Para comprender la dinámica de la red de microcircuitos de la neocorteza, que es esencial para grabar simultáneamente la actividad de un gran número de neuronas. En vivo de dos fotones de imágenes de calcio es el único método que permite grabar la actividad de una densa población neuronal con una sola célula de resolución.
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Artículo de método
En Vivo 2-Photon imágenes de calcio en la capa 2 / 3 de los ratones
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Resumen
Resumen
Para comprender la dinámica de la red de microcircuitos de la neocorteza, que es esencial para grabar simultáneamente la actividad de un gran número de neuronas. En vivo de dos fotones de imágenes de calcio es el único método que permite grabar la actividad de una densa población neuronal con una sola célula de resolución. El método consiste en la implantación de una ventana de imagen del cráneo, se inyecta una solución de calcio indicador fluorescente que puede ser ocupado por un gran número de neuronas y, por último registro de la actividad de las neuronas con las imágenes de calcio lapso de tiempo con una in-vivo dos microscopio de fotones. Co-inyección de astrocito específicos colorantes permite diferenciar las neuronas de los astrocitos. La técnica puede llevarse a cabo en ratones que expresan moléculas fluorescentes en subpoblaciones específicas de neuronas para entender mejor las interacciones en la red de los diferentes grupos de células.
Protocolo
- Prepare la solución de calcio indicador fluorescente. Usamos tintes acetoximetil éster, o AM tintes para el cortocircuito. Estos son los tintes que pueden ser absorbidos por las células cuando se inyecta extracelular. Por lo general el uso de Oregon-Green BAPTA-1 AM o Fluo-4 AM a una concentración de 1 mM. Colorantes AM se puede obtener de Invitrogen en viales de 50 microgramos. En primer lugar, preparar una solución al 20% de Pluronic F-127 en DMSO. Calentamos la solución antes de usar todos los días hasta su claro. Disolvemos el indicador de calcio F-127/DMSO Pluronic 20% durante 15-20 minutos a una concentración de 10 mM. A continuación, se diluye la solución a 1 mM en una soluci....
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Discusión
La ventaja de este método sobre los registros electrofisiológicos es que es menos invasiva y permite que las grabaciones de la actividad en las densas redes neuronales neuronal. Al hacer este procedimiento s importante recordar que tener sumo cuidado al realizar la craneotomía para no dañar la duramadre. Incluso una pequeña cantidad de sangrado subdural con mucho oscurecer la imagen.
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Agradecimientos
Queremos agradecer a Olga Garaschuk útil para los debates sobre la optimización de la carga masiva de los indicadores de calcio.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios | |
|---|---|---|---|---|
| Oregon Green BAPTA1-AM | Reactivo | Invitrogen | O-6807 | |
| Fluo 4- AM | Reactivo | Invitrogen | F-14201 | |
| Sulforodamina 101 | Reactivo | Invitrogen | S-359 | |
| Plurónico F-127 en DMSO | Reactivo | Invitrogen | P-3000MP | |
| Filtro centrífugo (0,45 micrones) | Reactivo | EMD Millipore | UFC3 0HV 0S |
Referencias
- Garaschuk, O., Milos, R. I., Konnerth, A. Targeted bulk-loading of fluorescent indicators for two-photon brain imaging in vivo. Nat Protoc. 1, (2006).
- Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. In-vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks.
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