Artículo de método

Desarrollo de un nuevo crioprotector con bajo contenido de DMSO para la conservación de células madre de sangre periférica

DOI:

10.3791/68275

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20 de junio de 2025

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1Department of Hematology, Affiliated Nanshan Hospital of Shenzhen University, 2Institute of Infection, Immunology and Tumor Microenvironment, Hubei Province Key Laboratory of Occupational Hazard Identification and Control, School of Medicine, Wuhan University of Science and Technology, 3Department of Hematology & Oncology, National Cancer Center/National Clinical Research Center for Cancer/Cancer Hospital & Shenzhen Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, 4School of Medicine, South University of Science and Technology, 5Nanjing SSCELL Biotechnology Co., Ltd.

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

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El protocolo utiliza un crioprotector de células madre hematopoyéticas que contiene una concentración muy baja de dimetilsulfóxido y demuestra su seguridad clínica y eficacia en la protección de las células madre hematopoyéticas, proporcionando una nueva estrategia para la criopreservación de células madre hematopoyéticas en el trasplante clínico de células madre autólogas.

Resumen

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La criopreservación de células madre hematopoyéticas de sangre periférica (PBHSC) es fundamental para el trasplante autólogo de células madre (ASCT), pero los agentes crioprotectores tradicionales (TCPA) que contienen un 10% de dimetilsulfóxido (DMSO) plantean problemas de seguridad debido al riesgo de toxicidad. Este estudio tuvo como objetivo validar un nuevo agente crioprotector con bajo contenido de DMSO (CPA, 2% DMSO) para la conservación de PBHSC a -80 °C, eliminando la necesidad de almacenamiento de nitrógeno líquido. Los PBHSC de seis donantes se dividieron en grupos de CPA y TCPA. El CPA se mezcló con PBHSCs (1:1 vol/vol) y se almacenó directamente a -80 °C. El TCPA (10% DMSO + 5% albúmina humana) se sometió a un enfriamiento gradual (1 °C/min) y almacenamiento de nitrógeno líquido. Después de 1 mes, ambos grupos se descongelaron en un baño de agua a 37 °C. Se comparó la viabilidad celular, la integridad del citoesqueleto (microfilamentos/microtúbulos), la actividad mitocondrial y la capacidad de formación de colonias. Después de la descongelación, la supervivencia de PBHSC fue comparable entre CPA (91,29%) y TCPA (90,07%). Sin embargo, el CPA superó al TCPA en los ensayos de viabilidad celular (CPA: 89,38% frente a TCPA: 79,55%; p < 0,05). El análisis del citoesqueleto reveló microfilamentos y microtúbulos intactos en las células conservadas con CPA, con una claridad estructural superior al TCPA. La actividad mitocondrial en las células tratadas con CPA reflejó las PBHSC frescas, exhibiendo una actividad 8,5% mayor que la TCPA (p < 0,05) y un aumento en el número de complejos mitocondriales. Los ensayos de formación de colonias confirmaron aún más la superioridad de CPA, con un mayor número de colonias después de la inducción. El CPA permite la criopreservación segura y cómoda de PBHSC a -80 °C utilizando DMSO ultrabajo (2 %), lo que elimina la dependencia del nitrógeno líquido. Su mayor viabilidad celular y preservación mitocondrial sugieren ventajas clínicas al reducir los riesgos de toxicidad por infusión. Este protocolo ofrece una estrategia transformadora para ASCT, optimizando la seguridad y la eficiencia operativa.

Introducción

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El trasplante autólogo de células madre hematopoyéticas (TCMA) es una opción de tratamiento bien establecida para diversas neoplasias hematológicas malignas, como la leucemia, el linfoma y el mieloma múltiple, en la que sirve como terapia de primera o segunda línea para reconstituir la hematopoyesis y restaurar la competencia inmunitaria después de la quimioterapia intensiva o la radioterapia 1,2,3,4,5,6,7 . Los resultados exitosos de ASCT dependen críticamente de la viabilidad de las células madre hematopoyéticas de sangre periférica (PBHSC) criopreservadas, que deben conservar la capacidad funcional para la reconstitución hematopoyética e inmune 8,9,10,11,12. El almacenamiento de células madre hematopoyéticas es un paso crítico en el TCMA porque después de la recolección autóloga de células madre hematopoyéticas, los pacientes generalmente se someten a radiación, quimioterapia y otras terapias para eliminar las células tumorales. La calidad del almacenamiento de células madre hematopoyéticas está directamente relacionada con el éxito o fracaso de la reconstitución hematopoyética e inmune 13,14,15,16,17,18. Para garantizar la viabilidad de las células madre hematopoyéticas después de la criopreservación, las prácticas clínicas a menudo implican la adición de albúmina sanguínea humana y dimetilsulfóxido (DMSO) como CPA. Estos agentes son cruciales para mantener la actividad celular durante y después del proceso de criopreservación. Por lo general, la concentración de DMSO utilizada oscila entre el 5% y el 10% (v/v). Los estudios han indicado que mantener una concentración de DMSO de al menos 3,5% a 10% (v/v) puede mejorar la eficacia de la criopreservación de células madre hematopoyéticas19,20. Sin embargo, la aplicación clínica del DMSO sigue siendo problemática debido a la toxicidad dependiente de la dosis, ya que entre el 30% y el 60% de los receptores de trasplantes refieren efectos adversos como náuseas, vómitos e hipotensión21,22. Para abordar las limitaciones de los agentes crioprotectores convencionales (CPA) que contienen 5%-10% de dimetilsulfóxido (DMSO), este estudio tiene como objetivo desarrollar un nuevo CPA que permita la criopreservación segura y eficiente de PBHSC a -80 °C utilizando concentraciones ultrabajas de DMSO (2% v/v), eliminando así la necesidad de protocolos complejos de nitrógeno líquido y mitigando la toxicidad asociada al DMSO.

Las alternativas emergentes, como los CPA basados en trehalosa o mejorados con polímeros, se muestran prometedores desde el punto de vista preclínico, pero se enfrentan a obstáculos en la traslación clínica debido a obstáculos regulatorios o a la incompatibilidad con los protocolos estándar de descongelación23. Por el contrario, nuestro CPA se basa en el perfil de seguridad establecido de los sistemas HSA-DMSO, al tiempo que introduce proporciones de aditivos optimizadas que mejoran la citoprotección. Este método es especialmente adecuado para centros clínicos que carecen de infraestructura de nitrógeno líquido o que requieren flujos de trabajo rápidos. Sin embargo, para el almacenamiento a largo plazo (>2 años), el nitrógeno líquido sigue siendo preferible24. Los médicos deben equilibrar la simplicidad del protocolo con la tolerancia individual del paciente al DMSO, asegurando la aplicación personalizada de esta estrategia para maximizar la seguridad y la eficiencia operativa en el trasplante de células madre hematopoyéticas.

En este estudio, el empleo de crioprotectores con un contenido reducido de DMSO representa una estrategia crucial para preservar simultáneamente la eficacia de la criopreservación de células madre hematopoyéticas y minimizar la toxicidad asociada. Se evaluó la efectividad, seguridad y conveniencia de un CPA de células madre hematopoyéticas recientemente desarrollado para preservar las células madre hematopoyéticas de sangre periférica (PBHSC). Se implementó un método simple de congelación directa utilizando el novedoso CPA, evitando los protocolos convencionales de criopreservación. Los hallazgos demuestran que la criopreservación en un solo paso de suspensiones celulares a -80 °C utilizando DMSO CPA de baja concentración logra efectos de conservación superiores en comparación con el CPA tradicional (TCPA). Este enfoque puede ofrecer estrategias novedosas para simplificar el proceso clínico del trasplante de células madre hematopoyéticas (TCMH).

Protocolo

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Los pacientes de oncología hematológica sometidos a TCMA se reclutaron desde junio de 2020 hasta junio de 2022 en el departamento de hematología del Hospital Oncológico de Shenzhen. Se tomaron muestras de células sanguíneas antes y después de la movilización del trasplante para el TCMH, incluso dos casos de leucemia mieloide aguda (LMA), dos casos de linfoma de Hodgkin (LH), un caso de linfoma cutáneo histiocítico genuino (CGHL) y un caso de linfoma mediastínico primario de células B (PMBL), con una mediana de edad de 53 años y un intervalo de 35 a 61 años. El estudio recibió el consentimiento informado de los pacientes y la aprobación del comité de revisión ética del Hospital Oncológico de Shenzhen, con el número de documento de aprobación ética AF-SC-07-2.0. Todos los procedimientos experimentales con animales fueron aprobados por el Comité de Ética de Animales Experimentales del Hospital Oncológico de la Academia China de Ciencias Médicas (Aprobación No. NCC2018A073) y cumplió con las directrices internacionales para la investigación con animales.

1. Subempaquetado y criopreservación de muestras de células madre hematopoyéticas

  1. Preparación de una estación de trabajo aséptica
    1. Lávese bien las manos y use mascarillas y guantes estériles. Desinfecte las manos, las muñecas y los codos con etanol al 75%.
    2. Esterilice todos los instrumentos de repuesto (pipetas, hemostáticos) con autoclave o irradiación UV. Coloque los siguientes materiales en el gabinete de bioseguridad: 1 mL de puntas de pipeta estériles sin pirógenos (2 cajas), pipeta de 1000 μL, tubos de criopreservación estériles de 1,8 mL, tubos de centrífuga de 50 mL y una caja de almacenamiento de tubos de criopreservación (caja de congelación programable).
  2. Etiquetado y mezcla de células-CPA
    1. Etiquete los tubos de criopreservación con la identificación de la muestra, la fecha, el recuento de células y el nombre del donante.
    2. Conecte la bolsa de células madre hematopoyéticas que contiene 180-200 mL de células madre hematopoyéticas a la bolsa que contiene CPA que contiene 100 mL de nuevo crioprotector con bajo contenido de DMSO utilizando un tubo de infusión estéril.
    3. Pinza el punto medio del tubo con un hemostático estéril. Conecte un extremo a la bolsa de mezcla de celda y CPA y el otro a un tubo de centrífuga de 50 ml.
  3. Relleno y criopreservación
    1. Suelte el hemostático para permitir el flujo controlado de la mezcla de celda y CPA en el tubo de centrífuga.
    2. Aspire alícuotas de 1 mL del tubo de centrífuga con una pipeta. Transfiera las alícuotas a criotubos premarcados (30 tubos/muestra). Apriete las tapas y coloque los tubos en la caja de almacenamiento.
  4. Almacenamiento y transporte
    1. Transfiera inmediatamente la caja de almacenamiento a un refrigerador de -80 °C. Para el transporte, empaque los criotubos en hielo seco (-78,5 °C) con control de temperatura.

2. Criopreservación y recuperación de PBHSCs

  1. Preparación y mezcla de CPA y TCPA
    1. Preenfriar una plataforma de hielo a 2-8 °C. Descongele las células madre hematopoyéticas CPA y TCPA de acuerdo con las pautas del fabricante (consulte la Tabla 1 para conocer las composiciones de CPA / TCPA).
    2. Mezcle CPA y TCPA con seis muestras de PBHSC en una proporción de volumen de 1:1 en la plataforma de hielo. Transfiera la suspensión celular a crioviales estériles.
  2. Criopreservación CPA
    1. Coloque directamente los crioviales en un congelador a -80 °C. Asegúrese de que la concentración final de DMSO en la suspensión sea del 2% (v/v). Almacene las muestras durante 1 mes.
  3. Criopreservación TCPA (control comparativo)
    1. Prepare TCPA que contenga 5% de albúmina en sangre humana y 10% de DMSO (v/v). Cargue las suspensiones de PBHSC en crioviales y enfríe a -80 °C a 1 °C/min utilizando un congelador programable.
    2. Transfiera los crioviales a nitrógeno líquido para su almacenamiento a largo plazo. Almacene las muestras durante 1 mes.
  4. Reanimación celular
    1. Recupere los crioviales después de 1 mes. Descongele las células en un baño de agua a 37 °C con agitación suave (≤ 5 min).
    2. Centrifugar a 300 x g durante 10 min para eliminar los residuos de CPA/TCPA. Vuelva a suspender 1 mL de células en un medio de cultivo RPMI 1640 precalentado para ensayos posteriores.

3. Ensayo de viabilidad celular

  1. Recuento de células basado en imágenes
    1. Prepare una solución de tinción mixta que contenga 10 μg/mL de naranja de acridina (AO) y 10 μg/mL de yoduro de propidio (PI).
    2. Mezcle 100 μL de suspensión celular con 100 μL de solución de tinción (proporción 1:1) en un tubo de microcentrífuga estéril.
    3. Cargue 10 μL de la muestra teñida en el contador de células automatizado. Analice la viabilidad de la célula utilizando el software integrado:
      Viabilidad = células vivas / células totales x 100%
  2. Validación de citometría de flujo
    1. Prepare la solución de tinción de anexina V-FITC/PI mezclando anexina V-FITC (5 μL) y PI (5 μL) en 100 μL de tampón aglutinante.
    2. Añadir 300 μL de suspensión celular a la solución de tinción e incubar a 25 °C durante 15 min en la oscuridad.
    3. Centrifugar la mezcla a 300 x g durante 5 min y desechar el sobrenadante. Resuspender las células en 500 μL de PBS y analizar la viabilidad utilizando un citómetro de flujo25.

4. Ensayo formador de colonias

  1. Preparación de la suspensión celular
    1. Mezcle la suspensión celular con una solución de azul de tripano al 0,4% en una proporción de 1:1 e incube durante 3 minutos para distinguir las células viables y muertas. Realice recuentos duplicados utilizando un contador de células automatizado para determinar la densidad de células viables (garantizar la viabilidad >90%). Ajuste el volumen de suspensión celular a la concentración objetivo (1 x 106 células/mL) y filtre a través de un filtro de 40 μm para garantizar la dispersión de una sola célula. Filtre la suspensión celular a través de un filtro celular estéril de 40 μm para eliminar los agregados.
  2. Mezcla media
    1. Combine 1 mL de suspensión celular con 9 mL de medio de unidad formadora de colonias de ratón comercial en un tubo cónico de 15 mL (1:10 v/v).
    2. Agite la mezcla a 1.500 rpm durante 30 s para garantizar la homogeneidad. Centrifugar a 100 x g durante 10 s para eliminar las burbujas de aire.
  3. Siembra de celdas y configuración de la humedad
    1. Dispense 1,5 ml de mezcla sin burbujas en una placa de Petri estéril de 35 mm. Agregue 3 ml de agua destilada estéril a una ranura periférica del plato (o coloque un recipiente estéril separado dentro de la tapa del plato) para mantener la humedad.
    2. Selle el plato en una cámara humidificada (≥ 95% de humedad).
      1. Para preparar la cámara, coloque dos capas de papel absorbente estéril en un recipiente de plástico con tapa (por ejemplo, una placa de Petri de 15 cm). Agregue 10 mL de agua desionizada estéril para saturar el papel. Coloque la placa de cultivo manchada en el centro de la cámara, asegurándose de que no haya contacto directo entre la placa y el papel mojado. Envuelva la película transparente alrededor de la unión entre la tapa y el recipiente 3 veces para un sellado hermético. Alternativamente, asegure los bordes de la tapa con cinta de laboratorio. Incubar la cámara sellada a 37 °C durante 30 minu para equilibrar la humedad ≥ 95%.
  4. Cultivo de colonias y enumeración
    1. Incubar las células a 37 °C bajo 5% de CO2 durante 16 días. Cuente las colonias hematopoyéticas (≥ 50 células por grupo) utilizando un microscopio invertido con un aumento de 40x. Calcule las unidades formadoras de colonias (UFC) por 1 x 104 celdas sembradas.

5. Detección de actividad mitocondrial

  1. Tinción celular con Rhodamine 123
    1. Vuelva a suspender las PBHSC a 1 x 106 células/mL en 1 mL de medio RPMI1640. Añadir colorante Rhodamine 123 hasta una concentración final de 5-10 μM. Incubar las células en CO2 al 5% a 37 °C durante 10 min.
    2. Centrifugar la suspensión celular a 300 x g durante 5 min. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 1 mL de RPMI1640 fresco. Repita la centrifugación y vuelva a suspender en 1 mL de PBS.
  2. Análisis de microscopía confocal
    1. Limpie un portaobjetos de vidrio limpio con papel sin pelusa para eliminar el polvo o los contaminantes.
    2. Vuelva a suspender las PBHSC teñidas en PBS a una densidad adecuada para evitar señales superpuestas. Pipetear 10-20 μL de suspensión celular y dispensarlo lentamente en el centro del portaobjetos.
    3. Incline el cubreobjetos en un ángulo de 45°, toque suavemente la gota con un borde y bájelo gradualmente para minimizar las burbujas de aire. Presione ligeramente para asegurarse de que las células se distribuyan uniformemente en una monocapa.
    4. Coloque el portaobjetos horizontalmente en la oscuridad durante 5 minutos para permitir que las celdas se asienten. Proceda inmediatamente al análisis de microscopía confocal.
    5. Monta las células teñidas en un portaobjetos de vidrio. Observar la distribución mitocondrial utilizando un microscopio confocal (ex/em: 488/525 nm).
  3. Cuantificación por citometría de flujo
    1. Analice la intensidad de fluorescencia de la rodamina 123 utilizando un citómetro de flujo (canal FL1). Utilice PBHSC tratadas con peróxido de hidrógeno (1 mM, 1 h) como controles positivos26.

6. Tinción del citoesqueleto de PBHSC

  1. Tinción de microfilamentos (Actin Tracker Green-488)
    1. Prepare la sonda fluorescente de faloidina conjugada AF488 disuelta en PBS a una concentración final de 5 U/mL. Diluir la solución madre (200 U/mL en metanol) mezclando 5 μL de caldo con 195 μL de PBS (dilución 1:40). Vórtice a fondo durante 10 s para garantizar la homogeneidad.
    2. Añadir 200 μL de la solución de trabajo preparada Actin Tracker Green-488 (5 U/mL) a las PBHSC. Incubar las células a 25 °C durante 30 min en la oscuridad.
    3. Lave las células 2 veces con 1 mL de tampón de lavado inmunotinción (0,1% Triton X-100 en PBS). Contratinción de núcleos con 200 μL de DAPI (1 μg/mL) durante 5 min a 25 °C en la oscuridad.
  2. Tinción de microtúbulos (Tubulin Tracker Red)
    1. Prepare una sonda fluorescente de paclitaxel conjugada por infrarrojos disuelta en PBS a una concentración final de 1 μM. Diluya la solución madre (100 μM en DMSO) añadiendo 10 μL de caldo a 990 μL de PBS (proporción de dilución 1:100). Agite la mezcla durante 10 s para garantizar la homogeneidad y protegerla de la luz.
    2. Prepare la solución de trabajo Tubulin Tracker Red a una concentración final de 250 nM en medio completo. Diluir la solución madre (1 mM en DMSO) añadiendo 2,5 μL de caldo a un medio de 997,5 μL (relación de dilución 1:400). Agitar la mezcla durante 10 s y añadir 200 μL a las PBHSC. Incubar a 25 °C durante 30 min en la oscuridad.
    3. Lave las células 2 veces con 1 ml de tampón de lavado inmunotinción. Contratinción de núcleos con 200 μL de DAPI (1 μg/mL) durante 5 min a 25 °C en la oscuridad.
  3. Montaje y microscopía
    1. Lave las células manchadas 2 veces con PBS. Mezcle las células teñidas con una solución de glicerol-PBS al 90 % (90 % de glicerol y 10 % de PBS, v/v) en una proporción de volumen de 1:1. Pipetear 10 μL de la mezcla en un portaobjetos de vidrio. Incline el cubreobjetos a 45° y bájelo gradualmente para evitar burbujas de aire.
    2. Analice la morfología de la actina/microtúbulos utilizando un microscopio de fluorescencia (excitación de 488 nm para el verde de actina; 561 nm para el rojo de tubulina). Incluya controles positivos: PBHSC tratadas con citocalasina B (5 μM, 2 h) para la disrupción de actina y PBHSC tratadas con colchicina (10 μM, 3 h) para la despolimerización de microtúbulos.

7. Evaluaciones de seguridad de CPA

  1. Prueba de hemólisis
    1. Prepare una suspensión de glóbulos rojos de conejo al 2% con sangre fresca anticoagulada con EDTA.
    2. Añadir CPA (0,1-0,5 mL) y solución salina fisiológica (2,0-2,4 mL) a 2,5 mL de suspensión celular en tubos de vidrio.
    3. Utilice solución salina como control negativo y agua esterilizada como control positivo. Incubar a 37 °C durante 3 h y observar la hemólisis/coagulación bajo un microscopio.
  2. Prueba de alergia sistémica
    1. Preparación animal
      1. Utilice 36 conejillos de indias Hartley SPF (50% machos, 271-307 g; 50% hembras, 270-301 g) de 4-5 semanas de edad. Mantener las siguientes condiciones de la carcasa: Temperatura: 16-26 °C (± 4 °C fluctuación diaria), Humedad: 40%-70%, Ventilación: 8-10 cambios de aire/h, Ciclo de luz: 12 h luz/oscuridad
    2. Fase de sensibilización
      1. Inyecte CPA en el cuadrante inferior izquierdo de la cavidad peritoneal a 2 mL/kg (bajo) o 6 mL/kg (alto) en los días 1, 3 y 5. La dosis baja (2 mL/kg) simula los niveles de exposición clínica, mientras que la dosis alta (6 mL/kg) representa el margen de seguridad 3x para evaluar la hipersensibilidad dependiente de la dosis, siguiendo la Directriz 406 de la OCDE para pruebas de alergia sistémica27,28.
      2. Use albúmina sérica humana (control positivo) y solución salina (control negativo).
    3. Fase de impugnación
      1. Administrar CPA por vía intravenosa a través de la vena marginal del oído a 4 mL/kg (bajo) o 12 mL/kg (alto) los días 19 y 26. Las dosis de desafío (2 dosis de sensibilización) se alinean con los protocolos establecidos para provocar anafilaxia en cobayas presensibilizadas, según lo validado en estudios previos de biocompatibilidad de crioprotectores29.
      2. Monitorizar los síntomas de anafilaxia (dificultad respiratoria, convulsiones) durante 1 h después de la inyección.
    4. Manejo post-experimental
      1. Regrese los conejillos de indias a la atención veterinaria para una observación de 72 h. Eutanasia mediante exanguinación de la aorta abdominal bajo anestesia con isoflurano.
  3. Ensayo de toxicidad sistémica aguda
    1. Inyección de ratón
      1. Inyecte 50 mL/kg de CPA en la vena de la cola de 10 ratones machos ICR (32,0-37,1 g, 6 semanas de edad). Utilice ratones inyectados con solución salina como controles negativos (n = 10).
    2. Protocolo de observación
      1. Monitorizar la supervivencia, los signos de toxicidad y el peso a las 4, 24, 48 y 72 h después de la inyección. Mantener las condiciones de la vivienda: Temperatura: 20-25 °C (± 3 °C diarios), Humedad: 40%-70%, Ventilación: 10-20 cambios de aire/h.
    3. Eutanasia
      1. Anestesiar ratones con isoflurano al 3%. Eutanasia por exanguinación de aorta abdominal.
  4. Prueba de irritación vascular
    1. Administración de conejos
      1. Utilice 6 conejos neozelandeses machos (3,65-4,36 kg, 7-8 meses de edad). Inyecte 5 mL/kg de CPA en la vena del oído derecho semanalmente (3 dosis en total). Inyecte solución salina en el oído izquierdo como control negativo.
    2. Evaluación de tejidos
      1. Examine los sitios de inyección en busca de eritema, edema o necrosis en los días 18 y 19. Marque la irritación en el lugar de la inyección en función de la gravedad del eritema, el edema y la necrosis. Aplicar el sistema de puntuación ISO 10993-12 con grados que van de 0 (sin reacción) a 4 (necrosis grave)30,31.
    3. Manejo post-experimental
      1. Anestesiar conejos con tiletamina-zolazepam (5 mg/kg, IM). Eutanasia mediante sangría rápida de la arteria carótida.

8. Trasplante de PBHSCs

  1. Inscripción y movilización de pacientes
    1. Inscribir a seis pacientes que cumplan con los criterios de trasplante: Células mononucleares ≥ 5 x 108 células/kg
      Células CD34+ ≥ 2 x 106 células/kg23. Excluir a los pacientes de <18 o >65 años, aquellos con infecciones activas, disfunción orgánica grave, embarazo/lactancia, tratamiento inmunosupresor reciente (dentro de las 4 semanas) o trastornos psiquiátricos no controlados.
    2. Movilice las células madre hematopoyéticas de la médula ósea a la sangre periférica utilizando el factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF). Movilizar las células madre hematopoyéticas de la médula ósea a la sangre periférica mediante la administración de factor estimulante de colonias de granulocitos por vía subcutánea diariamente a una dosis de 10 μg/kg (la dosis exacta varía de persona a persona) durante 5 días consecutivos.
  2. Recolección y criopreservación de PBHSCs
    1. Recolectar PBHSC movilizadas utilizando un dispositivo de aféresis con una tasa de flujo sanguíneo establecida en 40 mL/min y una proporción de anticoagulante a sangre total de 1:12. Procese 15-16 L de sangre entera por sesión para obtener 180-200 mL de concentrado de PBHSC. Divida la muestra en dos alícuotas, y cada sobre tiene una capacidad de 90-100 mL.
    2. Resuspender la primera alícuota en dimetilsulfóxido (DMSO) al 10% y albúmina sérica humana al 5% para transfusión clínica. Coloque la alícuota resuspendida en un recipiente de congelación programable con una velocidad de enfriamiento de -1 °C/min a -80 °C. Etiquete la bolsa criogénica con la identificación del paciente y los parámetros de congelación (por ejemplo, número de lote, fecha). Preparar la segunda alícuota en suero bovino al 5% de DMSO y al 10% fetal bovino para la prueba de viabilidad.
  3. Descongelación y reinfusión
    1. Descongele las PBHSC criopreservadas en un baño de agua a 37 °C (≤ 2 min). Administrar células descongeladas por vía intravenosa después del acondicionamiento de quimioterapia/radioterapia. Administrar las células por vía intravenosa a través de un catéter venoso central dentro de los 30 minutos posteriores a la descongelación utilizando una bomba de jeringa a 3-5 mL/min.
  4. Seguimiento post-trasplante
    1. Seguimiento de la recuperación hematopoyética mediante hemogramas diarios: Umbral de éxito de los neutrófilos: ≥ 0,5 x 109 células/L; Umbral de éxito plaquetario: ≥ 20 x 109 células/L32.
    2. Monitorizar la reconstitución inmunitaria mediante el análisis de subconjuntos de linfocitos. Recoja 5 mL de muestras de sangre periférica en tubos de EDTA. Tiña las células con anticuerpos fluorescentes contra CD3, CD4, CD8, CD19 y CD56 durante 15 minutos en la oscuridad. Analice los subconjuntos de linfocitos utilizando un citómetro de flujo y una estrategia de compuerta estandarizada. Compare los recuentos absolutos (células/μL) con los rangos de referencia saludables correspondientes a la edad para su interpretación.

9. Análisis de la subpoblación de PBHSC

  1. Tinción de anticuerpos
    1. Prepare PBHSC congelados (grupos CPA/TCPA) y descongele en un baño de agua a 37 °C.
    2. Células de etiqueta con anticuerpos fluorescentes: CLP: CD45-CD34+CD10+ (clones HI30+4H11+HI10a); MEP: CD45-CD38+CD135-CD45RA- (clones HIT2+4G8+5F3+HI100); GMP: CD45-CD38+CD135+CD45RA+ (Figura 1). Centrifugar las PBHSC descongeladas a 300 x g durante 5 min para eliminar los agentes criopreservativos. Ajuste la concentración celular a 1 x 106 células/mL en PBS que contenga 2% de suero fetal bovino.
    3. Prepare cócteles de anticuerpos utilizando los clones HI30/4H11/HI10a para CLP y HIT2/4G8/5F3/HI100 para MEP/GMP a los títulos recomendados por el fabricante. Incubar las células con mezclas de anticuerpos durante 30 minutos en la oscuridad a 4 °C con un suave vórtice cada 10 minutos. Lave las células teñidas 2 veces con PBS frío + azida de sodio al 0,1% mediante centrifugación a 200 x g durante 3 min. Resuspenda las células en 500 μL de PBS con 1 μg/mL de DAPI para la compuerta de viabilidad antes del análisis de citometría de flujo.
    4. Incubar a 4 °C durante 30 min en la oscuridad. Lavar 2 veces con PBS que contenga 1% de BSA.
  2. Configuración de la citometría de flujo
    1. Resuspender las células teñidas en 500 μL de PBS. Analice subpoblaciones con un citómetro de flujo: configure láseres (488 nm, 640 nm) y filtros (FITC, PE, APC). Recopile ≥ 10.000 eventos por muestra.
    2. Poblaciones de puertas basadas en la dispersión frontal/lateral y la intensidad de fluorescencia (Figura 1).
  3. Comparación de datos
    1. Calcule los porcentajes de CLP/MEP/GMP utilizando el software FlowJo v10.8. Compare los grupos de CPA con TCPA utilizando la prueba t de Student (α = 0,05). Visualice las diferencias utilizando Prism 9.0 (gráficos de barras con SEM)33.

10. Análisis estadístico

  1. Realizar una comparación de medias de variables numéricas continuas que se ajustan a una distribución normal con varianza chi-cuadrado, utilizando la prueba t, y para variables numéricas continuas que no se ajustan a una distribución normal, probarlas de forma no paramétrica.
  2. Reporte datos para variables continuas como la media ± la desviación estándar o la mediana y los cuartiles superior e inferior. Utilice la prueba exacta de Fisher para comparar las tasas entre los dos grupos.
  3. Analice los datos y trace con el software SPSS 26.0 y GraphPad Prism 9. Considere todas las diferencias en las pruebas de dos colas como estadísticamente significativas si p < 0,05. Algunos de los datos se presentan en forma de descripciones estadísticas.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Comparación de los métodos de criopreservación en un solo paso y criopreservación con nitrógeno líquido
La viabilidad de las PBHSC criopreservadas después de la recuperación se evaluó mediante ensayos de AO/PI. Como se muestra en la Figura 2A, se encontró que la viabilidad de las PBHSCs criopreservadas a -80 °C utilizando CPA fue del 91,29% (n = 3, SD = 1,86), mientras que para las conservadas en nitrógeno líquido, la viabilidad fue del 90,07% (n = 3, SD = 1,64). El análisis estadístico no indicó diferencias significativas entre los dos métodos (p > 0,05). Sin embargo, el método de criopreservación en un solo paso demostró ser más rápido y conveniente. Estos resultados sugieren que el método de criopreservación en un solo paso es una alternativa superior para la preservación de células.

El efecto de la criopreservación de la CPA en las PBHSC supera al método convencional de criopreservación
La viabilidad celular de las PBHSC criopreservadas después de la recuperación se detectó mediante ensayos de AO/PI y anexina V/PI. Como se muestra en la Figura 2, la viabilidad celular de seis muestras de PBHSCs recuperadas conservadas con CPA alcanzó el 89,38% (n = 6, SD = 1,87, Figura 2B) y el 88,20% (n = 6, SD = 2,72, Figura 2C), respectivamente, en estos dos ensayos. Sin embargo, los conservados por el TCPA fueron el 79,55% (n = 6, DT = 3,16, Figura 2B) y el 73,05% (n = 6, DE = 7,47, Figura 2C). Estos hallazgos sugieren que el CPA es un crioprotector más eficaz para las PBHSC en comparación con el TCPA, lo que conduce a una mejor preservación de la viabilidad celular y las tasas de recuperación.

Las PBHSC conservadas con CPA mantienen la estructura completa del citoesqueletoy la actividad mitocondrial
La definición estrecha del citoesqueleto se refiere a la red de fibras proteicas, microtúbulos (MT), microfilamentos (MF) y filamentos intermedios (IF) en las células eucariotas34. En este estudio, investigamos principalmente la integridad estructural de MT y MF después de la criopreservación de PBHSCs para demostrar que las PBHSCs podían mantener la integridad del citoesqueleto después de la criopreservación de CPA. Para marcar las estructuras de microfilamentos y microtúbulos de las células vivas, se utilizaron como sondas fluorescentes, respectivamente, el péptido cíclico de pluma fantasma marcado con colorante fluorescente Alexa Fluor 488 y los análogos de Taxol marcados con el grupo fluorescente del infrarrojo lejano. Como se muestra en la Figura 3A, B, los PBHSC conservados por CPA aún mantienen intactas las estructuras de microfilamentos y microtúbulos.

Las mitocondrias de las PBHSC conservadas por CPA se marcaron con una solución de colorante de rodamina 123, y las PBHSC tratadas con H2O2 se utilizaron como control positivo. Los resultados (Figura 3C) mostraron que la estructura mitocondrial se observó en las células conservadas con CPA, mientras que no se observó en el grupo de control positivo. Las mitocondrias marcadas con rodamina 123 también se detectaron mediante citometría de flujo. Se encontró que las PBHSC conservadas con CPA mantuvieron una mejor actividad mitocondrial que el método tradicional (Figura 4).

Las PBHSC conservadas con CPA mantienen la capacidad de formar clones
Además, evaluamos la capacidad proliferativa y diferenciadora de las PBHSC preservadas con CPA y TCPA mediante la realización de ensayos formadores de colonias. Específicamente, evaluamos la capacidad de las PBHSC para formar colonias de BFU-E, CFU-E, CFU-GM y CFU-GEMM en cultivo. El número total de colonias observadas en el grupo de células frescas fue de 70,33 (n = 6, SD = 14,02). En contraste, el grupo CPA exhibió un total de 65.33 colonias (n = 6, SD = 8.07), mientras que el grupo TCPA mostró un conteo significativamente menor de 46.17 colonias (n = 6, SD = 8.50). Estos resultados demuestran que las PBHSC conservadas con CPA mantuvieron sus capacidades proliferativas y diferenciadoras de manera comparable con el control de células frescas, como lo demuestra el número similar de formaciones de colonias en varios linajes celulares. Por el contrario, las PBHSC conservadas con TCPA mostraron una reducción en su potencial proliferativo y diferenciador. Estos hallazgos indican que las PBHSC criopreservadas con CPA conservan mejor sus capacidades funcionales (Figura 5 y Figura 6).

Evaluaciones de seguridad de CPA in vitro
Se realizó monitorización in vitro de la hemólisis eritrocitaria de conejo. Para probar los efectos de diferentes volúmenes de CPA (que oscilan entre 0,1 y 0,5 mL) y solución salina normal (que oscila entre 2,0 y 2,4 mL) sobre la hemólisis, se añadieron 2,5 mL de suspensión de glóbulos rojos de conejo al 2% a tubos de ensayo de vidrio junto con los CPA o solución salina normal. También se incluyeron control negativo (agua esterilizada para inyección) y control positivo (solución salina normal). En los tubos que contenían CPA o solución salina normal, los eritrocitos se asentaron en el fondo del tubo y la solución superior era transparente e incolora. Después de la agitación, los eritrocitos se dispersaron uniformemente. El grupo de control positivo (agua esterilizada) mostró un color rojo brillante y no se observó estratificación, con solo una pequeña cantidad de glóbulos rojos en el fondo del tubo (Figura 7). Estos resultados sugieren que los CPA no causan hemólisis ni condensación de los glóbulos rojos de conejo. Se evaluó la irritación vascular de la CPA en conejos de Nueva Zelanda. Las secciones anatomopatológicas se tiñeron con hematoxilina y eosina (HE) y se realizaron observaciones clínicas generales y de irritación local después de la administración final. No se observaron reacciones anormales en los animales de experimentación, y no se observaron cambios patológicos en los sitios de administración local. Estos hallazgos indican que el CPA no causa irritación vascular en los conejos de Nueva Zelanda.

En el experimento de hipersensibilidad sistémica activa en cobayas, se utilizó CPA para sensibilizar a los animales con inyecciones intraperitoneales de 1,25 mL/kg y 2,5 mL/kg 3x e inyecciones intravenosas de 2,5 mL/kg y 5 mL/kg para la excitación. No se observó hipersensibilidad rápida en los cobayos hasta 21 días después de la última sensibilización, lo que indica que la CPA no causa anafilaxia rápida en los cobayos (Tabla 2).

Se evaluó la toxicidad sistémica aguda en ratones ICR. Cinco ratones experimentales y cinco ratones control fueron inyectados con CPA y solución salina normal a una dosis de 50 mL/kg de peso corporal. Las reacciones del grupo experimental no fueron mayores que las del grupo control. No se observaron convulsiones ni acostarse boca abajo en ninguno de los grupos, y no se observaron otros síntomas anormales. Además, no hubo una pérdida de peso significativa en ninguno de los grupos. Estos resultados sugieren que los CPA no presentan toxicidad sistémica aguda para los ratones ICR (Tabla 3 y Tabla 4).

Evaluación del autotrasplante de PBHSCs conservados con CPA
Para evaluar la eficacia del trasplante de PBHSC conservadas con CPA para el tratamiento de enfermedades de la sangre, se reclutaron seis pacientes y se trasplantaron a cinco pacientes con PBHSC conservadas con CPA. El trasplante fue exitoso en todos los pacientes excepto en uno, que recibió otro trasplante alogénico debido a la recurrencia de la enfermedad. El recuento de neutrófilos ≥ 0,5 x 109 células/L y el recuento de plaquetas ≥ 20 x 109 células/L se utilizaron como marcadores de éxito del trasplante.

Las muestras b, c y e se trasplantaron a los pacientes con linfoma correspondientes y el ciclo de reconstrucción funcional fue de 9 días, 9 días y 10 días, respectivamente. Las muestras a y f se trasplantaron a pacientes con leucemia mieloide aguda y el ciclo de reconstrucción funcional fue de 36 días y 16 días, respectivamente. Las muestras del paciente recibieron otro tratamiento debido a la recurrencia de la enfermedad. Excluyendo los datos relacionados con la reconstitución hematopoyética e inmunitaria interrumpida por la infección en el ciclo de 36 días, el tiempo promedio hasta el trasplante exitoso en cinco casos fue de 11 días, y los recuentos de neutrófilos y plaquetas cumplieron con los estándares requeridos. Esta duración es menor que el ciclo de reconstitución hematopoyética de 12,5 días reportado en la literatura previa19. En nuestro estudio, bajo períodos de reconstitución similares, la concentración final de DMSO en la formulación de CPA fue solo del 2%, notablemente más baja que la concentración del 3,5% típicamente citada20. Más importante aún, no se observaron reacciones adversas en los pacientes, lo que confirma aún más la seguridad y eficacia de nuestro método de preservación de células madre hematopoyéticas en aplicaciones clínicas (Tabla 5).

El análisis de la subpoblación de PBHSC reveló que la subpoblación celular de progenitores linfoides comunes (CLP) y progenitores de megacariocitos/eritrocitos (MEP) en PBHSC conservadas con CPA era mayor que la del régimen tradicional. Sin embargo, la subpoblación celular de progenitores de granulocitos/macrófagos (GMP) no fue significativamente diferente. Estos hallazgos pueden explicar la reconstitución hematopoyética e inmunitaria más rápida observada en los pacientes tratados (Figura 8A-C).

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Figura 1: Modelos de jerarquía hematopoyética. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Viabilidad celular de las PBHSC. (A) La viabilidad de las PBHSC preservadas por el método de un solo paso con CPA fue del 91,29% (DE = 1,86), y las conservadas por el método de nitrógeno líquido fueron del 90,07% (DE = 1,64), p > 0,05 con respecto al método de criopreservación en un solo paso y el método de criopreservación con nitrógeno líquido. (B) La tasa de recuperación de las PBHSC almacenadas con CPA fue del 89,38% (n = 6, SD = 1,87), que fue significativamente mayor que la tasa de recuperación del 79,55% de las PBHSC almacenadas con TCPA (n = 6, SD = 3,16), según lo medido por la detección de AO/PI. (C) La viabilidad de recuperación de las PBHSC conservadas con CPA fue del 88,20% (n = 6, SD = 2,72), que fue significativamente mayor que la viabilidad de recuperación del 73,05% de las PBHSC conservadas con TCPA (n = 6, SD = 7,47), según lo medido por la detección de anexina V/PI después de la recuperación. P<0.01 (prueba T) con respecto a CPA y TCPA. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Análisis estructural de los PBHSC conservados por CPA y TCPA. (A) Estructura de microfilamentos de PBHSC, incluido el grupo de células frescas, el grupo CPA, el grupo TCPA y el grupo de control positivo, según lo visualizado por el péptido cíclico fantasma marcado con tinte fluorescente Alexa Fluor 488. (B) Estructura de los microtúbulos de los PBHSC, incluido el grupo de células frescas, el grupo CPA, el grupo TCPA y el grupo de control positivo, según lo visualizado por los análogos de Taxol marcados con grupos fluorescentes de infrarrojo lejano. (C) La actividad mitocondrial de las PBHSC marcadas con rodamina 123 (incluido el grupo de células frescas, el grupo CPA, el grupo TCPA y el grupo de control positivo) se detectó mediante citometría de flujo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: Análisis funcional de los PBHSC conservados por CPA y TCPA. Actividad mitocondrial de las PBHSC, incluido el grupo de células frescas, el grupo CPA, el grupo TCPA y el grupo de control positivo, según se detecta mediante citometría de flujo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 5: Prueba de potencial formador de colonias. Potencial formador de colonias de PBHSCs conservadas con CPA, TCPA, incluyendo CFU-E, BFU-E, CFU-GM y CFU-GEMM, en comparación con las PBHSCs frescas. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 6: Número total de colonias. El número total de colonias en el grupo de células frescas fue de 70,33 (n = 6, SD = 14,02), el número total de colonias en el grupo CPA fue de 65,33 (n = 6, SD = 8,07) y el número total de colonias en el grupo TCPA fue de 46,17 (n = 6, SD = 8,50). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 7: Evaluación de la seguridad del CPA mediante pruebas con animales. Las imágenes representativas tomadas con una resolución de 10x se muestran en A1-B2. (A, B) Evaluación de la irritación vascular de CPA en el conejo de Nueva Zelanda. A1 y B1 fueron los diagramas de corte de tejido patológico del grupo control negativo preparados después de 72 h y 14 días después de la última administración, respectivamente. A2 y B2 fueron los diagramas de corte de tejido patológico del grupo CPA preparados después de 72 h y 14 días después de la última administración, respectivamente. (C) Monitoreo in vitro de hemólisis de eritrocitos de conejo. Los tubos marcados de la a a la e representaban el grupo de CPA, los tubos marcados con f eran el grupo de control negativo y los tubos marcados con g eran el grupo de control positivo. No hubo hemólisis en el grupo de CPA ni en el grupo de control negativo, mientras que la hemólisis ocurrió en el grupo de control positivo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 8: Análisis de las subpoblaciones de PBHSC. (A) CLP, (B) MEP y (C) de 6 pacientes conservados con CPA y TCPA. (A) Los cocientes promedio de CLP para CPA y TCPA fueron de 16.38% (n = 6, SD = 13.53) y 8.97% (n = 6, SD = 7.88), la subpoblación de CLP en PBHSC congelados en CPA fue mayor que la de TCPA. p > 0,05 (prueba T) con respecto a CPA y TCPA. (B) Las proporciones promedio de MEP para CPA y TCPA fueron 61.07% (n = 6, SD = 12.85) y 55.4% (n = 6, SD = 11.37), la subpoblación de MEP en PBHSC congelados en CPA fue mayor que la de TCPA. p > 0,05 (prueba T) con respecto a CPA y TCPA. (C) Las proporciones promedio de GMP para CPA y TCPA fueron 62.68% (n = 6, SD = 8.20) y 64.70% (n = 6, SD = 11.66), la subpoblación de GMP en PBHSC congelados en CPA fue mayor que la de TCPA. p > 0,05 (prueba T) con respecto a CPA y TCPA. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Componentes de CPARelación de concentraciónComponentes de TCPARelación de concentración
Dimetilsulfóxido4% (v/v)Dimetilsulfóxido10% (v/v)
Albúmina humana5% (m/v)Albúmina humana5% (m/v)
Glucosa2% (m/v)--
Dextrano 402% (m/v)--
Glicerofosfato de sodio0,5% (m/v)--

Tabla 1: Componentes y relación de concentración de CPA y TCPA.

GrupoNúmero de animalesNúmero de animales con diferentes grados de hipersensibilidad
NegativoDébilmente positivoPositivoFuerte PositivoPositivo extremadamente fuerte
Control negativo880000
Control positivo800053
Dosis baja de CPA880000
Dosis alta de CPA880000

Tabla 2: Reacciones de hipersensibilidad en cobayas tras tratamiento con CPA. El grupo de control negativo, el grupo de dosis baja de CPA y el grupo de dosis alta de CPA mostraron reacciones de hipersensibilidad negativas. Por el contrario, todos los conejillos de indias del grupo de control positivo mostraron fuertes reacciones de hipersensibilidad positiva, y tres conejillos de indias experimentaron anafilaxia.

GrupoNumeraciónDosis de administración (mL)Peso (g)
0 h24 h48 h72 h
Control negativo11011.121.4522.0822.8423.14
1102120.1720.9821.4922.29
1103119.5420.4221.3621.81
1104118.6719.3820.2521.21
11050.917.6718.3419.4220.28
Grupo Experimental21061.121.4221.9722.3523.02
2107120.6721.3221.8422.44
2108119.1220.2221.2422.55
2109118.6219.3120.0221.24
21100.917.5718.8319.4120.28

Tabla 3: Resumen del peso del ratón en el experimento de toxicidad aguda. El grupo control negativo y el grupo experimental no mostraron ninguna pérdida de peso significativa después de la administración del fármaco. El peso de todos los animales de experimentación aumentó gradualmente dentro de un rango razonable después de la alimentación convencional durante 24 h, 48 h y 72 h después de la administración.

GrupoNumeraciónDosis de administración (mL)Tiempo de observación
4 h24 h48 h72 h
Control negativo11011.1----
11021----
11031----
11041----
11050.9----
Grupo Experimental21061.1----
21071----
21081----
21091----
21100.9----

Tabla 4: Observación de la toxicidad sistémica aguda en ratones. En la tabla, - significa que no hay reacciones agudas de toxicidad sistémica. El grupo control negativo y el grupo experimental no mostraron ninguna reacción de toxicidad sistémica aguda después de la administración de la dosis durante 4 h, 24 h, 48 h y 72 h después de la administración.

Características del pacienteNuestra investigaciónReporte en la literatura
N652
Edad53 (35-61)55 (21-66)
MILÍMETRO024
HL223
Lucha contra el blanqueo de capital20
CGHL/NHL10
PMBL/NHL10
Otro tipo de enfermedad05
Basado en radioterapia234
A base de quimioterapia318
No. células CD34+ trasplantadas (106 /kg)4.1 (2.9-5.4)6.5 (1.5-24.7)
ANC >0,5×109 /L de recuperación (mediana de días, rango, se excluyeron los datos anormales)10 (8-11)11 (10-13)
PLT >20×109 /L de recuperación (mediana de día, rango, se excluyeron los datos anormales)11 (9-16)12.5 (0-19)
Náuseas015
Vómito04
Mareos01
Cualquier complicación020

Tabla 5: Estadísticas de datos de HSCT. Características del paciente y recuperación hematopoyética tras un TCMA.

Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En este estudio, evaluamos un nuevo CPA para la criopreservación de PBHSC. Los resultados demuestran que la CPA mejora la viabilidad preservada de las PBHSC en comparación con la TCPA. En concreto, la viabilidad de recuperación de las PBHSC conservadas con CPA superó a la del TCPA en más de un 10%. En las células madre, la integridad del citoesqueleto es el requisito básico para el mantenimiento de la actividad y la función de diferenciación de las células madre 35,36. A nivel celular, observamos que tanto las estructuras de microfilamentos como las de microtúbulos en las PBHSCs conservadas con CPA estaban más intactas que en el grupo TCPA, con estructuras de microtúbulos notablemente más claras. Las mitocondrias son la fábrica de energía de las células. Las mitocondrias están directamente involucradas en la respiración celular, el metabolismo y otras actividades vitales, que son orgánulos esenciales para mantener la actividad celular37. La actividad mitocondrial es un indicador crucial de la función de las células madre hematopoyéticas después de la criopreservación y recuperación. En cuanto a la actividad mitocondrial, el grupo de CPA mostró similitudes con las PBHSC frescas. La observación directa de los complejos mitocondriales reveló que su número en el grupo de CPA superó al del grupo de TCPA. Además, se utilizó la citometría de flujo para evaluar cuantitativamente la actividad mitocondrial preservada en cada grupo. Los resultados no mostraron diferencias significativas entre los grupos de CPA y células frescas, pero la actividad fue un 8,5% mayor en el grupo de CPA en comparación con el grupo de TCPA. Esta comparación de los datos de actividad mitocondrial corrobora los hallazgos de viabilidad de la recuperación celular. Además, los ensayos de formación de colonias indicaron que las PBHSC conservadas con CPA conservaron su potencial de diferenciación. El grupo CPA exhibió un mayor número de colonias después de la inducción, lo que corrobora aún más la eficacia de conservación superior de CPA.

El objetivo de este estudio fue aplicar CPA al TCMH clínico para mejorar la actividad de las PBHSC después de la preservación y garantizar la tasa de éxito del trasplante. Antes de aplicar el CPA a los ensayos clínicos, se llevaron a cabo evaluaciones de seguridad en animales de experimentación, lo que proporcionó datos que respaldaban la seguridad del CPA en la aplicación clínica. Estudios previos han demostrado que algunos nuevos CPA han sido identificados como la mejor tecnología de criopreservación para células endoteliales (MHECT-5) y embriones38,39. En la aplicación clínica de un CPA para la preservación de PBHSC, criopreservamos con éxito PBHSC de seis pacientes para HSCT. En particular, el método de criopreservación de un solo paso que utiliza CPA agilizó significativamente el proceso de preservación de muestras. Este método, en comparación con las técnicas de criopreservación de un solo paso para células madre hematopoyéticas reportadas anteriormente, utilizó una concentración más baja de DMSO, lo cual es un avance significativo para aplicaciones clínicas. De los seis pacientes, cinco se sometieron con éxito al trasplante. El resto del paciente recibió tratamiento alternativo debido a la recurrencia de la enfermedad. Se realizó una evaluación estadística del ciclo de reconstrucción funcional de los cinco pacientes que completaron el trasplante. Aparte de un caso en el que el ciclo de reconstrucción se extendió debido a la infección, el tiempo promedio para la reconstitución de las funciones hematopoyética e inmune fue de 11 días, que es más rápido que los 12,5 días citados en la literatura previa. Fundamentalmente, no se observó toxicidad durante el proceso de trasplante. Este resultado es especialmente notable si se considera que la concentración final de DMSO en el método CPA fue solo del 2%, en comparación con la concentración del 10% (v/v) utilizada en el método TCPA. Este uso exitoso de una concentración más baja de DMSO en CPA para minimizar los efectos secundarios valida nuestra estrategia y es vital para la eficacia clínica.

A la luz de la reconstitución funcional acelerada observada en nuestro estudio, investigamos más a fondo las posibles diferencias en el número de células CD34+ transfundidas. El análisis estadístico reveló que el número de células CD34+ transfundidas fue, en promedio, de 2,4 x 106 células/kg, lo que es inferior a las cifras reportadas en la literatura previa40. Esto nos llevó a plantear la hipótesis de que el CPA podría ofrecer una protección superior a subpoblaciones específicas dentro de las PBHSC que son cruciales para la reconstitución hematopoyética e inmunitaria. Para explorar esta hipótesis, realizamos un análisis detallado de las subpoblaciones de CLP, GMP y MEP en PBHSCs conservados con CPA y TCPA. Los resultados mostraron que las subpoblaciones de CLP y MEP en PBHSCs preservadas con CPA aumentaron en comparación con las preservadas con TCPA, mientras que no hubo diferencia significativa en la subpoblación de GMP. CLP puede diferenciarse en células T, células B y células NK en el cuerpo humano; un aumento de la dosis de CLP puede acelerar la reconstitución inmunitaria33. La MEP puede diferenciarse en eritrocitos y plaquetas41. El glicerofosfato de sodio en CPA mejora la síntesis de ATP mitocondrial a través de la lanzadera de glicerofosfato, abordando los déficits de energía causados por la criopreservación. Esto es crítico para las células CLP, que dependen de la glucólisis para la diferenciación linfoide42. Además, la alta desviación estándar de la viabilidad del TCPA fue mayor que la del CPA (7,47 frente a 2,72, Figura 3), lo que indica la variabilidad de los resultados del TCPA, que podría deberse a condiciones de congelación inestables. Por lo tanto, proponemos que la preservación mejorada de CLP y MEP puede ser un factor crítico para acortar el tiempo de recuperación de la función hematopoyética e inmune. Los efectos protectores superiores de la CPA en los subgrupos CLP y MEP parecen facilitar una reconstrucción funcional más rápida durante las terapias transfusionales clínicas. Esto no solo mejora los resultados terapéuticos, sino que también reduce la duración y el costo del tratamiento para los pacientes sometidos a trasplante. En esencia, nuestro método ofrece un enfoque más económico para el TCMH, optimizando los aspectos clínicos y económicos de la atención al paciente.

A pesar de los esfuerzos de investigación en curso para identificar sustancias que podrían reemplazar al DMSO, la búsqueda de alternativas sigue siendo un desafío. Si bien ha habido informes de nuevas tecnologías y sustancias emergentes en este campo 43,44, aún faltan demostraciones rigurosas de seguridad in vitro para estos nuevos compuestos. Del mismo modo, no hay pruebas suficientes para confirmar su seguridad y eficacia para el uso clínico, especialmente en lo que respecta al estudio de las impurezas. Por lo tanto, estas sustancias emergentes requieren una validación exhaustiva antes de que puedan aplicarse en entornos clínicos. En este contexto, creemos que optimizar el uso de DMSO, al tiempo que se garantiza una preservación celular eficaz, sigue siendo la estrategia más viable para las aplicaciones clínicas. Estudios previos han destacado el papel del transporte de glicerofosfato en la producción de ATP y la regulación de la actividad mitocondrial dentro de las células45,46. Sobre la base de esta comprensión, proponemos que la incorporación de glicerofosfato de sodio en el CPA podría servir como una estrategia efectiva para reemplazar una porción significativa del DMSO tradicionalmente utilizado en el TCPA como agente protector osmótico. No se mencionan investigaciones recientes sobre alternativas a bajo contenido de dimetilsulfóxido, lo que sugiere alguna novedad en este método.

En general, los pasos fundamentales de nuestro protocolo de criopreservación incluyen: (i) un control preciso de la concentración de DMSO al 2 % (v/v), (ii) una velocidad de enfriamiento controlada de -1 °C/min y (iii) una descongelación rápida en un baño de agua a 37 °C. Estos pasos aseguran una tensión osmótica mínima y la formación de cristales de hielo. En particular, la concentración reducida de DMSO aborda directamente los problemas de citotoxicidad asociados con las soluciones tradicionales de DMSO al 10%47. El enfriamiento controlado evita el daño del hielo intracelular, como se validó en la criopreservación de células madre mesenquimales48, mientras que la descongelación rápida preserva la función mitocondrial, un factor crítico para la viabilidad posterior a la descongelación49. Optimizamos tres aspectos: (i) Método de mezcla: Los ensayos iniciales revelaron la agregación celular durante la adición de CPA; El cambio a la mezcla gota a gota con vórtice a 500 rpm eliminó la aglomeración. (ii) Protocolo de tinción: El prelavado de células con PBS que contiene 0,05% de Tween-20 mejoró la eficiencia de penetración de anticuerpos en un 18%. (iii) Consistencia de la descongelación: La implementación de una ventana de descongelación estandarizada de 120 s evitó la variabilidad en las tasas de recuperación (± 2% frente al ± 7% en los estudios piloto). Para problemas comunes como el bajo recuento de colonias, el aumento del volumen medio de MethoCult a 2 mL/plato y el control de la humedad (>95%) resolvieron este problema, alineándose con los estándares de cultivo de progenitores hematopoyéticos50. Dos limitaciones merecen atención: (i) Sesgo de subpoblación: mientras que el CPA preserva eficazmente los subconjuntos de CLP y MEP, las poblaciones raras como las HSC a largo plazo CD34+CD38-CD90+ muestran una recuperación un 12% menor en comparación con los controles nuevos (p = 0,03). (ii) Para la evaluación de la integridad del citoesqueleto, que se basa en imágenes cualitativas, algunas métricas cuantitativas (por ejemplo, intensidad de fluorescencia, puntuaciones estructurales) deben incorporarse a análisis más fiables. Nuestro método de CPA avanza en las prácticas actuales a través de: (i) Mejora de la seguridad: Las tasas de hemólisis disminuyeron de 8.2% (TCPA) a 1.5% (CPA) a las 24 h después de la descongelación (p < 0.001). (ii) Superioridad funcional: las células conservadas con CPA mostraron un 23% más de formación de colonias de UFC-GEMM en comparación con TCPA, crítico para el injerto multilinaje51. (iii) Eficiencia clínica: El éxito del trasplante con 2,4 x 106 células CD34+/kg (en comparación con el estándar de la literatura ≥ 4 x 106) sugiere una mayor potencia. Esta tecnología es prometedora para: (i) Almacenamiento de HSC modificado genéticamente: la protección mitocondrial de CPA puede estabilizar las células editadas con CRISPR durante la criopreservación52. (ii) Banco de organoides: Los datos preliminares muestran una viabilidad del 89% en los organoides intestinales conservados con CPA frente al 54% en el TCPA (n=3). iii) Redes mundiales de distribución: un menor contenido de DMSO permite realizar ensayos de transporte a temperatura ambiente utilizando materiales de cambio de fase53.

Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Todos los autores declaran que la investigación se llevó a cabo en ausencia de cualquier relación comercial o financiera que pudiera interpretarse como un potencial conflicto de intereses.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este estudio fue apoyado por el Proyecto de Apoyo Financiero a la Construcción de la Disciplina Clave Médica del Distrito de Nanshan, el Proyecto Principal de Ciencia y Tecnología del Sistema de Salud del Distrito de Shenzhen Nanshan (No. NSZD2023018), y el Laboratorio Clave de Transformación Médica de Tecnología Nuclear del NHC (Hospital Central de Mianyang; Subvención No.2023HYX033).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
placa de cultivo celular de 35 mmLABSELECT12111
Acridina Naranja/PROPIDIUM IODIDECountstarGMS10139.10
Actin-Tracker Green-488 BeyotimeC1033
Alexa Fluor 488 (AF 488)BeyotimeA0423
Annexin V-FITCBD556420
Citómetro de imagen automático de sobremesaCountstarRigel-S2
Cell Preservation Solution XBBC-02Nanjing SSCELL Biotechnology Co., Ltd.
ColchicinaBeijing Biolab Technology Co., Ltd.BP0857
Microscopio de escaneo láser confocalZeissLSM880
Citochalasina BShanghai Jimi Biotechnology Co., Ltd.K0006
Kit de tinción DAPI BeijingBiolab Technology Co., Ltd.HR0453
DMSOPanreacapplichemA3672
FBSGibco10099-141
Citómetro de flujoBDFACSLSRFortessa
Glycerol   AMRESCO854
Albúmina humanaSenBeiJia Biological Technology Co., Ltd.SBJ-DB2044
Peróxido de hidrógenoSigma-AldrichH1009
Tampón de lavado de inmunotinciónBeijing Biolab Technology Co., Ltd.GL1124
Microscopio invertidoNikon CorporationECLIPSE Ti
Invitrogen Tubulin Tracker DeepRed Thermo Fisher ScientificT34077
MethoCult MedioTecnologías de células madre4531
PBSGibco10010023
Phalloidin-iFluor 488Xian Biolite Biotech Co., Ltd.23115
Solución salina fisiológicaBeijing Biolab Technology Co., Ltd.GL1735
Yoduro de propidioBDBDB556463
Rhodamine 123Sigma-AldrichR8004
RPMI1640Gibco11875093
Thermo Scientific Forma Steri-Cycle Incubadora de CO2Thermo Fisher Scientific371
Mezclador de vórticeNanjing Huchuan Electronic Co., Ltd.DMT-201ZT
YB020050 YB020100

Referencias

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