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In vitro Exposiciones al cannabis de las células epiteliales pulmonares en la interfaz aire-líquido

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DOI:

10.3791/68102

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20 de junio de 2025

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1Department of Pharmacology and Therapeutics, McGill University, 2Research Institute of the McGill University Heath Centre, 3SCIREQ - Scientific Respiratory Equipment Inc., 4Department of Biology, University of Ottawa, 5Department of Medicine, McGill University

En este artículo

Resumen

Establecemos un modelo estandarizado in vitro para estudiar la exposición al vapor de cannabis en la interfaz aire-líquido. Este modelo proporciona un enfoque sistemático para examinar los impactos del cannabis vaporizado, abordando el creciente interés en los vaporizadores de cannabis como alternativa a fumar.

Resumen

Se estima que 192 millones de personas consumen cannabis en todo el mundo. La mayoría de las personas consumen cannabis a través de la inhalación de humo de cannabis, que contiene subproductos de la combustión que pueden afectar negativamente a la salud pulmonar. El conocimiento de estos riesgos ha llevado a un creciente interés por los vaporizadores de cannabis, que calientan la flor seca de cannabis sin quemarse. La vaporización del cannabis sigue liberando cannabinoides para su inhalación, pero calienta el material vegetal a una temperatura más baja. Actualmente no existe un modelo in vitro estandarizado para evaluar los efectos del vapor seco de cannabis. Por lo tanto, establecimos un modelo para la exposición de cultivos de células pulmonares en una interfaz aire-líquido (ALI), mediante el cual las células se exponen apicalmente al cannabis vaporizado, simulando así con mayor precisión la fisiología de las células epiteliales pulmonares. Este protocolo garantiza un suministro consistente y reproducible de vapor de cannabis a la superficie celular, proporcionando una plataforma fiable para investigar los impactos celulares y moleculares del cannabis vaporizado. Este trabajo es el primero en estandarizar un método de administración de vapor de cannabis in vitro , que puede servir como punto de referencia para futuras investigaciones preclínicas sobre el cannabis.

Introducción

El cannabis se utiliza normalmente inhalando el humo de la combustión de la flor de la planta en forma de porro, ya sea con fines recreativos o medicinales. Las principales actividades biológicas del cannabis se deben a cannabinoides como el Δ 9-tetrahidrocannabinol (Δ9-THC) y el cannabidiol (CBD), que se liberan en el cuerpo al inhalar. El humo del cannabis también contiene compuestos pirogénicos, como carcinógenos, mutágenos y teratógenos, que tienen el potencial decausar resultados adversos para la salud. Dadas estas preocupaciones, existe interés en recurrir a vaporizadores de cannabis que calientan la flor de cannabis sin quemarse, con la esperanza de que esto permita la liberación de cannabinoides para su posterior inhalación pero sin productos de combustión. Se han realizado algunos trabajos para caracterizar los componentes químicos del vapor de cannabis, mostrando la presencia de cannabinoides, pero también de varios tóxicos respiratorios, desafiando la noción de que estos dispositivos son seguros 2,3. Existen importantes lagunas en el conocimiento sobre cómo el cannabis vaporizado afecta a los pulmones y otros órganos.

Los estudios de cultivos celulares son esenciales en toxicología para aislar y comprender los efectos específicos de las sustancias inhaladas a nivel celular, lo que permite obtener información de alto rendimiento, rentable y mecanicista que es relevante para la biología humana. El método de cultivo de las células también es un determinante importante de los resultados generales obtenidos de un experimento in vitro . La mayoría de los estudios de cultivo celular se realizan en un entorno sumergido, donde las células se cultivan en plástico y se exponen apicalmente a medios acuosos. Sin embargo, las células epiteliales de las vías respiratorias presentan un desafío único en este sentido. En todo el sistema respiratorio, la superficie apical de las células epiteliales está en contacto con el aire. Dentro de los alvéolos, las células epiteliales producen surfactante, mientras que otras células epiteliales de las vías respiratorias producen moco; En conjunto, esto protege y mantiene la función pulmonar. Los cultivos sumergidos no logran replicar la exposición al aire apical, lo que limita su capacidad para modelar con precisión el entorno in vivo . Una alternativa a los modelos de cultivo sumergido es el cultivo en la interfaz aire-líquido (ALI), donde las células epiteliales respiratorias se cultivan en una membrana recubierta de colágeno con medios en el lado basolateral mientras se exponen apicalmente al aire. Las células epiteliales cultivadas en ALI son modelos más precisos del epitelio respiratorio debido a su capacidad para polarizarse, producir surfactante o moco y formar uniones en este entorno4.

Una consideración adicional a la que se enfrentan los métodos tradicionales de cultivo celular sumergido es que los compuestos hidrofóbicos como los cannabinoides se solubilizan mal en medios acuosos5. Los extractos etanólicos son un solvente común para estudiar compuestos hidrofóbicos en cultivos sumergidos 6,7,8,9,10,11,12. Estos extractos permiten que tanto los compuestos hidrofóbicos como los hidrofílicos se disuelvan en un medio acuoso. Sin embargo, una limitación es el potencial de aglomeración de compuestos, así como los compuestos que interactúan con el medio, los cuales pueden alterar la biodisponibilidad13,14. Recientemente se han producido avances que permiten que los compuestos en fase de aerosol se entreguen a las células en ausencia de un disolvente o medio utilizando sistemas de exposición avanzados como el expoCube15 (sistema de exposición in vitro ALI/Transwell in vitro/ex vivo), así como otros. La deposición directa de aerosoles y suspensiones de partículas mediante un sistema de exposición avanzado elimina el proceso de recolección-resuspensión crucial para las exposiciones sumergidas, que se sabe que altera sustancialmente las propiedades fisicoquímicas de las partículas16. En este trabajo, describimos un protocolo estandarizado para la exposición de una línea celular epitelial alveolar en ALI.

Protocolo

1. Cultivo de células epiteliales pulmonares en ALI

NOTA: Aquí se describe un protocolo para el cultivo de células A549 en ALI. Revise la bibliografía sobre el tipo de célula que se utilizará en el estudio. Las diferentes líneas celulares necesitan una cantidad diferente de tiempo en ALI para diferenciarse, formar uniones estrechas y producir surfactante/moco.

  1. Cultivo celular
    1. Prepare los medios agregando 50 mL de suero fetal bovino (FBS) inactivado por calor, 5 mL de Glutamax, 5 mL de antibiótico-antimicótico y 500 μL de Gentamicina a un frasco de 500 mL de DMEM.
    2. Coloque los medios preparados en un baño de agua durante 10-15 minutos para que se calienten a 37 °C.
    3. Rocíe la cabina de bioseguridad con etanol al 70% y límpiela. Una vez que el medio se haya calentado, colóquelo debajo de la cabina de bioseguridad esterilizada.
    4. Debajo de la cubierta de cultivo, pipete aproximadamente 10 mL de medio en un tubo de 15 mL.
    5. Recupere las células del nitrógeno líquido y descongele agitándolas suavemente en un baño de agua.
    6. Bajo la campana de cultivo, pipetear las células descongeladas del criovial en el tubo de 15 mL.
    7. Centrifugar el tubo de 15 mL a 300 g durante 5 min.
    8. Retire con cuidado el sobrenadante sin alterar el pellet.
    9. Mezcle el pellet con el medio y transfiéralo al matraz T75 .
    10. Revise el matraz T75 bajo un microscopio.
    11. Incubar las celdas a 37 °C, 5% de CO2 con humedad saturante.
    12. Actualice los medios de cultivo celular cada 2-3 días.
    13. Pase y crezca las células hasta alcanzar el recuento de células deseado. Para sembrar una placa de 12 pocillos, se requieren 3 × 106 celdas.
  2. Recubrimiento de colágeno de transwells
    1. Preparación de la solución de colágeno
      1. Disolver 10 mg de colágeno Tipo IV en 20 mL de ddH2O con 50 μL de ácido acético glacial.
      2. Incubar a 37 °C durante 30 min, agitando de vez en cuando, hasta que se disuelva por completo.
      3. Esterilice la solución filtrándola a través de un filtro de 0,22 μm.
      4. Alícuota 1,5 mL de la solución en tubos de 15 mL y almacenar a -20 °C.
    2. Recubrimiento de filtros transwell con colágeno tipo IV
      1. Descongele un tubo de colágeno tipo IV (50 μg/mL) a partir de -20 °C.
      2. Agregue 150 μL de colágeno a cada filtro Transwell.
        NOTA: Solo las placas de 12 pocillos son compatibles con el sistema de exposición.
      3. Deje las placas con las tapas abiertas en la cabina de bioseguridad (BSC) durante 18 h para que se sequen.
      4. Esterilizar exponiendo a luz ultravioleta (UV) durante 30 min.
    3. Guarde las placas a 4 °C, envueltas en parafilm, hasta por 30 días.
    4. Antes de colocar las celdas, enjuague ambos lados de los filtros con solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS).
  3. Siembra de células en insertos y transición a ALI
    1. Preparación de la suspensión de placas y celdas
      1. Pipetee 1,5 mL de medio preparado precalentado en cada pocillo de la placa de 12 pocillos.
      2. Coloque la placa en la incubadora a 37 °C y 5% de CO2.
      3. Prepare una suspensión celular con una concentración de 5 × 105 células/mL en medios preparados.
    2. Células de siembra en insertos
      1. Retire la placa de cultivo celular preparada de la incubadora y colóquela debajo de un gabinete de bioseguridad esterilizado.
      2. Pipetear 0,5 mL de la suspensión celular (2,5 × 105 células/inserto) en la parte superior de la membrana del inserto.
      3. Cubra la placa con su cubierta de placa y vuelva a colocarla en la incubadora a 37 °C y 5% de CO2.
    3. Establecer ALI
      1. Retire los medios apicales 24 h después de sembrar las células.
      2. Reemplace el medio basolateral con 0,6 mL de medio preparado. En este punto, las células se exponen apicalmente al aire, estableciendo la ALI.
      3. Cultive las células A549 en ALI durante un máximo de 2 semanas, cambiando el medio cada 2 días para permitir que las células se diferencien como se ha caracterizado anteriormente4.

2. Evaluación dosimétrica de la exposición al vapor de cannabis mediante LC/MS

NOTA: En esta parte del protocolo, se utilizaron métodos libres de células para caracterizar la dosis de vapor de cannabis depositada dentro de cada pocillo mediante el análisis de las concentraciones de Δ9-THC. El δ9-THC se adhiere a los materiales plásticos, por lo que solo se deben usar viales de vidrio para la recolección de muestras. Este método requiere que la variedad de cannabis elegida contenga Δ9-THC.

  1. Preparación y puesta a punto del sistema de exposición
    1. Configure la tubería para el sistema de exposición de acuerdo con la ruta de flujo especificada (Figura 1A, B): Unidad ENDS > Condensador > Bomba de Soplado > Conjunto de Muestreo Isométrico con bomba Aeroneb > Sensor de Humedad de > expoCube con Filtro > Puerto de Flujo de Exposición expoCube.
    2. Encienda los controles de temperatura para calentar el sistema a 35 °C y 50 °C.
    3. Realice pruebas de flujo para asegurarse de que el sistema esté libre de fugas y que las presiones estén correctamente configuradas (consulte la nota técnica de SCIREQ: Una guía para solucionar problemas de flujos irregulares en el expoCube).
    4. Ponga en marcha las bombas Aeroneb para lograr una humedad relativa superior al 75%.
  2. Pruebas de dosimetría y preparación del vaporizador
    1. Preparación del vaporizador de cannabis
      1. Muele la flor de cannabis con un molinillo de hierbas.
      2. Pesa 0,25 g de alícuotas, usando un separador de pastillas para organizar cada porción.
      3. Coloque los insertos de acero inoxidable en la fila de exposición de la placa de transpozo de 12 pocillos dentro del sistema de exposición.
  3. Exposición de insertos de acero inoxidable al vapor de cannabis
    1. Comenzar la exposición
      1. Llena el horno vaporizador con 0,25 g de cannabis.
      2. Conecta el vaporizador de cannabis a la unidad ENDS del sistema de exposición con una junta segura y comienza el régimen de inhalación deseado. Ajusta el vaporizador a la configuración de temperatura Smart Path Nivel 2 .
        NOTA: El sistema de exposición utilizado en este estudio tiene cuatro niveles de ruta inteligente para elegir, incluidos el Nivel 1 (176-188 °C), el Nivel 2 (188-199 °C), el Nivel 3 (199-210 °C) y el Nivel 4 (210-221 °C).
      3. Cree un perfil de puff en el software flexiWare (software de adquisición de datos; consulte la nota técnica de SCIREQ: Una guía para crear perfiles para flexiWare 8). Para este protocolo, utilice un volumen de inhalación de 70 ml con una frecuencia de 4 inhalaciones/min.
      4. Pon en marcha el vaporizador de hierba seca durante 5 minutos antes de cambiar de cannabis, retirando la flor de cannabis del horno vaporizador y añadiendo 0,25 g de cannabis fresco al vaporizador. Alterna entre dos vaporizadores para una exposición continua.
      5. Continúe con los pasos 2.3.1.1-2.3.1.4 hasta alcanzar el tiempo de exposición deseado.
    2. Después de cada exposición, retire con cuidado los insertos del sistema de exposición con pinzas y prepárelos para la recolección de muestras como se describe a continuación.
  4. Recolección y preparación de muestras para análisis de LC/MS
    1. Con pinzas, coloque los filtros correspondientes a cada exposición en un frasco de vidrio etiquetado que contenga 10 mL de metanol de grado LC/MS (p. ej., Exposición 1, Exposición 2, Exposición 3).
    2. Lave el inserto.
      1. Coloque cada inserto de acero inoxidable expuesto en un vial de vidrio etiquetado que contenga 10 mL de metanol de grado LC/MS.
      2. Etiquete los viales según la exposición (p. ej., Exposición 1 Pozo 1-4).
    3. Extracto Δ9-THC
      1. Utilice un baño de sonicación para sonicar los viales con insertos durante 10 minutos para extraer el Δ9-THC.
      2. Transfiera los insertos a un segundo juego de viales de vidrio con 10 ml de metanol fresco y sonique durante 10 minutos más.
    4. Envíe todas las muestras preparadas (pocillos, lavado y filtro) para el análisis de LC/MS para cuantificar los niveles de Δ9-THC.
  5. Cálculos de dosimetría
    1. Utilizando los resultados del análisis LC/MS, calcule la cantidad de Δ9-THC depositado para determinar la dosimetría del flujo de exposición (cantidad depositada en el filtro) y la dosimetría en el pocillo.
    2. Calcule la relación entre el filtro de flujo de exposición y la deposición del pozo para Δ9-THC.
    3. Utilice esta proporción para determinar la dosis que se administrará a las células durante las exposiciones.

3. Evaluación dosimétrica de la exposición al vapor de cannabis mediante una microbalanza de cristal de cuarzo

NOTA: Este método detalla la configuración y calibración de una microbalanza de cristal de cuarzo (QCM) para evaluar la masa de las partículas de vapor de cannabis depositadas durante las exposiciones. Cada QCM proporciona mediciones en tiempo real, lo que permite una dosimetría precisa de la exposición al vapor de cannabis.

  1. Preparación y configuración del QCM en el sistema de exposición
    1. Configure el sistema de exposición como se ha descrito anteriormente.
    2. Conecte cada QCM a su módulo electrónico mediante el conector de clip y conecte el módulo a las entradas de la unidad inExpose (plataforma de exposición por inhalación) con un conector de 7 pines.
    3. Coloque los insertos QCM en una placa de pocillos en el lado de exposición del sistema de exposición, asegurándose de que el QCM esté bien alineado.
    4. Precaliente el sistema de exposición con QCM adjuntos hasta que el sistema se estabilice a las temperaturas objetivo de 35 °C y 50 °C.
    5. Activar los microflujos y los flujos de exposición según los ajustes experimentales.
  2. Calibración del QCM
    1. Utilice el asistente de calibración del software de adquisición de datos para calibrar el QCM antes de cada ejecución de exposición.
    2. Espere a que la barra de calibración azul se estabilice, luego seleccione Siguiente para registrar la frecuencia de resonancia de QCM para cálculos de masa precisos.
      NOTA: El rango de calibración esperado es de -15% a 15%. Las desviaciones pueden indicar problemas como un QCM sucio o un conector LEMO desconectado.
  3. Monitoreo en tiempo real de las señales QCM
    1. Supervise las salidas de QCM; El sistema emite la masa acumulada depositada. El valor se muestra en el software de adquisición de datos como parte de un gráfico y el valor actual real.
      NOTA: Para cada ejecución experimental, la deposición máxima y mínima también se informa en el software.
  4. Limpieza del QCM
    1. Para mantener la precisión, limpie el QCM después de cada experimento.
    2. Agregue 1 mL de alcohol isopropílico al 70% dentro de cada inserto QCM.
    3. Pipetea la solución de alcohol hacia arriba y hacia abajo 2-3 veces para disolver los residuos.
    4. Retire la solución de alcohol y deje que el QCM se seque completamente al aire en un entorno libre de polvo antes del próximo uso.

4. Resultados de la exposición de las células al vapor de cannabis

NOTA: Este protocolo está diseñado para evaluar los efectos del vapor de cannabis en las células respiratorias cultivadas en ALI utilizando el sistema expoCube. Los ensayos posteriores a la exposición, que incluyen bromuro de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT) y lactato deshidrogenasa (LDH), proporcionan información sobre la citotoxicidad dependiente de la dosis y la actividad metabólica.

  1. Entrega de vapor de cannabis
    1. Configure el sistema de exposición como se describe anteriormente: Asegúrese de que el sistema haya alcanzado una temperatura de 35 °C y 50 °C y niveles de humedad relativa superiores al 75%.
    2. Si utiliza un QCM, conecte el dispositivo a su módulo electrónico mediante el conector de clip y conecte el módulo a las entradas de la unidad de exposición a la inhalación con un conector de 7 pines. Coloque el inserto QCM singular en una placa de pocillo en el lado de exposición del expoCube, asegurándose de que el QCM esté bien alineado.
    3. Abra el sistema de exposición y coloque la placa de cultivo celular en su interior.
    4. Comience el régimen de inhalación durante la duración deseada según la sección 2. El uso del QCM permitirá el seguimiento en tiempo real del vapor total depositado.
    5. Después de la exposición, devuelva las células a la incubadora hasta el punto de tiempo de ensayo deseado.
    6. Recoja muestras según sea necesario de varios compartimentos, incluido el compartimento basolateral, el lavado del compartimento apical (para surfactante o moco) y el lisado de células.
    7. Ensayos de selección de dosis: Utilice los ensayos LDH y MTT para ayudar a determinar la dosis óptima y la citotoxicidad potencial.
  2. Ensayo de LDH para células en ALI
    1. Recoja los medios: En el momento deseado después de la exposición, recoja los medios del compartimento basolateral.
    2. Transfiera 100 μL de los medios recolectados a una microplaca transparente de 96 pocillos.
    3. Agregue 100 μL de mezcla de reacción de LDH recién preparada a cada pocillo.
    4. Incubar la placa a temperatura ambiente (15-25 °C) durante 30 min, protegiéndola de la luz.
    5. Mida la absorbancia a 490-492 nm, utilizando una longitud de onda de referencia superior a 600 nm.
    6. Calcule la citotoxicidad utilizando la siguiente fórmula:
      Citotoxicidad (%) = (valor experimental-control negativo)/(control positivo-control negativo) x 100
  3. Ensayo MTT para células en ALI
    1. Cultivo de células A549 en ALI como se estableció previamente.
    2. Después de la administración de la exposición en el sistema de exposición, devuelva las células a la incubadora hasta el punto de tiempo de ensayo deseado.
    3. Disuelva 1 mg de MTT en 1 mL de PBS para hacer la solución de MTT.
    4. Añadir 500 μL de solución de MTT en el lado apical de las células y 500 μL de solución de MTT en el compartimento basolateral.
    5. Regrese las células a la incubadora a 37 °C durante 1 h.
    6. Retire con cuidado todos los medios.
    7. Añadir 500 μL de dimetilsulfóxido (DMSO) en el lado apical y 1.000 μL de DMSO en el lado basolateral.
    8. Incubar durante 1 h para disolver los cristales de formazano.
    9. Recoja y combine la solución desde el lado apical y basolateral.
    10. Mida la absorbancia a 540 nm (OD540) con una referencia a 690 nm (OD690).
    11. Calcule la viabilidad de la célula utilizando la siguiente fórmula:
      Viabilidad celular (%) = 100 × (OD_exposure/Promedio OD_negative control)

Resultados

Durante los experimentos con el sistema expoCube, cuatro pocillos reciben la exposición al vapor de cannabis, cuatro pocillos están expuestos al aire acondicionado como controles de vehículos y los cuatro pocillos restantes están completamente cerrados como controles negativos (Figura 1C)17. Esta configuración permite una comparación precisa entre las condiciones tratadas, del vehículo y negativas. El sistema se humidifica para crear un ambiente adecuado para los cultivos celulares (Figura 2), y la regulación de la temperatura dentro del sistema mejora la deposición de partículas a través de la termoforesis, lo que permite la entrega eficiente de compuestos vaporizados alas células. Para cuantificar la exposición, medimos la cantidad de Δ9-THC como marcador de la deposición de vapor de cannabis en el sitio de exposición de la célula. Esta cuantificación es crucial para optimizar los tiempos de exposición y las dosis, lo que permite a los investigadores ajustar los períodos de exposición activa para lograr las dosis deseadas en los experimentos de cultivo celular (Figura 3). Al calcular la proporción de Δ9-THC recolectado en el filtro de flujo de exposición a la cantidad depositada en los pocillos individuales, podemos estimar la dosis real entregada a las células (Tabla 1). Esta dosis calculada informa el rango de exposición deseado, lo que ayuda a determinar los parámetros óptimos para estudiar las respuestas celulares al vapor de cannabis de una manera consistente y medible. Esto se puede realizar con otros cannabinoides, dependiendo del perfil de cannabinoides de la cepa de cannabis seleccionada. Además, se puede realizar un análisis QCM para medir la deposición de vapor de cannabis en tiempo real. La figura 4 muestra la deposición de vapor de cannabis durante un curso de tiempo de 30 minutos en el que el vaporizador y el material de cannabis se cambiaron cada 5 minutos. Cada pocillo mostró un aumento constante de masa a lo largo del tiempo, lo que indica una deposición efectiva y continua de partículas enteras de vapor de cannabis.

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Figura 1: Esquema del sistema de exposición in vitro/ex vivo ALI/Transwell para la exposición al vapor de cannabis en el ALI. (A) El vaporizador DaVinci MIQRO se utilizó para generar vapor de cannabis. Esta muestra se humedece y se transporta a través del muestreador isocinético hasta el sitio de exposición. La unidad de control permite ajustar las salidas de flujo de aire y los gradientes de temperatura. (B) Fotografías de la configuración del sistema de exposición. (C) El interior del expoCube está compartimentado en tres filas: una fila de prueba para la exposición al vapor de cannabis, una fila de control del vehículo de aire acondicionado y la fila de control negativo cerrada que permanece intacta por cualquier flujo de aire. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Perfil de humedad relativa (%) registrado a lo largo del tiempo. Estos datos muestran los niveles de humedad relativa cuando se activan los Aeronebs, alcanzando y manteniendo una humedad media del 75%. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Cuantificación de la deposición de Δ 9-THC mediante análisis LC/MS tras exposiciones de 30 minutos al vapor de cannabis. (Un-C) Se midió la deposición de δ9-THC en cada pocillo después de tres exposiciones independientes de vapor de 30 minutos, cada una utilizando 1,5 g de un cultivar de cannabis con alto contenido de THC. Los niveles de Δ9-THC se cuantificaron mediante LC/MS. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: Mediciones de QCM de la deposición de vapor de cannabis en el sistema de exposición in vitro/ex vivo ALI/Transwell durante un régimen de exposición de 30 minutos. (A-D)Cada gráfico representa la deposición acumulada de partículas de vapor de cannabis en los pozos 1-4, con la masa medida en microgramos (μg) a lo largo del tiempo. La tasa de deposición demuestra una acumulación constante en todos los pozos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Deposición del filtro de flujo primario (μg)Deposiciones de pozos (μg)Porcentaje de caudal primario depositado en el pozo (%)
Exposición 12142.34.70.22
4.40.2
4.60.22
4.40.21
Exposición 22726.54.10.15
3.90.14
4.40.16
4.60.17
Exposición 324003.60.15
3.80.16
50.21
40.17
Promedio2422.94.30.18
Desviación estándar292.80.40.03

Tabla 1. Comparación de la deposición de Δ9-THC en el sistema de exposición in vitro/ex vivo ALI/Transwell entre el filtro de flujo de exposición y el sitio de exposición de la célula.

Discusión

El cultivo de células en el ALI es un método importante en la investigación respiratoria debido a su capacidad para representar con mayor precisión las condiciones de las vías respiratorias in vivo en comparación con los cultivos sumergidos tradicionales19. El cultivo en ALI permite que las células epiteliales pulmonares se expongan directamente al aire en su superficie apical mientras se mantienen los nutrientes esenciales del medio de cultivo en el lado basolateral. Esta configuración permite que las células produzcan surfactante o moco, componentes clave del mecanismo de defensa respiratoria que son críticos para atrapar y eliminar las partículas inhaladas y los patógenos 20,21,22. Las células A549 se emplean comúnmente para estudios in vitro, pero son solo uno de los muchos cultivos de células epiteliales respiratorias que se pueden usar para la ALI. Silva et al. han revisado líneas celulares y cultivos primarios del epitelio respiratorio para ALI desde la cavidad nasal hasta los alvéolos22. La flexibilidad del sistema de exposición ALI presentado permite adaptarlo a diferentes líneas celulares y células primarias.

Los cultivos de ALI se consideran cada vez más como el "estándar de oro" para los estudios de inhalación in vitro , en particular para la investigación de contaminantes atmosféricos, partículas y otros agentes inhalables23. Una de las principales ventajas de los modelos ALI radica en su capacidad para proporcionar información que es más traducible a efectos humanos in vivo . Sin embargo, un inconveniente notable es la falta de protocolos estandarizados para las exposiciones a ALI, lo que afecta a la reproducibilidad y comparabilidad entre estudios. Una de las lagunas es un flujo de trabajo de exposición estandarizado. Al exponer las células al vapor de cannabis en el ALI, se pueden evaluar los impactos del cannabis en la función celular, la viabilidad y la citotoxicidad. Estas exposiciones permiten una evaluación detallada de los resultados biológicos, incluidos los marcadores de citotoxicidad, inflamación y estrés oxidativo. La cuantificación precisa de los cannabinoides depositados permite realizar estudios reproducibles sobre los efectos celulares del vapor de cannabis (y otras formas de productos de cannabis), lo que permite avanzar en nuestra comprensión de sus posibles impactos sobre la salud en un entorno de laboratorio controlado.

Los sistemas de exposición avanzados abordan las limitaciones de los cultivos sumergidos tradicionales al permitir la deposición directa de partículas en la superficie celular, proporcionando así exposiciones más relevantes fisiológicamente. Esto también reduce los efectos potenciales de los disolventes o portadores. Al permitir la deposición directa de partículas sin la necesidad de estos solventes, los sistemas de exposición ayudan a minimizar los efectos relacionados con el vehículo. No obstante, persisten algunas consideraciones relacionadas con los vehículos. Por ejemplo, los niveles de humedad incontrolados pueden causar estrés celular no deseado24, lo que podría afectar los resultados experimentales. Asegurarse de que la humedad se regule cuidadosamente para alcanzar niveles óptimos es esencial para mantener la estabilidad celular y la precisión en los resultados. Además, cada mezcla de partículas, aerosoles o gases tiene sus propias propiedades fisicoquímicas únicas, que podrían alterar la deposición en la superficie de la célula25. Por lo tanto, es importante caracterizar un régimen de exposición para cada producto único. Los factores que podrían afectar la deposición de partículas incluyen la termoforesis, el movimiento de partículas de una región de temperatura más alta a menor26. La termoforesis ayuda a dirigir las partículas hacia las células y mejora la eficiencia de la deposición.

La consistencia y la precisión de la dosificación son desafíos adicionales cuando se trabaja con sistemas de exposición en el ALI, particularmente cuando se involucran aerosoles o partículas. La deposición de partículas in vivo en el pulmón es un proceso complejo influenciado por el tamaño, la forma, la densidad y la solubilidad de las partículas, así como por la región específica del pulmón que se expone27. Estos factores dan como resultado tasas de deposición variadas que pueden ser difíciles de replicar in vitro. Los modelos matemáticos, como la dosimetría de partículas multitrayecto (MPPD), son herramientas útiles para estimar las tasas de deposición in vivo y guiar la traducción de la dosis in vitro 28. Sin embargo, la adaptación de la dosificación in vitro a los escenarios de exposición in vivo sigue siendo un reto, especialmente en el caso de aerosoles complejos con composiciones heterogéneas.

Para la caracterización de la dosis libre de células, es importante tener en cuenta que los lavados de insertos de acero inoxidable tienden a sobrestimar la deposición, ya que los compuestos pueden adherirse tanto a las paredes del inserto como a la base donde normalmente se ubicarían las células. El QCM ofrece una ventaja en este caso, ya que mide solo la masa depositada directamente en el lugar de cultivo celular, lo que proporciona una evaluación más precisa de la deposición específicamente relevante para la exposición celular.

A medida que la toxicología avanza hacia modelos fisiológicamente más relevantes, la adopción de protocolos unificados de exposición a ALI será fundamental para cerrar la brecha entre los hallazgos in vitro y las respuestas humanas in vivo , lo que en última instancia respaldará evaluaciones más confiables de los tóxicos respiratorios y sus impactos en la salud.

Divulgaciones

PG y BU están empleados en SCIREQ - Scientific Respiratory Equipment, Inc. ETW completó una pasantía en SCIREQ - Scientific Respiratory Equipment, Inc. a través del Programa Mitacs Accelerate. Los otros autores no tienen conflictos que revelar

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por el 162273 de subvenciones para proyectos de los Institutos Canadienses para la Investigación en Salud (CIHR). CJB contó con el apoyo del Fonds de Recherche du Québec -Santé (FRQS). Este estudio también contó con el apoyo de una subvención de Mitacs #IT34076 a ETW.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Tubo de centrífuga de 15 ml, gradilla (gradilla de poliestireno), estérilMontreal Biotech Inc.
viales de vidrio de 30 mlThomas Scientific1755F32
A549 célulasATCCCCL-185
Antibiótico-antimicótico (100x)Wisent450-115-EL
Molinillo de hierbas de cannabis Genchihttps://www.amazon.ca/Genchi-Grinder-Crystal-Threads-Premium/dp/B094WX443Y/ref=sr_1_10?crid=A1EV93N8PW1V&dib=eyJ2Ijo
iMSJ9.WX_vMBLeAHzc6JplZiba8i
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GDLXKn-ovr6On-5g1G0_oK5mrHdj
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palabras clave=hierba%2Bgrinder& qid=1736346511&
sprefix=herb%2Bgrinder%2Caps%
2C168& sr = 8-10 y th=1
Colágeno de placenta humana, tipo IVSigma-AldrichC7521
Costar 12 mm transwell, 0,4 µ Membrana de poliéster de poro m InsertosStemcell Technologies38023
Kit de detección de citotoxicidad (LDH)Roche11644793001
Davinci MIQRO-C vaporizador de hierbas secasDAVINCIhttps://davincivaporizer.com/products/davinci-miqro-c
DimetilsulfóxidoSigma-Aldrich34869
Medio DMEMWisent319-005-CL
Flor de cannabis secaSocié té qué bé coise du cannabishttps://www.sqdc.ca/en-CA/dried-cannabis?&fn1=CannabinoidBalanceLookup
Value&fv1=THC		Contenido de cannabinoides: 17– 23% de THC < 0,1% de CBD
Suero fetal bovinoWisent080-150FBS
flexiWare SCIREQhttps://www.scireq.com/downloads/Versión 8.4.1
GentamicinaWisent450-134-XL
Ácido acético glacialSigma-Aldrich100063 
de exposiciónGlutamaxThermoFisher Scientific
inExpose expoCube   SCIREQIX-XCP 
Infinite 200 PROTECAN30125944
metanol de grado LC/MSSigma-Aldrich106035
Solución salina tamponada con fosfatoThermoFisher Scientific10010-023
T175 EasYFlask, TC Surface, Tapa de filtroThermoFisher Scientific159910
T75 EasYFlask, TC Surface, Tapa de filtroThermoFisher Scientific
Bromuro de tetrazolio azul de tiazoliloSigma-AldrichM 2128MTT
Triton X-100Sigma-Aldrich108603
Baño limpiador ultrasónicoVWR18303Baño de sonicador
Organizador semanal de píldorasHealthSmart640-8223-0000
MBI601051CPaquete in vitro 35050061 156499

Referencias

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