguja en la bolsa. Vuelva a inflar la bolsa con 3 ml de aire estéril.

4. Implantación de cables conectados e inoculación bacteriana

  1. 7 días después de la primera inyección de aire, anestesiar el ratón como se describe en el paso 3.1.
    NOTA: Durante el procedimiento quirúrgico, verifique constantemente que el ratón esté respirando y esté anestesiado. Todo el procedimiento quirúrgico suele durar entre 10 y 15 minutos cuando lo realiza un cirujano capacitado. La anestesia se mantiene mediante la colocación de un tubo que administra isoflurano al 2% mezclado con oxígeno adyacente al hocico del ratón.
  2. Frotar y esterilizar toda la región con etanol al 70% y povidona yodada.
  3. Inyecte bupivacaína por vía subcutánea justo antes de la cirugía.
  4. Haga una incisión longitudinal en la línea media de 3 mm en la parte superior de la bolsa.
  5. Inserte una aguja de 18 G que contiene los cables conectados en la bolsa a través del orificio y empuje los cables con una jeringa interna de una aguja espinal de 25 G (Figura 3A, B).
  6. Dejando la punta de la aguja de 18 G dentro de la bolsa, retire suavemente el cilindro interior e inyecte 3 mL de cultivo Xen36 de 1,0 x 105 UFC/mL con la jeringa (Figura 3C, D).
  7. Retire con cuidado todas las agujas, cierre la piel con una pinza para heridas y selle con adhesivo cutáneo tópico (Figura 3E, F).
  8. Asegúrese de que no haya fugas, devuelva el mouse a la jaula individual calentada con una almohadilla térmica y monitoree como antes.

5. Extracción de los implantes del absceso subcutáneo

  1. Después de la eutanasia por sobredosis de isofluorano, afeitar la región dorsal cervical, torácica y lumbar del ratón, e hisopar y esterilizar toda la región con etanol al 70% y povidona yodada (Figura 4A).
    NOTA: La eutanasia se llevó a cabo de acuerdo con las Directrices de la Asociación Americana de Medicina Veterinaria (AVMA) para la eutanasia de animales.
  2. Realice una incisión de 2 cm en la línea media de la región lumbar y exfolie cuidadosamente el tejido subcutáneo con unas tijeras.
  3. Extienda la incisión y la disección subcutánea proximalmente y separe el tejido adherente que rodea el absceso (Figura 4B - D).
  4. Extirpar todo el absceso subcutáneo (Figura 4E).
  5. Corte el absceso y extraiga con cuidado el alambre del interior del absceso (Figura 4F).

6. Cuantificación del biofilm formado en las superficies del implante

  1. Ensayo de cristal violeta
    1. Coloque los alambres extraídos del absceso en pocillos individuales de una placa de 24 pocillos que contenga 1 mL de agua desionizada (DI).
    2. Transfiera los cables a pozos nuevos que contengan 1 mL de agua desionizada para eliminar cualquier bacteria poco adherida de la superficie de los cables.
    3. Fije el biofilm en los cables con etanol al 100% durante 1 minuto y déjelos secar.
    4. Transfiera los alambres a nuevos pocillos que contengan 1 mL de reactivo violeta cristalino al 0,1%.
    5. Después de 15 minutos de manchas, lave suavemente los hilos dos veces con agua desionizada para eliminar el exceso de tinte.
    6. Colocar el implante en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL que contenga 250 μL de ácido acético al 33% durante 15 min; Solubilizar el cristal violeta adherido a la biopelícula del implante, seguido de un vórtice durante 1 min.
    7. Transfiera 200 μL de la suspensión a una placa de 96 pocillos y mida la absorbancia a630 nm de diámetro exterior utilizando un lector de microplacas. Todas las mediciones se realizan por triplicado.
  2. Recuento de unidades formadoras de colonias (UFC)
    1. Retire cualquier bacteria poco adherida de la superficie de los cables como se describe en el paso 6.1.2.
    2. Colocar el implante en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL que contenga 200 μL de tripsina 10x e incubar a 37 °C durante 1 h.
    3. Vórtice durante 1 min y sonicate en un baño de agua a 100 W durante 5 min, seguido de un vórtice adicional durante 30 s para separar la biopelícula en la suspensión.
    4. Inocular 10 μL de la suspensión diluida en serie en las placas de agar TSB (TSB en agar 1,5%) con 200 μg/mL de kanamicina.
      NOTA: Realice este procedimiento por triplicado para cada solución.
    5. Después de incubar las placas a 37 °C durante 24 h, cuente las colonias en las placas y calcule el número de células bacterianas en el cultivo original utilizando el recuento medio de colonias17.
      NOTA: Para asegurarse de que se eliminen todas las bacterias de los cables, lo cual es crucial para una medición precisa, tiña los cables con violeta cristalino y obsérvalos después de aplicar la suspensión a las placas. En los experimentos preliminares, la combinación de la disociación mecánica y química anterior eliminó con éxito todas las biopelículas de Xen36 de las superficies del alambre de acero inoxidable convencional (Figura 5).
  3. Análisis cuantitativo de la reacción en cadena de la polimerasa (qPCR)
    1. Retire cualquier bacteria poco adherida de la superficie de los cables como se describe en el paso 6.1.2.
    2. Coloque el implante en un microtubo de 1,5 mL que contenga 600 μL de TSB.
    3. Extraiga el ADN utilizando el sistema de lisis alcalina modificada sin pellets16.
      NOTA: El volumen final de ADN eluido es de 20 μL.
    4. Diluir el ADN 1:10 y almacenarlo a -20 °C.
    5. Realice qPCR para los genes luxA y 16S rRNA 16.
      NOTA: Todas las reacciones de qPCR se realizan por triplicado. El volumen total de la mezcla de reacción es de 10 μL, que contiene 3 μL de plantilla de ADN, 5 μl de SYBR Green, 1 μL de agua libre de nucleasas y 0,5 μL de cada cebador. Los cebadores para el gen luxA son 5'- GAGCATCATTTCACGGAGTGTG -3' y 5'- ATAGCGGCAGTTCCTACATTC -3'. Los cebadores para el gen 16S rRNA son 5'- GTGGAGGGTCATTGGAAACT - 3' y 5'- CACTGGTTCCTCCATATCTC - 3'. Las condiciones de PCR son las siguientes: desnaturalización inicial durante 2 min a 94 °C seguida de 40 ciclos de 15 s a 94 °C, 30 s a 60 °C y 30 s a 72 °C, y una extensión final a 72 °C durante 5 min.
    6. La media de los valores de umbral (Ct) de tres ciclos se compara con una curva de calibración generada con ADN purificado directamente a partir de cultivos puros de Xen36 diluidos en serie para estimar la carga bacteriana en el implante (Figura 6).

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Resultados

Este estudio evaluó la fiabilidad de un enfoque integral que utiliza un nuevo modelo de ratón de infección relacionada con implantes con evaluaciones cuantitativas optimizadas de la formación de biopelículas en las superficies de los implantes, que se ha utilizado en el estudio anterior16. Los dos implantes idénticos se utilizaron para examinar la biopelícula formada en sus superficies, con el objetivo de verificar que ambos implantes podían incubarse simultáneamen...

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Discusión

Este estudio demostró un enfoque integral para evaluaciones cuantitativas precisas de la formación de biopelículas en múltiples implantes mediante el aprovechamiento de un nuevo modelo de ratón y técnicas de análisis optimizadas para la infección relacionada con implantes. Para garantizar que dos implantes se incubaran en condiciones de infección idénticas en el mismo sujeto, se creó una bolsa subcutánea madura dentro de un solo ratón mediante inyecciones de aire repetidas. Este modelo p...

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Divulgaciones

Los autores declaran no tener intereses contrapuestos.

Agradecimientos

Esta investigación fue parcialmente financiada por un Programa de Investigación Cooperativa Industrial/Universitaria de NSF llamado Centro de Innovaciones Musculoesqueléticas Disruptivas (IIP-1916629), Komatsuseiki Kosakusho Co., Ltd., y Rosies Base, LLC.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Ácido acéticoTHOMAS CIENTÍFICO12-16-15-00
Lector de absorbancia Agilent BioTek 800 TSAgilentBT800TS
Agujas hipodérmicas estériles Air-Tite, calibre de la aguja: 18 gFISHER CIENTÍFICO14817151 (CS)
Agujas espinales BD: 25 gFISHER CIENTÍFICO22043805
Agitador de incubadora de sobremesaFISHER CIENTÍFICO
Baño ultrasónico Branson, 115 VCA, 60 HzFISHER CIENTÍFICO2489500
Branson Ultrasonics 2510R-MTH (Sonicador)RPI-T48500-500.0
Centrífuga sorvall picoFISHER CIENTÍFICO
CFX96 Sistema de qPCR de módulo óptico en tiempo realBIO-RAD
Esterilizador compacto, 30LTHOMAS SCIENTIFIC LLC22A00N096 (EA/1)
Violeta cristalina, 1%, solución SCI_EDFISHER CIENTÍFICO10114-58-6
Placa de cultivo celular Falcon de 24 pocillosFISHER CIENTÍFICO877125
Placa de cultivo celular Falcon de 96 pocillosFISHER CIENTÍFICO8771001
Mezclador de vórtice digital FisherbrandFISHER SCIENTIFICS
KanamicinaTHOMAS SCIENTIFIC LLC 15160054
Agar de sal de manitol 
FISHER SCIENTIFIC 
Incubadora micirobiosaThermo Scientific51028063H
PBS, solución salina tamponada con fosfato
Staphylococcus aureus ATCC 49525 (Xen36)Perkin Elmer119243
SYBR Green I Tinción en gel de ácido nucleicoFISHER CIENTÍFICO
Tripsina 10x (2,5%)FISHER CIENTÍFICO15090046
Caldo de soja trípticoNETA SCIENTIFIC INC 
Zyppy Plasmid Miniprep KiFISHER CIENTÍFICO501977785sistema de lisis alcalina modificada sin pellets

Referencias

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