Análisis exhaustivo de plaquetas procoagulantes que presentan características de necrosis, apoptosis y activación plaquetaria

Resumen

El presente protocolo proporciona un conjunto completo de procedimientos necesarios para analizar las plaquetas procoagulantes, que exhiben características superpuestas de necrosis, apoptosis y activación plaquetaria.

Resumen

Las plaquetas que circulan en el torrente sanguíneo están relativamente quietas, pero se "activan" al encontrarse con estimulantes o "agonistas" en el sitio de la lesión de los vasos sanguíneos. Las plaquetas proagregatorias y procoagulantes representan dos poblaciones distintas de plaquetas activadas. Mientras que las plaquetas proagregatorias facilitan el cese de la hemorragia, o "hemostasia", al formar un tapón de plaquetas agrupadas a través de puentes de fibrinógeno, las plaquetas procoagulantes aceleran drásticamente la cascada de coagulación, culminando en la formación de coágulos de fibrina. Un aspecto interesante de las plaquetas procoagulantes es que su morfología exhibe ciertas características de "necrosis" y "apoptosis". Por lo tanto, pueden representar una forma de muerte celular en las plaquetas, aunque con un papel importante en la trombosis y la hemostasia. En este artículo se presenta el concepto de plaquetas procoagulantes, su relevancia para la salud y la enfermedad, y se comparan los métodos existentes para su análisis. A continuación, proporciona protocolos completos para analizar las plaquetas procoagulantes, investigar los mecanismos de su formación y evaluar su papel protrombótico en la facilitación de la coagulación. El artículo concluye con una descripción de los pasos clave, las limitaciones y los principios de solución de problemas para los métodos descritos.

Introducción

Existen al menos dos poblaciones distintas de plaquetas activadas ^1,2. Las plaquetas proagregatorias se caracterizan por una alta activación de integrinas y una baja o nula exposición a PS. Por otro lado, las plaquetas procoagulantes se caracterizan por una baja actividad de integrinas y una alta exposición a PS ^1,2, proporcionando una superficie para el ensamblaje de los complejos tenasa y protrombinasa³, que es 10,^5-10,⁶ veces y 300000 veces más activa que los factores IX....

Protocolo

Los participantes humanos fueron reclutados en el estudio para la toma de muestras de sangre venosa periférica después de obtener el consentimiento informado por escrito, siguiendo estrictamente las recomendaciones y la aprobación de la Junta de Revisión Institucional del Instituto de Investigación Lerner de la Clínica Cleveland, con todas las metodologías de estudio conformes a los estándares establecidos por la Declaración de Helsinki. Se incluyeron participantes adultos sanos mayores de 18 años, mientras que se excluyeron los menores de 18 años, las personas con antecedentes recientes de eventos trombóticos en los últimos seis mese....

Resultados

Una proporción de plaquetas activadas se vuelven "procoagulantes" con un aumento característico en la expresión superficial tanto de fosfatidilserina (PS) como de P-selectina, lo que las distingue de las plaquetas "apoptóticas" que son positivas solo para la exposición a PS, así como de las plaquetas "proagregadoras" que son positivas para la expresión de P-selectina. Encontramos que la trombina induce un aumento dependiente de la dosis en la proporción de plaquetas procoagulantes positivas tanto para la expresión de P-s.......

Discusión

Las plaquetas procoagulantes muestran aumentos marcados y sostenidos de calcio intracelular tras la estimulación²⁶, pero pueden derivarse a través de diferentes mecanismos. Se generan tras una fuerte estimulación de agonistas con colágeno y trombina a través de distintos mediadores, incluido el más prominente influjo de calcio mitocondrial ^18,19 a lo largo del gradiente electroquímico a través de la membra.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Solución de citrato ácido dextrosa (ACD) (para 1000 mL)			Citrato de tri-sodio-                     22 g Ácido cítrico-                                                    8 g Dextrosa-                                                          24,5 g Agua-                                                                    Volumen de maquillaje hasta 1000 mL
Alexa Fluor 488 kit de etiquetado de proteínas	Invitrogen	A10235
APC Ratón Anti-Humano CD62P	BD Pharmingen	550888
Protrombina Bovina	Prolytix	BCP-1010
Tampón A (Preparación de plaquetas)			M.W                Conc. en 1X          Para 100 mL de solución 10X HEPES              238.30 y 230               20 mM                                      4.766 g NaCl                          58.44 y nbsp;           134 mM                                    7.83 g KCl                              74.55              2.9 mM                            216.19 mg MgCl2                  203.30                    1 mM                          203.30 mg NaH2PO4      156.01              0.34 mM                              53.04 mg NaHCO3              84 01                    12 mM                     1,01 g Agua a 100 mL después de ajustar el pH a 6,2 Diluya la solución 10X 1:10 (v/v) con agua Milli Q justo antes de la preparación de las plaquetas para obtener la solución 1X que debe complementarse con lo siguiente                                 Conc. en 1X          Para 1 ml de solución 1X EGTA                   1 mM           Suma 10 μ L (1:100 v/v) 100 mM EGTA  Glucosa               5 mM         Suma 5 μ L (1:200 v/v) 1 M glucosa PGE1                     3 y mu; M         Suma 3 μ L (1:333 v/v) 1 mM solución PGE1
Tampón B (Preparación de plaquetas)			M.W                Conc. en 1X          Para 100 mL de solución 10X HEPES              238.30 y 230               20 mM                                      4.766 g NaCl                          58.44 y nbsp;           134 mM                                    7.83 g KCl                              74.55              2.9 mM                            216.19 mg MgCl2                  203.30                    1 mM                          203.30 mg NaH2PO4      156.01              0.34 mM                              53.04 mg NaHCO3              84 01                    12 mM                     1,01 g Agua a 100 mL después de ajustar el pH a 7,4 Diluya la solución 10X 1:10 (v/v) con agua Milli Q justo antes de la preparación de las plaquetas para obtener la solución 1X que debe complementarse con lo siguiente                                 Conc. en 1X          Para 1 ml 1X solución Glucosa               5 mM         Suma 5 μ L (1:200 v/v) 1 M de glucosa
CaCl2 (0,5 M) (Para 50 ml)			Peso molecular de CaCl2.2H2O = 147,02 Disolver 3,675 g de CaCl2,2H2O en 50 ml de agua Milli Q
Reactivos de detección CellEvent Caspasa-3/7 Green	Invitrogen	C10423	Reactivo de detección de apoptosis
Convulxin	Enzo Life Sciences	ALX-350-100
EDTA (0,5 M; pH 8) (Para 100 mL)			Peso molecular de EDTA Na2.2H2 O: 372.24g Pesar 18.612 g y suspender en 50 ml de agua Milli Q y verificar el pH (pH~4) Agregue lentamente 10N NaOH agitando y controle el pH. EDTA comienza a solubilizar alrededor de pH 7 y es completamente soluble a pH 8. Aumente el volumen hasta 100 ml con agua Milli Q.
EGTA (100 mM; pH 7.4) (Para 100 mL)			Peso molecular: 380.4 Agregue 3.804 g de EGTA en 50 ml de agua Milli Q y verifique el pH (pH~3) Agregue 10 N de NaOH gota a gota mientras agita y controle el pH EGTA se vuelve soluble a pH 7.0 (aprox) Ajuste el pH a 7.4 Aumente el volumen a 100 ml con agua
Milli QFITC Ratón Anti-Humano PAC-1	BD 340507
FITC-IETD-FMK Caspasa 8 (activo) kit de tinción	Abcam	ab65614
Mitotracker Red CMXRos (colorante de marcado de mitochindrias)	Invitrogen	M7512	Stock= 1 mM (50 µ g disuelto en 90 µ l DMSO) Subexistencias= 100 µ M (10 y micro; l Stock + 90 y micro; l DMSO) Concentración de trabajo = 500nM (0.5 µ l en 100 y micro; l)
PE Anexina V	BD Pharmingen	560930
Prostaglandina E1	Sigma	P5515	Stock= 20 mM (1 mg disuelto en 141 µ L DMSO) Substock= 1 mM (10 µ l Stock + 190 y micro; L DMSO) Concentración de trabajo= 3 µ M (3 y micro; L en 1 mL)
Rhod-2 AM	Invitrogen	R1244	Stock= 5 mM (1 mg disuelto en 178 µ L DMSO) Subexistencias= 100 µ M (10 y micro; L Stock + 90 µ L DMSO) Concentración de trabajo= 500 nM (0,5 µ L en 100 y micro; L)
Trombina de plasma humano	Sigma	T7572