La imagen in vivo de las articulaciones es una técnica valiosa para descubrir el comportamiento migratorio de los leucocitos y la dinámica molecular dentro de las articulaciones inflamadas. Aquí presentamos un protocolo detallado para la obtención de imágenes in vivo de las articulaciones utilizando un modelo murino de artritis inducida por colágeno tipo II (CIA).
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Artículo de método
In vivo Las imágenes revelan el comportamiento migratorio de los leucocitos dentro de las articulaciones
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Resumen
Resumen
Los leucocitos son células transmitidas por la sangre derivadas de la médula ósea que deben migrar hacia los tejidos para mediar la inflamación. Por tanto, controlar esta migración representa un punto crítico para el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas que atenuen la inflamación. Los estudios tradicionales de endpoint no nos han permitido diseccionar completamente el comportamiento migratorio de los leucocitos in vivo. Sin embargo, los avances recientes en la tecnología de imagen han proporcionado conocimientos sin precedentes sobre la migración de células inmunitarias en animales vivos, ampliando enormemente nuestra comprensión de la regulación molecular del tráfico celular inmune.
Aquí presentamos un protocolo detallado para la obtención de imágenes in vivo de las articulaciones utilizando un modelo murino de artritis inducida por colágeno tipo II (CIA). Los ratones son inmunizados con colágeno tipo II emulsionado en el adyuvante de Freund completo, y la progresión de la artritis se monitoriza mediante puntuación clínica y mediciones del grosor de las patas. En el pico de la artritis, los leucocitos se visualizan in vivo mediante microscopía confocal en ratones transgénicos que expresan proteínas fluorescentes o en ratones de tipo salvaje tras la inyección intravenosa de anticuerpos marcados fluorescentes y Dextrán de alto peso molecular para la tinción de vasos. La exposición quirúrgica cuidadosa de la articulación, la aplicación de agarosa y la correcta colocación de la pierna permiten una imagen estable a largo plazo, que suele durar varias horas. Este enfoque permite el análisis en tiempo real de la detención leucocitaria, el arrastre y la migración transendotelial dentro de articulaciones inflamadas.
Este protocolo será valioso para grupos de investigación que investiguen el tráfico de leucocitos en la artritis y otras enfermedades inflamatorias. También puede servir como plataforma para la evaluación preclínica de terapias dirigidas a la migración de células inmunitarias.
Introducción
Dado que los leucocitos son células transmitidas por la sangre derivadas de la médula ósea, deben entrar en el tejido para causarinflamación 1. El control de este proceso representa un punto clave en el que se podrían desarrollar nuevas terapias para atenuar lainflamación 2. En general, el tráfico leucocito hacia el tejido inflamado ocurre en las vénulas postcapilares y sigue la cascada de adhesiones, comenzando con la captura de leucocitos de flujo libre por la pared del vaso. Además, el proceso es seguido por leucocitos que ruedan a lo largo de la pared del vaso en dirección al flujo, paro leucocitoar en el endotelio, liberación de la adhesión y avances en todas las direcciones de la superficie del vaso para localizar un sitio receptivo para la migración transendotelial (TEM) hacia una ubicación específica dentro del tejido 1,3.
Estos pasos distintos están regulados por una combinación de señales moleculares, incluyendo las selectinas (para rodar), integrinas (para arresto, arrastre) y quimioatractantes (CAs) (para arresto, posiblemente arrastrarse y TEM)3. Los CA activan los leucocitos a través de siete receptores quimioatráticos acoplados a proteínas G transmembranas (CARs), y desempeñan papeles críticos en la cascada de adhesión al aumentar la afinidad de integrina (lo que conduce a la detención) e inducir el TEM. Sin embargo, los mecanismos exactos del TEM no se comprenden completamente. Los estudios tradicionales de endpoint y los experimentos in vitro no han proporcionado información sobre cómo la señalización CA-CAR regula dinámicamente el comportamiento migratorio de leucocitos in vivo.
Los avances recientes en tecnología de imagen han proporcionado perspectivas sin precedentes sobre la migración de células inmunitarias en animales vivos, ampliando enormemente nuestra comprensión de la regulación molecular del tráfico celular inmunitario invivo 4,5,6.Por ejemplo, esta tecnología ha elucidado el control molecular del tráfico de neutrófilos a sitios de inflamación tisular, como la lesión hepáticatérmica 7 y la lesión cutánealáser 8. Por ello, hemos solicitado la investigación de los mecanismos moleculares que controlan el tráfico de neutrófilos a sitios de inflamaciónarticular 9. La imagen articular in vivo descrita aquí reveló que el componente del complemento receptor C5a 1 (C5aR1) es crucial para iniciar la adhesión de neutrófilos al endotelio articular, provocando inflamación en las articulaciones. C5aR1 facilitó la detención y propagación de neutrófilos dependientes de integrina, seguida por TEM mediado por el receptor leucotrieno B4, y un arrastre impulsado por el receptor de quimiocina CC 1 (CCR1). El receptor de quimioquina CXC 2 (CXCR2) desempeñó un papel en las etapas avanzadas del TEM de neutrófilos en las articulacionesinflamadas 10. Además, la imagen articular in vivo reveló un nuevo paradigma en las reacciones de hipersensibilidad tipo III dentro de la articulación, donde C5a actúa como iniciador de inflamación, mientras que las células residentes en el tejido juegan un papel más significativo en la inflamación en el paradigma actual de reacciones de hipersensibilidad tipoIII 10,11.
Además, aplicamos imágenes in vivo de la articulación para estudiar la dinámica molecular de C5a dentro de la articulación. C5a cargado sobre el tejido articular en ratones salvajes se transportaba rápidamente al lumen vascular, mientras que en ratones deficientes en C5aR2, C5a permanecía completamente dentro del tejidosinovial 12. Estos datos demuestran que C5aR2, expresado en el endotelio articular, transporta C5a al lumen del vaso, un proceso necesario para la adhesión de neutrófilos dependientes de C5aR1 en lasarticulaciones 13.
La imagen in vivo de las articulaciones es aplicable a todos los modelos de artritis inflamatoria y permite una observación a largo plazo (normalmente un par de horas), aunque la visualización del tejido profundo (>1 mm) puede ser limitada dependiendo del microscopio utilizado. En conjunto, esta técnica proporciona una herramienta poderosa para investigar el comportamiento migratorio de los leucocitos y la dinámica molecular dentro de las articulaciones inflamadas. Estamos compartiendo este protocolo para la imagen articular in vivo para apoyar a los grupos de investigación que estudian este proceso en articulaciones inflamadas.
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Protocolo
Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso Animal de la Facultad de Medicina de la Universidad de St. Marianna (Aprobación: Nº TG240926-2 y TG250801-2) y se llevan a cabo de acuerdo con las directrices institucionales y nacionales.
1. Preparación de un modelo murino de artritis
NOTA: Los modelos animales de artritis han proporcionado herramientas valiosas para comprender la patogénesis de la enfermedad y para desarrollar nuevasterapias 14. Aunque varios modelos murinos de artritis presentan ventajas y limitaciones únicas, la artritis inducida por colágeno tipo II (ACI) se ha utilizado ampliamente en estudios sobre la patogénesis de la artritis reumatoide (AR)14. En esta sección, describimos el protocolo de los modelos de artritis de la CIA (los suministros e instrumentos se muestran en la Figura 1).
- Preparar una dilución de colágeno bovino tipo II en 0,05 M de ácido acético (concentración final 4 mg/mL) agitando durante la noche a 4 °C.
- Para crear la emulsión, mezcla la dilución de colágeno (4 mg/mL en ácido acético 0,05 M) con el adyuvante de Freund completo (CFA) en una proporción 1:1 en una jeringuilla de vidrio. Esto produce una concentración final de colágeno de 2 mg/mL en la emulsión. Mezcla vigorosamente a mano durante aproximadamente 20 minutos. Este proceso genera calor, así que enfría la jeringuilla de vidrio que contiene la emulsión sobre hielo. Utiliza un vaso para comprobar la consistencia de la emulsión durante la preparación.
NOTA. Almacena cualquier dilución de colágeno restante a -80 °C. Esto puede usarse para la segunda inmunización. - Transfiere la emulsión a una jeringuilla de cristal de 1 mL equipada con una aguja de 26 x 1/2 G, y déjala en hielo hasta la inmunización.
- Anestesiar ratones DBA1/J de 8 semanas (machos o mujeres) con inyecciones intraperitoneales de medetomidina (0,3 mg/kg), midazolam (4 mg/kg) y vetorphale (5 mg/kg).
NOTA. Los ratones transgénicos suelen tener un fondo C57BL6. El colágeno de pollo se utiliza típicamente para la CIA en ratones C57BL6; sin embargo, la incidencia y gravedad de la CIA en ratones C57BL6 son menores que en ratones DBA/1J. Si se utilizan ratones transgénicos con un fondo C57BL6, considera realizar un estudio piloto para evaluar la incidencia y gravedad de la CIA. - Afeita el pelo alrededor de la cola con una máquina de cortar para prepararte para la inmunización.
- Inyectar lentamente un volumen de 100 μL de la emulsión (que contiene 200 μg de colágeno) en el espacio subcutáneo a lo largo del dorso caudal (cerca de la base de la cola) (Figura 2).
- Repite los pasos 1.2 a 1.6 en el día 21 para la segunda vacunación (Figura 2).
2. Evaluación de la puntuación clínica de artritis y medición del grosor de las patas
NOTA: La puntuación clínica de la artritis y la medición del grosor de las patas son esenciales para evaluar la actividad de la enfermedad. Normalmente, se realizan la puntuación clínica de artritis y las mediciones del grosor de las patas cada 1-3 días después de la primera vacunación.
- Puntuación clínica de artritis: Anota la suma de las puntuaciones de las cuatro patas de cada ratón. Utiliza el siguiente sistema de puntuación:
0 = Normal
1 = Eritema e hinchazón de un solo dígito
2 = Eritema e hinchazón de dos dedos o eritema e hinchazón de la articulación del tobillo
3 = Eritema e inflamación de más de tres dedos o hinchazón de dos dedos y articulaciones del tobillo
4 = Eritema e hinchazón severa del tobillo, pie y dedos con deformidad.
NOTA. Una articulación del tobillo hinchada se define como un grosor de la pata superior a 4 mm. - Medición del grosor de la pata: Mide el grosor de cada pata usando calibradores digitales de corredera. Utiliza el grosor medio de las patas en las cuatro patas de cada ratón.
3. Imagen in vivo de articulaciones
NOTA: La imagen in vivo de las articulaciones nos permite observar la migración de leucocitos hacia las articulaciones y analizar su comportamiento dentro del tejido en ratones vivos. Para visualizar células, se utilizan ratones transgénicos genéticamente modificados para expresar proteínas fluorescentes en células específicas, así como ratones inyectados por vía intravenosa con anticuerpos marcadores anticelulares. Los suministros utilizados se muestran en la Figura 3.
- Anestesiar a ratones artritógenos intraperitonealmente con medetomidina (0,3 mg/kg), midazolam (4 mg/kg) y vetorfal (5 mg/kg).
- Afeita la pata del ratón con una máquina de cortar y usa crema depilatoria (<60 s) para eliminar cualquier vello que quede. Evita la aplicación prolongada para evitar irritaciones cutáneas.
- Retira la nata con gasa húmeda (Figura 4A). Asegúrate de que se elimine todo el vello para evitar autofluorescencia indeseable en la zona de imagen. Repite si es necesario.
- Durante la anestesia se aplica lubricante corneal estéril en ambos ojos para evitar la desecación o ulceración corneal.
- Bajo un endoscopio quirúrgico, realizar una incisión de 1 cm a lo largo de la piel con microtijeras (Figura 4B).
NOTA. Este paso es fundamental. La cirugía puede desencadenar el reclutamiento de leucocitos (especialmente neutrófilos). Evita cualquier daño que pueda causar artefactos. Debido a la angiogénesis en las articulaciones artríticas, estas articulaciones son propensas a sangrados. Puede ser necesario realizar varias sesiones de práctica para tener éxito en la cirugía. - Coloca las articulaciones artríticas sobre la placa de plástico (Figura 4C).
NOTA. Se puede usar adhesivo de tejido para ayudar a fijar la pata del ratón en su sitio. Este estudio utiliza arcilla para sujetar una lámina de vidrio a una placa de plástico. - Cubrir el área de imagen con aproximadamente 1 mL de agarosa al 1,5% con solución salina tamponada con fosfato (PBS) (Figura 4D).
NOTA. Asegúrate de que la agarosa se haya enfriado para prevenir lesiones tisulares, lo que podría favorecer el reclutamiento de leucocitos en la zona de imagen. - Prepara el escenario en el microscopio.
NOTA. Utiliza una almohadilla eléctrica para mantener la temperatura corporal del ratón durante sesiones prolongadas de imagen. - Ajusta la configuración del microscopio confocal (potencia del láser, ganancia, desplazamiento, ubicación, etc.). Aquí, realiza imágenes con un microscopio confocal con una lente objetivo de inmersión en agua de 25, NA 1.1. Ajusta la excitación láser a 488 nm, 561 nm y 640 nm, y recoge la emisión a 488,0 nm, 561,6 nm y 638,5 nm.
- Comprueba la velocidad de escaneo del microscopio. Utiliza una resolución de píxeles de 512 x 512, con 5 secciones ópticas, una pila Z de 4 μm y un tiempo de ciclo de 15 s para permitir el análisis de celdas móviles individuales durante el tiempo suficiente para obtener datos significativos.
- Una vez identificada una ubicación adecuada, comienza la adquisición de la imagen.
NOTA. Si se utilizan anticuerpos marcadores anticelulares para marcar leucocitos, inyecta los anticuerpos por vía intravenosa 3 minutos antes de que comience la imagen. Para la visualización de vasos sanguíneos, inyecta Qdots, anticuerpo CD31 o Dextran simultáneamente. Por ejemplo, inyectar aproximadamente 2 μg de anticuerpos por ratón de Ly6G para neutrófilos y CD4 para células T, junto con aproximadamente 80 μg de 680-250k Dextran por ratón para la tinción de vasos sanguíneos. Los anticuerpos y el Dextrán suelen disuelvérse en 100 μL de PBS estéril. Ten en cuenta que algunos anticuerpos pueden agotar los leucocitos, así que comprueba que los anticuerpos seleccionados no reduzcan los recuentos de leucocitos. - Procesa las imágenes de archivo ND2 adquiridas con el microscopio confocal utilizando el módulo General Analysis 3 (GA3) del software de análisis de imágenes NIS-Elements (versión 6.20.00). Realizar la extracción de las regiones vasculares y la sustracción de fondo. Tras el procesamiento de todos los periodos de tiempo, exporta las imágenes como vídeo.
NOTA. Como parte del análisis, cuenta el número de células adheridas y extravasadas. - Tras completar la imagen, permite que el animal se recupere como procedimiento de supervivencia o se sacrifica humanamente, dependiendo del diseño experimental. Si se pretende sobrevivir, cierra suavemente el lugar quirúrgico y proporciona la atención postoperatoria adecuada de acuerdo con las directrices institucionales de cuidado animal.
NOTA: En este estudio, todos los animales fueron sacrificados humanamente inmediatamente después de la imagen, cumpliendo con las directrices institucionales y nacionales.
4. Análisis estadístico
- Presenta los datos como media ± error estándar de la media (SEM). Realizar análisis estadísticos utilizando la prueba t de Student para comparaciones entre dos grupos o ANOVA unidireccional para varios grupos, seguida de la prueba post hoc de Tukey. Consideremos un valor p < 0,05 como estadísticamente significativo.
NOTA: Todo el análisis se realizó usando GraphPad Prism versión 10.
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Resultados
Aquí, ratones machos DBA/1J de 8 semanas son inmunizados con una emulsión que contiene colágeno bovino tipo II y CFA en una proporción 1:1 en el día 0 y el día 21. La puntuación clínica de artritis y las mediciones del grosor de las patas se realizan cada 1-3 días entre el día 0 y el 42. Normalmente, el inicio de la artritis se observa alrededor del día 28, con la puntuación clínica de artritis y el grosor de las patas alcanzando su máximo alrededor del día 35 (Figur...
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Discusión
La imagen in vivo de las articulaciones, a diferencia de los estudios tradicionales de endpoint, ofrece una visión sin precedentes sobre los procesos biológicos dinámicos en ratones vivos. Por ejemplo, esta técnica nos permite entender cómo cuatro receptores diferentes de quimioatrayentes - C5aR1, BLT1, CCR1 y CXCR2 - colaboran para iniciar el reclutamiento de neutrófilos en articulaciones inflamadas en laartritis 10,11....
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Divulgaciones
Y.M. recibió subvenciones/apoyo de investigación de Chugai Pharmaceutical Co., Ltd.
Agradecimientos
El trabajo de Y.M. cuenta con el apoyo de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (JSPS) KAKENHI [subvención número JP22K08531, JP25K02574]; Agencia Japonesa para la Investigación y el Desarrollo Médico (AMED) [Número de subvención 25bm1423033]; la Fundación Conmemorativa Mochida para la Investigación Médica y Farmacéutica; La subvención JCR para la promoción de la investigación para FRONTIER y la Fundación Mitsubishi.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 29 G x 1/2" | Terumo | SS-10M2913 | |
| 0,1 M ácido acético | Fujifilm | 016-18835 | |
| Jeringuilla plástica de 1 mL | ARRIBA | 19531 | |
| Jeringuilla de 1 mm para grasa | Terumo | SS-01T | |
| 18 G x 1 1/2" | Terumo | NN-1838R | |
| 26 G x 1/2" | Terumo | NN-2613S | |
| 680-250 kDa dextrán | Biotium | 80135 | |
| Agarose | invitrogen | 16520-100 | |
| Colágeno bovino tipo II | Centro de Investigación del Colágeno | K42 | |
| Clay | Debika | 93186 | |
| Un auténtico desastre' s adjuvante (CFA) | Chondrex | 7001 | |
| Microscopio confocal | Nikon | A1 | |
| Vidrio de cubierta | Matsunami Glass IND., Ltd | C024401 | |
| Pinza digital de la corredera | Mitsutoyo | 500-180-30 | |
| Tubo Falcon (15 mL) | Corning | NA | |
| Tubo Falcon (50 mL) | Corning | NA | |
| Anticuerpo anti-ratón Ly6G conjugado con FITC | Bioleyenda | 127606 | |
| Pinzas | Roboz | RS-5070 | |
| Pinzas | NAPOX | MA-48-2 | |
| Jeringuilla de vidrio y conector | Tsubasa Industry Co., Ltd | S7P | |
| Grasa | Toray Dow Corning Silicona | NA | |
| Máquina de cortar pelo | Wahl | WA5109 | |
| Máquina de cortar pelo | Wahl | 9966 | |
| Depilación crè Yo | Kracie | N/A | |
| Medetomidina | Meiji | N/A | |
| Microtijeras | Roboz | RS-5610 | |
| Microtijeras | Roboz | RS-5630 | |
| Midazolam | Sandoz | N/A | |
| Gasa húmeda | Nippon Paper Crecia Co., Ltd | S-200 | |
| Análisis de imágenes NIS-Elements 6.20.00 | Nikon | NA | |
| PBS en tubo Falcon (50 mL) | Shimadzu Diagnostics Corporation | 5913 | |
| Anticuerpo anti-ratón conjugado con PE CD4 | Bioleyenda | 100408 | |
| Placa de plástico | Corning | 351029 | |
| Prism 10.3.1 | GraphPad | NA | |
| Vidrio deslizante | Muto Pure Chemicals Co., Ltd | 5115 | |
| Alcance quirúrgico | Olimpo | VMZ | |
| Enlace tisular | 3M | 1469SB | |
| Vetorphale | Meiji | N/A |
Referencias
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- Miyabe, Y., Lian, J., Miyabe, C., Luster, A. D. Chemokines in rheumatic diseases: pathogenic role and therapeutic implications. Nat Rev Rheumatol. 15 (12), 731-746 (2019).
- Griffith, J. W., Sokol, C. L., Luster, A. D. Chemokines and chemokine receptors: positioning cells for host defense and immunity. Annu Rev Immunol. 32, 659-702 (2014).
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Reimpresiones y permisos
