Este protocolo describe el xenoinjerto in ovo de células de leucemia linfoblástica aguda (LLA) B y T derivadas del paciente, que ocurre 4 días después de la inyección.
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Artículo de método
En Ovo Xenoinjerto de células de leucemia linfoblástica aguda (LLA) derivadas de pacientes (PDX-ALL)
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Resumen
Resumen
Este estudio presenta un método rápido, rentable y eficiente para el xenoinjerto in ovo de células de leucemia linfoblástica aguda (LLA) derivadas de pacientes, que abarca linajes de células B y células T. Usando embriones de pollo fertilizados, inyectamos células B-ALL y T-ALL derivadas del paciente en la vasculatura de los embriones 11 días después de la fertilización (11dpf). Sorprendentemente, cuatro días después de la inyección, las células leucémicas humanas injertadas exhibieron una supervivencia, proliferación y colonización vascular significativas dentro del embrión de pollo en desarrollo. A los 15dpf, detectamos un aumento notable en las células CD10 / CD19 + B-ALL y CD4 / CD8 + T-ALL en muestras de sangre de la vasculatura del embrión, lo que confirma un injerto exitoso. Este sistema facilita una evaluación eficiente y reproducible del comportamiento de las células leucémicas en un organismo vivo sin los costos considerables y las limitaciones éticas asociadas con otros modelos animales. Este enfoque rápido proporciona una plataforma in vivo de alto rendimiento y biológicamente relevante para evaluar posibles compuestos terapéuticos. El sistema de xenoinjerto derivado del paciente in ovo (PDX)-LLA presentado aquí ofrece una herramienta prometedora para la detección preclínica de fármacos, estudios mecanicistas y, potencialmente, para enfoques de medicina personalizada en la investigación de la leucemia.
Introducción
La membrana corioalantoidea (CAM) del pollito comienza a tomar forma en el día 7 después de la fertilización después de la incubación, y se completa en el día 12. La CAM es el centro de atención como un modelo in vivo adecuado para la angiogénesis1 y el injerto de células cancerosas 2,3,4,5,6,7,8,9,10, en particular las células cancerosas relacionadas con la sangre11, ya que es inherentemente inmunodeficiente y tiene una vascularización bien desarrollada. Además, la CAM también es un sistema deseable para investigar la invasión tumoral y la metástasis, ya que transporta una serie de proteínas de la matriz extracelular, que incluyen colágeno, integrina αVβ3, fibronectina, laminina y metaloproteinasa-2 de matriz (MMP-2)10.
La leucemia linfoblástica aguda (LLA) es un cáncer de la médula ósea y la sangre que se caracteriza por el rápido aumento de linfocitos B y T inmaduros. Es el cáncer pediátrico más extendido y la principal causa de muerte por cáncer entre los niños. La LLA es curable en >85% de los niños afectados, pero los adultos y los lactantes tienen tasas de curación considerablemente más bajas, y la LLA recidivante/refractaria tiene una supervivencia a 5 años de <10%12. Por lo tanto, se necesita urgentemente desarrollar nuevas estrategias de tratamiento para prevenir o detener la LLA recidivante o refractaria. Aunque se han desarrollado varios modelos de xenoinjertos, como ratón y rata13, estos métodos requieren mucho tiempo (por ejemplo, meses) y son costosos, y requieren regulaciones éticas integrales. Para abordar una necesidad clínica insatisfecha de una nueva terapia para la LLA, es imperativo desarrollar un modelo animal reproducible, rentable y rentable adecuado para extender el trabajo básico in vitro .
En este estudio, informamos el establecimiento exitoso de un protocolo de xenoinjerto in ovo que produce de manera confiable la colonización vascular 3D de las células B y T de la LLA del paciente, que se utiliza potencialmente para el diseño de una terapia novedosa que podría detener la progresión de la LLA y para el desarrollo de una herramienta predictiva para el resultado y los riesgos del tratamiento de la LLA.
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Protocolo
Los experimentos se realizaron con base en el protocolo aprobado por el Comité de Ética de la Universidad de Calgary (REB15-1143; donde se obtuvo el consentimiento informado de TODOS los sujetos) y la Junta de Ética de Investigación en Salud del Comité de Cáncer de Alberta (HREBA. CC-17-0108_REN8). Se incluyeron en el estudio pacientes con LLA en el momento del diagnóstico (antes de comenzar cualquier terapia), que tenían blastocitos circulantes (blastocitos no solo en la médula sino también en la sangre). Los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.
1. Incubación de huevos
- Adquirir huevos de gallina fertilizados. Obtenga ~ 10% más huevos de los necesarios para considerar la cantidad de huevos dañados durante el envío o el procedimiento de agrietamiento.
- Almacene los óvulos fertilizados hasta por dos semanas a 12 ° C sin perder viabilidad.
- Transfiera los huevos a una incubadora rodante humidificada (~50%-60%) a 39 °C.
- Incube los huevos en la incubadora por 10 dpf. Tenga en cuenta que el día 1 comienza cuando los huevos se transfieren a la incubadora.
2. Aislamiento de células de leucemia linfoblástica aguda a partir de muestras de sangre de pacientes con LLA
- Aísle las células como se describió anteriormente14,15.
- Recolecte 10 ml de sangre periférica (o médula) de pacientes con ALL B y T en tubos de ensayo heparinizados.
- Transfiera las muestras de sangre a un tubo de centrífuga estéril de 50 ml y diluya tres veces con 2 volúmenes de solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1x que contenga 137 mM de NaCl, 2,7 mM de KCl, 10 mM de Na2HPO4 y 1,8 mM de KH2PO4.
- Superponer 1 volumen de las muestras de sangre diluidas en 1 volumen de medio de gradiente de densidad y centrifugar a temperatura ambiente sin freno a 300 x g durante 30 min.
- Recoja la capa leucocitaria de células mononucleares (MNC) de la interfaz y transfiérala a un nuevo tubo estéril de 15 ml con una pipeta estéril.
- Añadir 10 ml de 1x PBS y centrifugar a 300 x g durante 5 min para eliminar los componentes restantes del suero (repetir este paso dos veces).
- Agregue 2 ml de NH4Cl al 0,8% al gránulo celular, agite suavemente, incube a temperatura ambiente durante 5 min y centrifugue a 300 x g durante 5 min para lisar los glóbulos rojos (si es necesario, repita este paso).
- Lave las células en 1x PBS como se describe en el paso 2.6.
- Vuelva a suspender las células en RPMI 1640 que contienen 10% de FBS y cuente el número de células con un hemocitómetro.
- Evalúe la viabilidad celular mediante el ensayo de exclusión de azul de tripano.
- Vuelva a suspender las células en el medio de congelación (10% de DMSO en FBS), congélelas a -80 °C y guárdelas en nitrógeno líquido.
3. Amplificación de lentivirus incompetentes para replicación de2ª generación que transportan mCherry
- Siembre HEK293T células renales embrionarias humanas a ~ 60% -70% de confluencia en una placa de 6 pocillos que contenga DMEM suplementada con 10% de FBS y 1% de penicilina-estreptomicina a 37 ° C en una incubadora humidificada con 5% de CO2.
- Cotransfecte las células (1,5 x 106) con transferencia FUW-Luc-mCherry-puro, empaquetado pCMVΔr8,91 y vectores de envoltura pVSV-G en una proporción de 3:2:1 utilizando Lipofectamine 3000 durante 2 días.
- Coseche el sobrenadante que contiene lentivirus y filtre a través de un filtro de 0,45 μm.
- Transfiera el sobrenadante viral aclarado a tubos de centrífuga, centrifugue a 20.000 x g durante 2 h a 4 °C, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el sedimento en 100 μL de PBS o medio sin suero.
- Mida la multiplicidad de infecciones (MOI) utilizando el kit de título de lentivirus qPCR.
4. Etiquetado de líneas celulares de ALL en continuo crecimiento y células de ALL derivadas de pacientes con mCherry
- Placa1 x 106 células/ml de líneas celulares B-(SEM) y T-ALL (MOLT3)16,17 y células B o T-ALL derivadas de pacientes en placas de 6 pocillos que contienen RPMI 1640 + 10% de FBS.
- Infectar las células con 300 μL de preparación lentiviral con un título viral de 3,47 x 106 UI/mL para obtener MOI de 1 para 1 x 106 células, mezclar suavemente e incubar a 37 °C con 5% de CO2 durante 2 días.
- Agregue 1 μg/ml de puromicina al medio de cultivo para seleccionar células transducidas de manera estable durante 2 días.
- Visualice las células marcadas con mCherry con un microscopio de fluorescencia.
5. Injerto de xeno in ovo
- El día 10 (ver arriba la sección de incubación de huevos), examine la vasculatura de los embriones de pollo bajo la luz para evaluar la viabilidad del embrión. Luego, lave los huevos suavemente con etanol al 70% para esterilizar la superficie.
- Taladre la celda de aire de los huevos para crear una ventana pequeña (~ 2,0 cm de diámetro) con un taladro manual.
- Selle con cinta adhesiva transparente y vuelva a una incubadora deCO2 al 5%.
- El día 11, inyecte 1 x 10células ALL marcadas con 7 mCherry en los vasos sanguíneos de los embriones en desarrollo con agujas de 34 G. Tenga en cuenta que resultó difícil confirmar si las células de ALL se inyectaron en lugares idénticos en diferentes embriones porque no se garantiza abrir la ventana en los mismos lugares.
- Selle las ventanas con cinta adhesiva transparente, vuelva a la incubadora deCO2 al 5% y controle la viabilidad del embrión diariamente.
- El día 15, disecciona los vasos sanguíneos de los embriones, colócalos en portaobjetos de vidrio y fotografía xenoinjertos exitosos con un microscopio de disección equipado con capacidades de fluorescencia.
NOTA: Más allá de 15dpf (ya que las plumas cubren todo el cuerpo y la albúmina casi ha desaparecido), es necesario realizar inmunohistoquímica para evaluar los cambios en la proliferación y colonización de las células de la LLA en la vasculatura del embrión de pollo.
6. Citometría de flujo
- El día 15, recoger sangre de la vasculatura embrionaria de pollo con una jeringa estéril con una aguja de 32 G, transferirla a un tubo estéril de 1,5 ml que contenga heparina y centrifugar a 226 x g durante 10 min a 4 °C.
- Retire el sobrenadante (plasma) y vuelva a suspender el sedimento celular en 1x PBS que contenga BSA al 1% (albúmina sérica bovina).
- Realice los pasos 2.7 y 2.8 para lisar los glóbulos rojos.
- Marcar las células B-ALL con anticuerpos FITC-CD10 humanos y PE-CD19 humanos, y las células T-ALL con anticuerpos FITC-CD4 humanos y PE-CD8 humanos, respectivamente, a 4 °C en la oscuridad durante 30 min.
- Lavar las células marcadas dos veces con PBS que contenga BSA al 1%, centrifugar a 226 x g durante 5 min a 4 °C, resuspender en 1x PBS y analizar por citometría de flujo.
- Establezca los voltajes de dispersión directa (FSC) y dispersión lateral (SSC) en 400 V y 360 V, respectivamente. Ajuste las ganancias del detector para los canales FITC y PE a 450-500 V y 400-450 V, respectivamente.
NOTA: Estrategia de compuerta: (a) compuerta de dispersión de luz (FSC vs. SSC): use FSC-A vs. SSC-A para identificar una población con dispersión directa intermedia (tamaño) y dispersión lateral baja (granularidad), que corresponde a la región del linfoblasto. Tenga en cuenta que este paso ayuda a excluir desechos y células más granulares, como monocitos o granulocitos; b) selección de singletes (FSC-H vs. FSC-A): realizar la discriminación de dobletes mediante la activación de FSC-H vs. FSC-A, asegurando que solo se analicen eventos unicelulares18. - Cuantifique las células CD10/CD19+ B-ALL y CD4/CD8+ T-ALL mediante el recuento de eventos en el cuadrante 2 (Q2; FITC/PE+) de FITC vs. Parcelas de PE18. El presente significa ± SEM de tres experimentos independientes (n = 3).
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Resultados
Para determinar si el injerto de células ALL humanas en embriones de pollo en desarrollo fue exitoso, se amplificaron lentivirus incompetentes para la replicación de2ª generación que transportaban mCherry y se utilizaron para marcar líneas celulares B- y T-ALL, SEM y MOLT316,17, respectivamente. Como se muestra en la Figura 1A, ~ 50% de las células B (dos paneles superiores izquierdos) y T (dos paneles superiores derechos)...
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Discusión
Se identificaron tres pasos críticos durante el xenoinjertoin ovo para prevenir la contaminación microbiana y maximizar la supervivencia de los embriones de pollo: es decir, (1) esterilizar la superficie de la cáscara del huevo con etanol al 70% antes de hacer la ventana y (2) sellar herméticamente la ventana de la cáscara del huevo con cinta adhesiva para evitar la evaporación del contenido del embrión de pollo durante la incubación, y (3) el uso de la aguja fina (p. ej., 34 G...
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.
Agradecimientos
Agradecemos al Dr. Andrew Kung de la Universidad de Columbia por proporcionar FUW-Luc-mCherry-puro. Este trabajo fue apoyado por subvenciones del CIHR (PJT-174983) a KYL y de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF; RS-2023-00284121) a KYL y M-YJ.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Agujas de 34 g | BD Perisafe | ||
| Citómetro de flujo Attune NxT | Termo Fisher | ||
| Jeringa BD Perisafe (32 G) | BD Perisafe | ||
| Albúmina de suero bovino (BSA) | Millipore Sigma | Referencia A9647 | |
| Medio de congelación celular | Gibco, ThermoFisher Scientific | 12648010 | |
| Centrífuga (Centrífuga Allegra X-22R) | Beckman Coulter | ||
| Guantes desechables | Guantes de examen de nitrilo Royal Touch300 | ||
| Microscopio de disección | Leica MZ16FA | ||
| DMEM | Gibco, ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
| DMSO | Invitrogen, ThermoFisher Scientific | D12345 | |
| Incubadora de huevos, Incubadora rodante Vevitts 120 | Vixest Trading Co. | ||
| Alcohol etílico (95%) | VWR Internacional | BDH1158-4LP | |
| Suero fetal bovino (FBS) | Gibco, ThermoFisher Scientific | 26140079 | |
| Solución de Ficoll (Ficoll?? Paque Plus) | MilliporeSigma | GE17-1440-02 | |
| Anticuerpo FITC-CD10 | Santa Cruz Biotech | sc-46656 FITC | |
| Anticuerpo FITC-CD4 | Santa Cruz Biotech | sc-19641 FITC | |
| Microscopio de fluorescencia | Leica Microsystems | ||
| Taladro manual (Dremel3000) | Bosch | ||
| HEK293T | ATCC, VA, ESTADOS UNIDOS | CRL-3216 | |
| Hemocitómetro | VWR internacional, Hausser Scientific | 15170-263 | |
| Sal de heparina sódica de la mucosa intestinal porcina | Millipore Sigma | H3149 | |
| Tubos de ensayo heparinizados | BD Vacutainer | BD 366480 | |
| Lipofectamina 3000 | Invitrogen, ThermoFisher Scientific | L3000008 | |
| Kit de títulos de lentivirus multiplex (kit de títulos de lentivirus qPCR) | Abm | LV900 | |
| NH4Cl (chloride_ de amonio | Millipore Sigma | Referencia A9434 | |
| Microscopio invertido Olympus IX71 | Olimpo | ||
| Anticuerpo PE-CD19 | Santa Cruz Biotech | sc-19650 PE | |
| Anticuerpo PE-CD8 | Santa Cruz Biotech | sc-1177 PE | |
| Penicilina-estreptomicina (10,000 U/mL) | Gibco, ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| Solución salina tamponada con fosfato (PBS) | Sigma | P3813 | |
| Pipetas (volumen ajustable) | Eppendorf | ||
| Puromicina | Gibco, ThermoFisher Scientific | A1113803 | |
| RPMI 1640 | Gibco, ThermoFisher Scientific | 11875093 | |
| Cinta adhesiva | 3M | ||
| Placas estériles de 6 pocillos | VWR internacional, Corning | 22250-140 | |
| Tubos de centrífuga estériles | Axygen Inc, Corning | AXYMCT-150-C-S | |
| Matraces de cultivo estériles (75T) | VWR Internacional | 10062-872 | |
| Tubos estériles Falcon (15 ml) | SARSTEDT | 62.554.502 | |
| Tubos estériles Falcon (50 ml) | SARSTEDT | 62.547.254 | |
| Filtro estéril (0,45 µ m) | VWR Internacional | 76778-974 | |
| Pinzas estériles | VWR Internacional | 82027-404 | |
| Portaobjetos de vidrio estériles | VWR internacional | 48300-031 | |
| Puntas de pipeta estériles | VWR Internacional | 76322-136, 76322-134, 76322-154 | |
| Jeringas estériles | Jeringa BD | 309628? | |
| Azul de tripano | Invitrogen, ThermoFisher Scientific | T10282 |
Referencias
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Reimpresiones y permisos
