Artículo de método

Identificación de especies de micobacterias mediante el método de chip de microarrays de ADN

DOI:

10.3791/68234

⸱

24 de junio de 2025

 ,  ,  ,  , 
1Quanzhou First Hospital Affiliated to Fujian Medical University

En este artículo

Resumen

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Aquí, presentamos un método de chip de microarray de ADN para identificar especies de Mycobacterium , que mejorará la precisión diagnóstica y la eficiencia de enfermedades relacionadas para uso clínico.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este estudio presenta un método de chip de microarrays de ADN diseñado para la identificación precisa de especies de Mycobacterium . Al aprovechar los principios de amplificación e hibridación de PCR asimétrica, este método se dirige a 17 micobacterias comunes, incluidas las del complejo Mycobacterium tuberculosis y varias micobacterias no tuberculosas. Es aplicable a una amplia gama de muestras clínicas como esputo, pus, líquido de lavado broncoalveolar, líquido cefalorraquídeo y líquido de punción de pacientes con sospecha de enfermedades micobacterianas. El ensayo consiste en amplificar secuencias diana en el genoma de Mycobacterium a través de una PCR asimétrica, seguida de la hibridación con las sondas en el chip del microarray. La disposición única de las sondas (repetidas 5 veces en un microarray de 12 filas x 10 columnas) y el uso de sondas de control mejoran su fiabilidad. Los ensayos clínicos con 1.724 muestras demostraron un alto rendimiento. El método logró un 100% de especificidad clínica, sensibilidad y concordancia general en comparación con los resultados de secuenciación, a excepción de dos muestras raras de micobacterias no tuberculosas más allá de su alcance de detección. Este método de chip de microarray de ADN ofrece una mejora significativa respecto a las técnicas diagnósticas tradicionales, acortando el tiempo de diagnóstico y proporcionando una detección más completa, por lo que tiene un gran potencial en el diagnóstico y manejo de enfermedades micobacterianas.

Introducción

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Mycobacterium, un género de bacterias, abarca un grupo diverso de organismos con implicaciones significativas para la salud humana y animal. Mycobacterium tuberculosis, el agente causante de la tuberculosis (TB), ha sido un flagelo de larga data para la salud mundial. A pesar de décadas de esfuerzos en prevención y tratamiento, la tuberculosis sigue siendo una importante amenaza para la salud pública, responsable de un número asombroso de muertes anuales y nuevas infecciones en todo el mundo 1,2. Las micobacterias no tuberculosas (MNT) también se reconocen cada vez más como patógenos importantes, especialmente en poblaciones de pacientes y entornos ambientales específicos.

La identificación precisa de las especies de Mycobacterium es la piedra angular del tratamiento eficaz de la enfermedad 3,4. Los métodos de diagnóstico tradicionales tienen limitaciones inherentes. Las técnicas basadas en la cultura, en las que históricamente se ha confiado, son notoriamente lentas. El proceso de aislamiento y cultivo de micobacterias puede llevar semanas o meses, durante los cuales los pacientes pueden experimentar la progresión de la enfermedad y la posible transmisión a otras personas. Además, algunas especies de micobacterias son extremadamente difíciles de cultivar, lo que conduce a resultados falsos negativos y a un tratamiento tardío o incorrecto 5,6.

La tinción acidorresistente, otro método comúnmente utilizado, puede identificar micobacterias en función de sus propiedades únicas de la pared celular que resisten la decoloración. Sin embargo, carece de la especificidad necesaria para distinguir entre las diferentes especies de Mycobacterium , proporcionando sólo una indicación amplia de la presencia de micobacterias7. Los métodos moleculares como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) han surgido como alternativas para superar algunos de estos inconvenientes. La PCR puede detectar el ADN micobacteriano más rápidamente que los métodos de cultivo, lo que permite un diagnóstico más rápido. Sin embargo, los ensayos de PCR convencionales suelen dirigirse a un número limitado de genes y pueden no ofrecer una identificación completa de las especies, especialmente cuando se trata de especies de Mycobacterium estrechamente relacionadas5.

La tecnología de microarrays de ADN ha revolucionado los campos de la microbiología y el diagnóstico. Ofrece la capacidad de analizar simultáneamente múltiples objetivos genéticos, proporcionando una visión más completa y detallada de la población microbiana 8,9. Investigaciones recientes en esta área han iluminado aún más el potencial y la importancia de las técnicas moleculares avanzadas para la identificación de micobacterias. Por ejemplo, un estudio realizado por Wang et al.10 demostró la mayor sensibilidad y especificidad de un chip de microarray de ADN modificado en la detección de especies raras de Mycobacterium en un entorno clínico. Sus hallazgos enfatizaron el valor de la optimización continua de la tecnología de microarrays. Otro estudio realizado por Wang y colaboradores11se centró en la integración de los datos de microarrays de ADN con los resultados clínicos en pacientes con tuberculosis. Los resultados proporcionaron información sobre el valor pronóstico de la identificación precisa de especies de Mycobacterium y el potencial de la medicina personalizada.

Principio de prueba
Este kit emplea la tecnología de chip de microarrays de ADN, combinada con los principios de amplificación e hibridación de la reacción en cadena de la polimerasa asimétrica (PCR), para la identificación de especies de Mycobacterium . El kit incluye un chip de identificación de especies de Mycobacterium y reactivos de amplificación de PCR asimétrica. El chip se fija con sondas específicas de la especie para la detección e identificación de especies de Mycobacterium . Los objetivos de detección incluyen 17 especies o grupos clínicamente comunes, como el complejo Mycobacterium tuberculosis , Mycobacterium intracellulare, Mycobacterium avium, Mycobacterium gordonae, Mycobacterium kansasii, Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium scrofulaceum, Mycobacterium flavescens, Mycobacterium terrae, Mycobacterium chelonae y Mycobacterium abscessus, Mycobacterium phlei, Mycobacterium nonchromogenicum, Mycobacterium marinum y Mycobacterium ulcerans, Mycobacterium aurum, Mycobacterium szulgai y Mycobacterium malmoense, Mycobacterium xenopi y Mycobacterium smegmatis.

La detección de estas 17 especies de Mycobacterium es fundamental para un diagnóstico clínico preciso y un tratamiento personalizado del paciente. El complejo Mycobacterium tuberculosis (MTBC) se prioriza debido a su papel en la tuberculosis, lo que requiere aislamiento inmediato y tratamiento multifarmacológico para frenar la transmisión y abordar la resistencia a los medicamentos. Las especies dentro del complejo Mycobacterium avium-intracellulare (MAC), como M. avium y M. intracellulare, afectan predominantemente a individuos inmunocomprometidos (por ejemplo, VIH/SIDA) o aquellos con enfermedad pulmonar crónica, que requieren regímenes prolongados a base de macrólidos. Las micobacterias de crecimiento rápido (RGM, por sus siglas en inglés) como M. abscessus y M. fortuitum son conocidas por su resistencia a los antibióticos y, a menudo, causan infecciones graves de la piel, los tejidos blandos o los pulmones, lo que exige combinaciones agresivas de cirugía y antibióticos específicos (por ejemplo, amikacina, macrólidos). Especies ambientales como M. gordonae o M. smegmatis son contaminantes frecuentes, pero pueden causar infecciones oportunistas en contextos específicos, lo que requiere una cuidadosa correlación clínica para evitar tratamientos innecesarios. Patógenos como M. marinum (asociado con la exposición acuática) y M. ulcerans (causante de la úlcera de Buruli) tienen nichos epidemiológicos distintos, lo que guía las evaluaciones de los antecedentes de exposición. Las especies raras pero clínicamente relevantes (por ejemplo, M. szulgai, M. malmoense) imitan a la tuberculosis y requieren regímenes específicos para cada especie. La identificación precisa es primordial, ya que la duración del tratamiento, la selección del fármaco (p. ej., sensibilidad a la rifampicina en M. kansasii frente a resistencia intrínseca en MNT) y el pronóstico varían drásticamente. El diagnóstico molecular y las pruebas de susceptibilidad a los antimicrobianos son esenciales para optimizar los resultados, especialmente en poblaciones inmunodeprimidas o infecciones complejas.

En primer lugar, las secuencias diana del genoma de Mycobacterium se amplifican mediante PCR asimétrica. A continuación, los productos amplificados se hibridan con las sondas del chip. Si el Mycobacterium objetivo está presente en la muestra, los productos amplificados se unirán específicamente a las sondas correspondientes en el chip. Finalmente, mediante el escaneo de las señales de hibridación en el chip, se puede determinar la especie de Mycobacterium en la muestra.

Utilizando la tecnología de micro-arraying de chips genéticos, se fijan en el sustrato sondas específicas para detectar los genes antes mencionados y varias sondas de control. Cada sonda de detección y sonda de control se repite 5 veces, formando un microconjunto de 12 filas x 10 columnas. La disposición de la sonda se muestra en la Figura 1. Cada chip contiene cuatro microarrays idénticos, y cada microarray puede detectar una muestra.

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Protocolo

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Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Primer Hospital Afiliado a la Universidad Médica de Fujian (Aprobación No. 2024-K035). Se obtuvo el consentimiento informado de todos los pacientes antes de la recolección de las muestras clínicas. Se informó a los pacientes sobre el propósito del estudio, los procedimientos involucrados y su derecho a retirarse en cualquier momento sin afectar su atención médica.

1. Requisitos de la muestra

NOTA: Al recolectar muestras de pacientes con sospecha clínica de tuberculosis y enfermedades de micobacterias no tuberculosas (MNT) para analizarlas con este kit, siga estos pasos:

  1. Recolectar muestras como esputo, pus o secreciones, líquido de lavado broncoalveolar, líquido de punción (incluyendo líquido cefalorraquídeo, líquido pleural y peritoneal, líquido pericárdico, líquido articular y bilis) y orina de los pacientes.
    1. Para muestras de esputo:
      1. Indique al paciente que se enjuague la boca con agua limpia por la mañana y luego tosa el esputo profundo en un recipiente estéril de almacenamiento de muestras, lo selle y lo envíe para su análisis.
      2. Agregue 1-2 veces el volumen de NaOH al 4%, agite y mezcle uniformemente.
      3. Después de 15-20 minutos, agregue un volumen igual de tampón de fosfato pH 6.8 y mezcle uniformemente.
      4. A temperatura ambiente, centrifugar a 2.000 × g durante 15 min y desechar el sobrenadante. Añadir 1 mL de NaCl al 0,9% a través de una pipeta y mezclar bien; Uso para la detección.
    2. Para muestras de pus o secreciones:
      1. Enjuague la superficie con solución salina normal estéril. Recoja el pus o la secreción con un hisopo estéril, séllelo y envíelo para su análisis.
      2. Agregue 3 veces el volumen de NaOH al 4% y agítelo bien para mezclar bien.
      3. Déjelo reposar a temperatura ambiente durante 20 minutos (agítelo manualmente 2 veces durante este período), centrifugue a 2.000 × g a temperatura ambiente durante 15 minutos y luego deseche el sobrenadante. Añadir 1 mL de NaCl al 0,9% a través de una pipeta y mezclar uniformemente; Uso para la detección.
    3. Para el líquido de lavado broncoalveolar:
      1. Inyecte de 10 a 20 ml de solución salina normal a través de un tubo de lavado broncoalveolar protegido (PBAL).
      2. Recoja la muestra en un frasco estéril por succión de presión negativa y envíela para su análisis.
    4. Para el líquido cefalorraquídeo:
      1. Recoja al menos 2 mL de muestra utilizando una técnica aséptica.
      2. Centrifugar a 2.000 × g durante 15 min a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante. Agregue 1 mL de solución de cloruro de sodio al 0,9% a través de una pipeta, mezcle bien y úselo para pruebas.
    5. Para muestras de orina:
      NOTA: Es aconsejable usar la primera cantidad completa de orina en la mañana o la orina de media y tarde en la noche. La orina también se puede recolectar por cateterismo.
      1. Recoja la muestra en un recipiente estéril y deje reposar la muestra de orina recolectada durante 4-5 h.
      2. Centrifugar a 2.000 × g durante 15 min a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante. Agregue 1 mL de solución de cloruro de sodio al 0,9% a través de una pipeta, mezcle bien y úselo para pruebas.
  2. Almacenamiento de muestras
    NOTA: Las muestras en medio sólido no deben almacenarse congeladas, ya que la congelación puede afectar las operaciones posteriores.
    1. Almacene las muestras existentes en el medio líquido a -70 °C durante no más de 5 años.
    2. Almacene todas las muestras a 2-8 °C durante no más de 2 meses.
  3. Transporte de muestras
    1. Al transportar las muestras aisladas de prueba, asegúrese de utilizar un recipiente cerrado que cumpla con los requisitos de bioseguridad en las condiciones permitidas por las regulaciones.

2. Preparación del experimento

  1. Preparación de soluciones de lavado de virutas
    NOTA: Prepare la Solución de Lavado de Virutas I y la Solución de Lavado de Virutas II de acuerdo con el número de virutas. El volumen debe ser tal que las virutas puedan sumergirse completamente durante el lavado. Mezclarlos uniformemente y equilibrarlos a temperatura ambiente (10-30 °C). La concentración final de SSC es 2x y la concentración final de SDS es de 0,2%.
    1. Para preparar la solución de lavado de virutas I, mezcle 20x SSC, agua destilada (o agua purificada) y 10% de SDS en la proporción de 10:88:2 en secuencia para preparar la solución de lavado de virutas I. Por ejemplo, al preparar un volumen total de 600 ml, mida primero 60 ml de 20x SSC y 528 mL de agua destilada (o agua purificada) y colóquelos en un vaso de precipitados de 1 L y mezcle uniformemente con una varilla de agitación. A continuación, añade 12 mL de SDS al 10% y vuelve a mezclar uniformemente.
    2. Para preparar la solución de lavado de virutas II: La concentración final de SSC es de 0,2x. Mezcle 20 veces SSC y agua destilada (o agua purificada) en una proporción de 1:99 para obtener la solución de lavado de virutas II. Tomando como ejemplo la preparación de un volumen total de 600 mL, mida 6 mL de 20x SSC y 594 mL de agua destilada (o agua purificada) y colóquelos en un vaso de precipitados de 1 L y mezcle uniformemente.
      NOTA: Si la solución de SDS al 10% desarrolla precipitados de floculante blancos, caliéntela a 50 °C, mezcle bien y luego prepare el tampón de lavado de microarrays. Si Washing Buffer I desarrolla precipitados de floculante blancos, caliéntelo a 50 ° C, mezcle bien, equilibre a temperatura ambiente antes de usar.
  2. Prepara 350 mL de mezcla de agua helada.
  3. Prepara agua destilada (o agua purificada).

3. Preparación de instrumentos y materiales

  1. Selección y configuración de instrumentos
    1. Identifique y prepare el escáner de chips de microarrays, asegurándose de que esté calibrado y listo para su uso.
    2. Configurar el instrumento de extracción de ácido nucleico, verificando sus funciones y cargando los reactivos necesarios.
    3. Coloque la caja de hibridación de chips de microarrays genéticos en el lugar apropiado y confirme su correcto estado de funcionamiento.
  2. Preparación de herramientas de pipeteo
    1. Reúna micropipetas con especificaciones de 0,1-10 μL, 2-20 μL y 20-200 μL, junto con sus correspondientes puntas de pipeta limpias y estériles. Asegúrese de que las micropipetas estén calibradas con precisión y que las puntas estén correctamente colocadas.
  3. Disposición de equipos auxiliares
    1. Prepare un baño de agua a temperatura constante y ajústelo a la temperatura requerida (50 °C).
    2. Coloque la microcentrífuga capaz de centrifugar tubos de centrífuga de 1,5 mL y verifique sus ajustes de equilibrio y velocidad.
    3. Organice los tubos de centrífuga limpios y estériles (200 μL y 1,5 mL) y las tiras opcionales de ocho pocillos limpios y estériles (200 μL) en las gradillas de tubos de centrífuga.
  4. Preparación del equipo de manipulación de muestras
    1. Coloque un agitador de temperatura constante en un lugar conveniente y configure los parámetros de agitación adecuados.
    2. Reserve dos recipientes para lavar las papas fritas y asegúrese de que estén limpios y secos.
    3. Coloque rejillas de portaobjetos y una centrífuga, y tenga a mano un recipiente para centrifugar y secar las virutas.
  5. Preparación del amplificador de PCR
    1. Encienda el amplificador de PCR y prográmelo de acuerdo con el protocolo experimental, asegurándose de que esté listo para realizar reacciones de amplificación.

4. Extracción de ácidos nucleicos

NOTA: Realice la operación en el área de preparación de muestras y siga estos pasos:

  1. Preparación
    1. Añadir 80 μL de solución de extracción de ácido nucleico en el tubo de extracción de ácido nucleico y añadir 1 mL de NaCl al 0,9%.
  2. Recogida de muestras aisladas
    1. Para iniciar la recolección de muestras, examine la fuente de las muestras, ya sea de medio sólido o líquido.
    2. Para recolectar muestras de medio sólido, use un asa de inoculación estéril para seleccionar una colonia visible del medio sólido apropiado. Si las bacterias han crecido hasta cubrir todo el medio, elija una cantidad correspondiente de césped bacteriano. Colóquelo con cuidado en el tubo de extracción de ácido nucleico que contiene la solución de extracción de ácido nucleico, teniendo cuidado de evitar recoger el medio sólido tanto como sea posible.
    3. Para muestras de medio líquido, aspire 10-20 μL de la suspensión bacteriana con una turbidez igual o superior a 1 estándar de McFarland. Inyéctelo en el tubo de extracción de ácido nucleico que contiene la solución de extracción de ácido nucleico.
      NOTA: Después de la recolección de la muestra, ya sea en medio sólido o líquido, las muestras están listas para la posterior operación de extracción de ácido nucleico.
  3. Extracción de ácidos nucleicos
    1. Después de agregar las muestras pretratadas o las muestras aisladas del Paso 1.1 mencionado anteriormente, use el instrumento de extracción rápida de ácidos nucleicos para extraer ácidos nucleicos. Colocar los ácidos nucleicos extraídos a -20 °C para su almacenamiento temporal.
      NOTA: Como indicador de la eficiencia de la extracción, el extractor automático puede extraer muestras con una carga de ácido nucleico viral superior a 100 copias/mL. El tiempo de almacenamiento temporal no debe exceder los 2 meses.

5. Amplificación por PCR

  1. Preparación del sistema de reacción PCR
    1. En el área de almacenamiento y preparación de reactivos, prepare tubos de centrífuga de 200 μL o tiras de ocho pocillos de acuerdo con la cantidad de muestras a analizar y marque los números de muestra con anticipación. Saque los reactivos de amplificación de PCR del kit, deje que se descongelen y se derritan de forma natural, agite suavemente y mezcle uniformemente, y luego centrifugue rápidamente para que los reactivos se acumulen en el fondo de los tubos.
    2. Según el número de muestras, alícuota los reactivos de amplificación de PCR en tubos de centrífuga de 200 μL o tiras de ocho pocillos a un volumen de 18 μL por tubo. Cierre herméticamente las tapas de los tubos y luego transfiéralas al área de preparación y amplificación de la mezcla de reacción de amplificación.
    3. Agregue 2 μL de ADN molde (el ADN de la muestra que se va a analizar (es decir, el sobrenadante en el tubo de extracción de ácido nucleico), productos de control positivos o productos de control negativos) en el área de preparación de la muestra. Asegúrese de que el volumen total de cada sistema de reacción PCR alcance los 20 μL.
      NOTA: Utilice productos de control positivo y productos de control negativo cada vez que dure la amplificación. El producto de control positivo se puede utilizar para el control de calidad en los procesos de amplificación e hibridación de PCR, y el producto de control negativo se puede utilizar para monitorear el entorno y el proceso de operación.
  2. Amplificación
    1. Coloque los tubos de centrífuga o las tiras de ocho pocillos que contienen los reactivos en el instrumento de amplificación de PCR. Asegúrese de que el instrumento esté precalentado a la temperatura requerida. Realice la reacción de amplificación de PCR de acuerdo con el siguiente programa de ciclo térmico: desnaturalización inicial a 94 °C durante 600 s (1 ciclo); 35 ciclos de desnaturalización a 94 °C durante 30 s, recocido a 60 °C durante 30 s y extensión a 72 °C durante 40 s; una extensión final a 72 °C durante 420 s (1 ciclo); mantener a 4 °C indefinidamente (1 ciclo).

6. Hibridación de chips

NOTA: Antes de que finalice la reacción de amplificación por PCR, realice las siguientes operaciones:

  1. Ajuste la temperatura del baño de agua a temperatura constante a 50 °C y precaliéntelo.
  2. Preparación de chips
    1. Agregue 200 μL de agua destilada (o agua purificada, como se muestra en la Figura 2A) al fondo de la caja de hibridación del chip de micromatriz de genes. Coloque el soporte entre las dos columnas de posicionamiento dentro de la caja.
    2. Coloque con cuidado el chip con la parte delantera hacia arriba en el soporte y cubra el chip con el cubreobjetos con sus cuatro protuberancias hacia abajo (como se muestra en la Figura 2B).
      NOTA: Asegúrese de que la dirección de colocación correcta del cubreobjetos esté alineado con la etiqueta en el extremo del chip.
  3. Preparación, desnaturalización y enfriamiento de la mezcla de reacción de hibridación
    1. Prepare tubos de centrífuga de 200 μL o tiras de ocho pocillos de acuerdo con el número de muestras y etiquételos correctamente.
    2. Saque el tampón de hibridación del kit y caliéntelo a 50 °C hasta que se derrita por completo. Después de mezclarlo bien, centrifugue rápidamente en una microcentrífuga. Alícuota 9 μL del tampón de hibridación en cada tubo de centrífuga preparado de 200 μL o tira de ocho pocillos. A continuación, se añadan 6 μL del producto PCR correspondiente a cada tubo, lo que da como resultado un volumen total de 15 μL por mezcla de reacción de hibridación.
    3. Calentar la mezcla de reacción de hibridación (incluyendo el tampón de hibridación y el producto de PCR) a 95 °C (en un instrumento de PCR o un baño de agua) y desnaturalizarla durante 5 min. Saque la mezcla de reacción de hibridación que se haya sometido al tratamiento de desnaturalización en el paso anterior y sumérjala inmediatamente en una mezcla de agua helada durante 3 min.
  4. Reacción de hibridación
    1. Saca la mezcla de la reacción de hibridación del baño de hielo, pipetala hacia arriba y hacia abajo 2 veces con una micropipeta para mezclarla uniformemente. Después de que el precipitado de floculante blanco (si lo hay) desaparezca, agregue 13.5 μL de la mezcla de reacción de hibridación a través del orificio de carga del cubreobjetos (como se muestra en la Figura 2C), cubra rápidamente la caja de hibridación y séllela (como se muestra en la Figura 2D). Registre el número de chip, la posición del microarray y el número de muestra correspondiente.
      NOTA: Solo se puede agregar una muestra a cada microarray.
    2. Coloque inmediatamente las cajas de hibridación selladas horizontalmente en el baño de agua a temperatura constante que se ha precalentado a 50 °C. Inicie el temporizador durante 120 minutos después de que se hayan colocado todas las cajas de hibridación.
      NOTA: Evite introducir burbujas de aire durante el proceso de carga. En todos los pasos desde el inicio de la carga hasta que se sequen las virutas, evite que el líquido de los microarrays de chips se exponga directamente al aire durante mucho tiempo para evitar que el fondo de la viruta sea demasiado alto debido al secado e interfiera con la interpretación del resultado.
  5. Lavado y secado de virutas
    1. Una vez completada la reacción de hibridación, saque las cajas de hibridación horizontalmente, desmóntelas y saque las virutas para lavarlas. Coloque inmediatamente las virutas en la rejilla deslizante en el contenedor (como un vaso de precipitados) lleno de solución de lavado de virutas I que se haya equilibrado a temperatura ambiente (10-30 °C). Lávelos a una velocidad de 80-100 rpm en un agitador de temperatura constante durante 3 minutos a temperatura ambiente.
    2. Lave las virutas con la solución de lavado de virutas II equilibrada a temperatura ambiente a una velocidad de 80-100 rpm en un agitador de temperatura constante durante 3 minutos a temperatura ambiente.
    3. Coloque las virutas en una centrífuga y centrifugue a 100 × g a temperatura ambiente durante 5 minutos. Escanéelos después de secarlos.
      NOTA: No permita que las fichas choquen o se froten entre sí.

7. Escaneo de chips e interpretación de resultados

NOTA: Utilice el escáner de chips de microarrays y el software correspondiente para leer señales e interpretar los resultados. Consulte también la Tabla 1 para obtener resultados anormales y solución de problemas. Siga estos pasos para operar (consulte los manuales de usuario del escáner y el software).

  1. Encienda el escáner y el software correspondiente, y luego haga clic en el botón Control láser para dejar que se precaliente durante 10 minutos.
  2. Introduzca varios tipos de información relacionada con las muestras, como el número de muestra.
  3. Una vez que el escáner haya terminado de precalentarse, haga clic en el botón Expulsar y coloque el chip firmemente en la pequeña pieza del soporte. Empuje suave y horizontalmente el chip en la abertura del compartimento del escáner y haga clic en el botón Cargar .
  4. Introduzca el número de chip, haga clic para seleccionar el área de detección (microarray 1-4) y, a continuación, haga clic en Seleccionar muestra para elegir las muestras correspondientes para cada microarray. A continuación, haga clic en el botón Iniciar detección para realizar el escaneo de chips. Los resultados del escaneo se mostrarán en la pantalla y se guardarán automáticamente.
  5. Después de escanear un chip, repita los pasos 7.3 y 7.4 para escanear el siguiente chip. Siga este procedimiento hasta que se hayan escaneado todas las fichas.
  6. Utilice la página Consulta de datos para realizar operaciones de consulta de datos e impresión.
  7. Después de completar todas las operaciones, primero apague el láser, luego salga del software y finalmente apague el escáner.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Resultados positivos
Para las sondas de los géneros Mycobacterium (control interno, IC) y Mycobacterium tuberculosis, sus valores de resultado positivo se determinan mediante el método de la característica operativa del receptor (ROC). En el caso de las sondas utilizadas para detectar los otros 16 NTM, sus valores de resultado positivos se determinan mediante el método de percentiles.

Control de calidad experimental
El resultado de la d...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El método de chip de microarray de ADN presentado en este artículo puede detectar directamente ácidos nucleicos en muestras clínicas (incluyendo esputo, pus, líquido de lavado broncoalveolar, líquido cefalorraquídeo y líquido de punción) de pacientes con sospecha de tuberculosis y micobacteriosis no tuberculosa y puede acortar significativamente el tiempo para el diagnóstico confirmado. El método de chip de microarrays de ADN presentado en este estudio representa un avance significativo ...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo contó con el apoyo del Proyecto de la Fundación Provincial de Ciencias Naturales de Fujian (2024J011521) y el Proyecto del Plan de Ciencia y Tecnología de Quanzhou (2024NY006).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Inyección de cloruro de sodio al 0,9% (NaCl)FuZhou HAIWANGFUYAOH35020289
Aparato de amplificación de biosistemas aplicadosThermo Fisher ScientificTermociclador Veriti de 96 pocillos
CapitalBio LuxScan10K/BBiografía de la capitalLuxScan10K/B
Arandela deslizante CapitalBio 24 Biografía de la capitalArandela deslizante 24 
  CentrífugaEppendorf5424RMaX.speed 15000 min-1
Tampón de hibridación
Chip y cubierta de microarrays de genes HybSet
Kit de identificación de especies de MycobacteriumBiografía de la capital301030
Controles negativos, controles positivos
Extractor de ácidos nucleicosTIANLONGGeneRotex 96
Reactivo de amplificación por PCR
Tampón de fosfato pH 6,8ShangHai yuanye Bio-TecnologíaReferencia R20029-10
Pipetas y puntasThermo Scientific0.1 - 10 μ L, 2 - 20 μ L, y 20 - 200 μ L, 100-1000 μ L
qEx-DNA/RNA Kit de extracción o purificación de ácidos nucleicosTIANLONGqEx-ADN/ARN
SDSBiografía de la capital441060
Hidróxido de sodio (NaOH)XILONGS  CientíficoXK13-011-00027
SSCBiografía de la capital441050
Baño de agua termostáticoSURUIHH-W600

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Primm, T. P., Lucero, C. A., Falkinham, J. O. III Health impacts of environmental mycobacteria. Trends Genet. 38 (8), 821-830 (2004).
  2. Sawyer, J., et al. Mycobacterium bovis and its impact on human and animal tuberculosis. Trends Genet. 39 (8), 587-592 (2023).
  3. Zhao, Q., et al. The impact of DNA microarray chip technology on the diagnosis and management of non-tuberculous mycobacterial infections in immunocompromised patients. Antimicrob Agents Chemother. 65 (12), e01500-e01500 (2021).
  4. Liu, S., et al. DNA microarray-based detection of drug-resistant Mycobacterium strains: a single-center experience. Clin Microbiol Infect. 26 (10), 1400-1407 (2020).
  5. Li, J., et al. Comparative evaluation of DNA microarray and next-generation sequencing for Mycobacterium identification. Int J Infect Dis. 118, 250-258 (2022).
  6. Chen, K., et al. Optimizing probe design for DNA microarray-based Mycobacterium identification: a computational biology approach. BMC Microbiol. 19 (2), 120-129 (2019).
  7. Michelet, L., Boschiroli, M. L. Mycobacterium uberis. Microorganisms. 8 (11), 1701(2020).
  8. Imran, M., et al. DNA microarray technology for the detection and identification of Mycobacterium species: a review. J Microbiol Biotechnol Res. 6 (2), 275-285 (2020).
  9. Garcia-Sanchez, L., et al. Advances in DNA microarray technology for Mycobacterium detection and characterization. J Mol Diagn. 24 (5), 650-662 (2022).
  10. Wang, L., et al. Machine learning analysis of SERS fingerprinting for the rapid determination of Mycobacterium tuberculosis infection and drug resistance. Comput Struct Biotechnol J. 26 (20), 5364-5377 (2022).
  11. Wang, X., et al. Integration of DNA microarray data with clinical outcomes in tuberculosis patients: implications for personalized medicine. Mol Diagn. 16 (3), 150-160 (2024).
  12. Wang, X., et al. Rapid identification of Mycobacterium tuberculosis complex and common non-tuberculous Mycobacteria by DNA microarray chip. BMC Microbiol. 21 (1), 242(2021).
  13. Smith, J. D., et al. DNA microarray insights into Mycobacterium epidemiology and control strategies. J Clin Microbiol. 60, e02033-e02121 (2022).
  14. Garcia, L. M., et al. Tracking Mycobacterial spread via DNA microarray: a community-based study. PLoS One. 18 (3), e0282123(2023).
  15. Li, H., et al. Economic evaluation of DNA microarray chip technology in Mycobacterium diagnosis. Diagnostics. 11 (12), 2235(2021).
  16. Wang, Z., et al. Cost-benefit analysis of implementing DNA microarray chip for Mycobacterium detection in clinical settings. J Med Econ. 25 (1), 113-122 (2022).
  17. Liu, Y., et al. False positives and false negatives in DNA microarray chip detection of Mycobacteria: a comprehensive analysis. Microb Pathog. 149, 104671(2020).
  18. Chen, L., et al. Validation and improvement of DNA microarray chip for Mycobacterium identification: coping with genetic variants. Front Cell Infect Microbiol. 11, 627923(2021).

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