Artículo de método

Medición de la fuerza en tiempo real entre las gotas de emulsión durante la descomposición enzimática

DOI:

10.3791/68182

27 de junio de 2025

En este artículo

Resumen

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Este protocolo emplea pinzas ópticas de doble trampa para medir las fuerzas entre gotas en tiempo real durante la digestión enzimática de emulsiones. Facilita el estudio de la estabilidad de la emulsión y la dinámica de las gotas, con aplicaciones en la ciencia de los alimentos y la farmacéutica.

Resumen

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$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo introduce una metodología única para investigar la estabilidad de las emulsiones y la desintegración dinámica de las gotas de emulsión durante la digestión enzimática utilizando pinzas ópticas de doble trampa. El proceso implica la preparación de la emulsión, la introducción de la enzima y la configuración de un sistema de medición de fuerza para monitorear las fuerzas entre gotas en tiempo real. Mediante el empleo de pinzas ópticas de doble trampa, el método permite la manipulación y observación precisas de las gotas de emulsión, lo que facilita la medición de las fuerzas entre las gotas durante la desintegración enzimática. Esta técnica experimental ofrece información significativa sobre las interacciones y la estabilidad de las emulsiones durante la digestión, con particular relevancia para la investigación en ciencia de los alimentos, productos farmacéuticos y otras industrias que involucran emulsiones orgánicas. El método es adaptable y aplicable a varias configuraciones de pinzas ópticas y diferentes tipos de emulsiones o enzimas, sirviendo como una herramienta versátil para explorar las propiedades mecánicas y los procesos de desintegración en una variedad de campos. Además, este enfoque visual proporciona la ventaja de la monitorización en tiempo real de la dinámica de fuerzas, lo que abre nuevas vías para estudiar el comportamiento de la emulsión en diversas aplicaciones.

Introducción

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Las emulsiones son sistemas heterogéneos formados por dos líquidos inmiscibles, donde un líquido se dispersa en forma de gotas dentro del otro. Estos sistemas son omnipresentes en diversas industrias, como la alimentaria, la farmacéutica, la cosmética y la petroquímica. La estabilidad y la funcionalidad de las emulsiones dependen fundamentalmente de las interacciones entre las gotas, que pueden verse influidas por diversos factores, como la química de la superficie, las condiciones ambientales y la presencia de enzimas.

En muchas aplicaciones, particularmente en la ciencia de los alimentos y la administración de medicamentos, las emulsiones están expuestas a ambientes enzimáticos 3,4. Por ejemplo, en el sistema digestivo humano, los alimentos y medicamentos a base de emulsiones ingeridos se encuentran con varias enzimas que pueden alterar su estructura y función. Comprender la dinámica de las interacciones de las gotas durante la digestión enzimática es crucial para diseñar productos estables y eficaces a base de emulsiones 5,6.

Los métodos tradicionales para estudiar la estabilidad de la emulsión 2,7, como la dispersión de la luz o las mediciones reológicas, proporcionan información valiosa a granel, pero no pueden observar y cuantificar directamente las interacciones entre las gotas individuales8. Esta limitación ha dificultado la comprensión de los procesos a microescala que ocurren durante la digestión enzimática de las emulsiones.

Las pinzas ópticas se han convertido en una poderosa herramienta para manipular objetos microscópicos y medir fuerzas a micro y nanoescala9. Al aprovechar el impulso de la luz, las pinzas ópticas pueden atrapar y mover gotas individuales con una precisión excepcional. Esta capacidad abre nuevas posibilidades para el estudio de las interacciones gota-gota en entornos complejos10,11.

Este protocolo presenta un método único que combina pinzas ópticas duales con mediciones de fuerza en tiempo real para investigar las interacciones entre las gotas de emulsión durante la digestión enzimática. Como ejemplo representativo, el método se demuestra utilizando un sistema de emulsión compuesto por aceite de colza o una gota de grasa estabilizada por proteína de suero, sometida a digestión por tripsina. Este sistema modelo es particularmente relevante para la ciencia de los alimentos y la nutrición, ya que imita las emulsiones alimentarias comunes y su comportamiento en el tracto digestivo12.

El enfoque permite la observación directa y la cuantificación de las fuerzas entre las gotas individuales a medida que se descomponen enzimáticamente, proporcionando información sin precedentes sobre la dinámica de la estabilidad de la emulsión en condiciones digestivas. El método utiliza el sistema de pinzas ópticas, una configuración de pinzas ópticas de doble trampa de última generación, para manipular gotas de emulsión y medir las fuerzas entre gotas con alta precisión13.

Esta técnica experimental cierra la brecha entre los estudios de emulsiones a granel y las investigaciones a nivel molecular, ofreciendo una perspectiva única sobre el comportamiento de las emulsiones durante la digestión enzimática. Los conocimientos obtenidos de este método tienen implicaciones de gran alcance para varios campos, incluida la ingeniería de alimentos, las formulaciones farmacéuticas y la ciencia fundamental de los coloides. Si bien se utiliza como ejemplo un sistema específico de aceite-proteína-enzima, la metodología presentada aquí se puede adaptar para estudiar una amplia gama de sistemas de emulsión orgánica y enzimas digestivas en diversas industrias.

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Protocolo

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La Figura 1 ilustra un esquema de la captura de gotas de pinzas ópticas de doble trampa. Los reactivos y el equipo utilizado en este estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Preparación de la dispersión de proteína de suero

  1. Prepare una dispersión de proteína de suero al 5% (p/v) en agua desionizada.
    1. Con una balanza electrónica, pese con precisión 2,5 g de proteína de suero en polvo.
    2. Con un cilindro graduado, mida 47,5 mL de agua desionizada.
  2. Combina los ingredientes.
    1. Transfiera la proteína en polvo pesada y el agua medida a un vaso de precipitados.
    2. Agregue una barra magnética para agitar el vaso de precipitados.
  3. Sella el vaso de precipitados.
    1. Cubra el vaso de precipitados con una película de sellado para evitar la evaporación y la contaminación.
  4. Mezclar la dispersión.
    1. Coloque el vaso de precipitados en un agitador magnético. Ajuste la velocidad de agitación a 1500 rpm (Figura 2A) hasta que la proteína en polvo se disuelva por completo y la solución se disperse uniformemente.
  5. Hidrata la proteína
    1. Para asegurar la hidratación completa de la proteína de suero y minimizar la formación de espuma, prepare la dispersión un día antes de la preparación de la emulsión.
    2. Deje que la dispersión de proteína de suero al 5% se mezcle durante la noche a temperatura ambiente.
      PRECAUCIÓN: Asegúrese de que toda la cristalería y los utensilios estén limpios y libres de contaminantes para evitar afectar la dispersión de proteínas.
      NOTA: El paso de hidratación durante la noche es crucial para una funcionalidad óptima de la proteína y la estabilidad de la emulsión. Omitir este paso puede resultar en una reducción de la eficiencia de emulsificación. Esta sección del protocolo describe los pasos iniciales para preparar la dispersión de proteína de suero, que se utilizará para estabilizar las gotas de aceite de colza en la preparación posterior de la emulsión. Los siguientes pasos suelen incluir la preparación de la emulsión de aceite en agua, la configuración del experimento de pinzas ópticas y la introducción de tripsina para estudios de digestión.

2. Preparación de emulsiones de aceite en agua

  1. Optimizar la formulación.
    1. Prepare la emulsión mezclando un 15% de aceite con un 85% de solución de proteína por volumen para lograr una proporción de masa proteica a lípida de 0,3.
  2. Prepara la fase lipídica.
    1. El aceite de colza es líquido a temperatura ambiente. Agregue 30 ml de aceite de colza en un tubo de centrífuga para su uso posterior.
    2. La grasa de la leche es sólida a temperatura ambiente. Tome aproximadamente cinco cucharadas de grasa láctea y colóquelas en un tubo de centrífuga.
    3. Coloque el tubo en un vaso de precipitados y agregue aproximadamente 40 ml de agua desionizada al vaso de precipitados.
    4. Utilice una placa calefactora digital para calentar el vaso de precipitados a 42 °C y mantenga esta temperatura durante 30 minutos para garantizar una fusión completa (Figura 2B).
      NOTA: El punto de fusión de la grasa láctea es de aproximadamente 30 °C a 40 °C. La temperatura del laboratorio se mantiene a 26 °C. La grasa de la leche derretida puede permanecer líquida durante un cierto período, pero se solidificará gradualmente a temperatura ambiente si se deja reposar.
  3. Combina los ingredientes.
    1. En un tubo de centrífuga de 5 ml, agregue 0,6 ml de aceite (aceite de colza o grasa de leche derretida) y 3,4 ml de la solución de proteína de suero preparada.
  4. Homogeneizar la emulsión.
    1. Utilice un mezclador de alto cizallamiento (HSM). Ajuste la velocidad a 25,000 rpm y mezcle durante 5 minutos (Figura 2C).
    2. Opcionalmente, pase la emulsión gruesa a través de un homogeneizador de alta presión. Condiciones típicas: 2-3 pasadas a 500-1000 bar de presión.
  5. Diluye la emulsión.
    1. Prepare una dilución 1:1000 de la emulsión. Mida 4 μL de la emulsión original con una pipeta. Agregue esto a 3996 μL de agua desionizada. Mezcle bien para asegurar una dilución uniforme.

3. Configuración inicial de las pinzas ópticas

  1. Prepare y limpie las celdas de flujo microfluídicas (consulte la tabla de materiales).
    NOTA: El dispositivo está equipado con seis canales microfluídicos. Este experimento utiliza un solo canal, solo se utiliza el canal situado más a la izquierda de la Figura 3B .
    1. Para preparar el canal microfluídico, limpie todo el equipo necesario y los canales de flujo. Enjuague bien todo el equipo con agua desionizada para asegurarse de que no queden residuos.
    2. Para limpiar, enjuague el canal requerido con etanol. Ajuste el caudal a 1,0 bar y enjuague con etanol. 1 h antes del experimento, enjuague la albúmina sérica bovina (BSA) en la celda de flujo. BSA forma una capa de "bloqueo" en las superficies para reducir la adsorción inespecífica de gotas de emulsión u otras biomoléculas.
  2. Fluya la emulsión preparada en el canal experimental.
  3. Prepara el instrumento antes del experimento.
    1. Abra el instrumento de pinzas ópticas.
    2. Agregue aproximadamente 70 μL de agua desionizada a la lente del objetivo inferior.
    3. Inserte la cámara de muestras hasta que se escuche un "clic".
    4. Coloque una gota de aceite de inmersión en la parte superior de la cámara de muestras (Figura 3C).
    5. Baje suavemente la lente del condensador hasta que toque ligeramente la superficie superior de la cámara de muestras.
    6. Cierre el instrumento de pinzas ópticas antes de encender el láser. El láser funciona a 1064 nm.
  4. Localice el plano Z y ajuste la trayectoria óptica.
    1. Encienda el láser y configure la potencia al 100%.
    2. Ajuste la perilla inferior (Figura 3A) en el sistema de pinzas ópticas para ubicar el punto láser. Moviéndose de abajo hacia arriba (ajuste en el sentido de las agujas del reloj), observe los puntos láser tres veces. Establezca el plano Z entre el segundo y el tercer conjunto de puntos láser.
      NOTA: Los tres conjuntos de puntos láser aparecen cuando el láser se enfoca en la superficie inferior de la celda de flujo, la superficie superior del cubreobjetos inferior y la superficie inferior del portaobjetos de vidrio superior. El láser debe enfocarse entre la superficie superior del cubreobjetos y la superficie inferior del portaobjetos de vidrio.
    3. Reduzca la potencia del láser al 30%.
    4. Verifique que aparezcan de 7 a 11 franjas de interferencia en la pantalla (Figura 3E). Si el número es demasiado alto o demasiado bajo, ajuste la perilla inferior.
      NOTA: El número de franjas de interferencia refleja la optimización del espacio entre el condensador y la celda de flujo. Dentro del rango de 7 a 11 franjas, el condensador captura eficazmente suficiente luz para garantizar una buena relación señal-ruido para las señales medidas, como la respuesta mecánica. Este espaciado también mantiene una distancia segura para evitar el contacto de la lente con la celda de flujo y reducir la dispersión de la trayectoria óptica o la interferencia de reflexión.
  5. Ajuste los canales de flujo. Cierre los canales innecesarios y asegúrese de que solo esté abierto el canal experimental requerido.
  6. Ajuste la potencia del láser. Por lo general, configure el láser al 100% para capturar gotas, pero ajústelo a la intensidad requerida para condiciones experimentales específicas.
  7. Configurar el almacenamiento de datos. Configure el directorio de guardado de archivos para garantizar la adquisición inmediata de datos experimentales.

4. Medición de la curva fuerza-distancia de la emulsión

  1. Ajuste el caudal a 0,5 bar. Las gotas deben ser visibles en la pantalla durante aproximadamente 5 segundos. Luego, detenga el flujo seleccionando Vacío y cierre la válvula de canal.
  2. Captura las gotas.
    1. Utilice el joystick para capturar dos gotas de tamaño similar dentro del canal. En la Figura 4 se muestra un esquema de las gotas capturadas con éxito.
    2. Ajuste la distancia entre las dos gotas a aproximadamente 10 μm. Si se forma una correa, se observará un cambio notable en la fuerza.
    3. Fije las posiciones x e y de la trampa óptica derecha y la posición y de la trampa óptica izquierda. Marque las dos gotas con cuadros magenta y verde, respectivamente.
  3. Mida la densidad espectral de potencia (PSD).
    1. Vaya al menú Calibración .
    2. En la pantalla de la izquierda, seleccione Medir. Si los niveles de ruido son excesivos, repita la medición hasta obtener resultados satisfactorios.
    3. Seleccione Aplicar para confirmar la calibración.
  4. Borre los datos originales y mida la fuerza-distancia.
    1. En esta etapa, el joystick debe controlar solo la trampa óptica izquierda. Mueva lentamente la trampa izquierda hacia la gota derecha a una velocidad constante (1,0 μm/s) hasta que la distancia llegue a cero. Este procedimiento produce la curva fuerza-distancia requerida.
  5. Seleccione los datos y guárdelos.
    1. Utilice el botón izquierdo del ratón para seleccionar el intervalo de datos de interés, a partir de una separación de gotas de 10 μm hasta 0 μm. A una distancia de 0 μm, la fuerza medida suele alcanzar su valor máximo.
  6. Guarde los datos seleccionados.
    1. Haga clic con el botón derecho para guardar el segmento de datos seleccionado en el directorio de carpetas inicial.

5. Preparación de la solución tampón Tris y la solución de tripsina

  1. Preparar la solución tampón Tris con la siguiente composición: 11,860 g/L de Tris base, 0,735 g/L de cloruro cálcico dihidratado (CaCl2·2H2O) y 8,766 g/L de cloruro sódico (NaCl). Ajuste el volumen final a 100 mL. Ajuste el pH inicialmente a aproximadamente 8.4 usando ácido clorhídrico (HCl) y confirme el pH final usando tiras reactivas de pH.
  2. Prepare la solución de tripsina disolviendo 100 mg de tripsina 1:250 (derivada del páncreas porcino) en 1000 ml de tampón Tris. Agitar la mezcla con un agitador magnético a 4 °C y 500 rpm durante 15 min. A continuación, centrifugar la solución a 4 °C durante 15 min.

6. Acción de la tripsina y esquema dinámico de detección

  1. Agregue la solución de tripsina a la emulsión.
    1. Con una pipeta con un intervalo de 0,5 μL a 10 μL, extraiga 4 μL de la solución de tripsina y añádala con cuidado a la emulsión de 4 mL preparada.
  2. Realice monitoreo dinámico en tiempo real.
    1. Tras la adición de la solución de tripsina, controle dinámicamente las emulsiones utilizando la tecnología de pinzas ópticas. Las mediciones se realizan cada 10 minutos, y la primera medición se realiza 10 minutos después de la adición de la solución de tripsina.

7. Tratamiento de datos

  1. Obtenga los datos experimentales en formato .h5 y realice la conversión de formato requerida utilizando un entorno de procesamiento de datos para producir archivos de datos tabulares. Los archivos convertidos constan de dos secciones, que registran los datos de Fuerza y Distancia, respectivamente.
  2. Ajuste los datos de estas dos secciones utilizando técnicas de ajuste de curvas y trace visualmente las curvas ajustadas resultantes para su posterior análisis.

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Resultados

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En este estudio, se analizaron emulsiones que contenían aceite de colza y proteína de suero, y grasa láctea y proteína de suero, utilizando pinzas ópticas. En primer lugar, se midió la relación fuerza-distancia entre las dos emulsiones para establecer los datos de referencia (Figura 5A-F). A continuación, se añadió tripsina a cada emulsión y la relación fuerza-distancia se volvió a medir cada 10 minutos.

La Fi...

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Discusión

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La innovación central de esta metodología radica en el funcionamiento sincronizado de trampas ópticas duales y la tecnología de monitoreo mecánico en tiempo real (Figura 3A), lo que permite un análisis dinámico de alta precisión a nivel de una sola gota. Al atrapar de forma independiente dos gotas con pinzas ópticas dobles y regular con precisión su separación a una distancia inicial de 10 μm (véase el paso 4.2.2), el método supera las limitaciones tradicion...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Esta investigación fue financiada por el PROYECTO NACIONAL CLAVE DE INVESTIGACIÓN Y DESARROLLO DE CHINA, Subvención No. 2023YFF0613603, y la FUNDACIÓN NACIONAL DE CIENCIAS NATURALES DE CHINA, Subvención No. 22202167.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Software BluelakeLUMICKS, software decontrol de pinzas ópticas
CaCl2.H4O2
Dome Agitador digital de placa calefactora LEDSCILOGEXSCI280-Pro 
Balanza electrónicaShanghai Hengping Instrument Co., LTDFA1204
HCl
Homogeneizador de alta velocidadNingbo Kemai Instrument Co., LTDKM-S10
inmersión
Aparato de mezcla de vórtice inducido por luzShanghai HUXI Industrial Co., LTDVortex-5S
Microsoft Office ExcelMicrosoft
Milk fatSM MlekovitaMaslo Klarowane
NaCl
Plataforma de pinzas ópticasLUMICKS, Países Bajosm-trap
Software de origenOrigin Lab2024Para dibujar una curva de ajuste de fuerza y distancia Pistola
de pipetasEppendorf10 μ L,100 μ L,1000 μ L
Aceite de colza Bunge Polska Sp.z o.o. Kujawski
Parafilm4IN*125FT
Tris
TripsinaSangon BiotechA100458-0010Tripsina 1:250, de páncreas porcino
Concentrado de proteína de suero de leche SM MlekovitaWPC
de los Países BajosAceite dePelícula de sellado

Referencias

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