Cambios dinámicos en la función pulmonar y el flujo sanguíneo durante la progresión del adenocarcinoma de pulmón en ratones mediante pletismografía de cuerpo entero y ecografía Doppler

Resumen

Este protocolo utiliza la función pulmonar del ratón y la ecografía Doppler como técnicas de investigación, ofreciendo un método no invasivo, sencillo y eficiente para el estudio del adenocarcinoma de pulmón.

Resumen

El adenocarcinoma de pulmón (LUAD) es un tumor pulmonar maligno frecuente, y su progresión conduce a alteraciones en la ventilación y el flujo sanguíneo, lo que pone de manifiesto las características funcionales distintivas del pulmón en condiciones patológicas. El sistema no invasivo de pletismografía de cuerpo entero (WBP) permite la monitorización en tiempo real de la función pulmonar y la capacidad de respuesta de las vías respiratorias en ratones despiertos, evitando la interferencia de la traqueotomía y la anestesia. El ultrasonido Doppler (DU) de animales pequeños, que utiliza tecnología de imágenes de alta frecuencia, captura de manera no invasiva las estructuras microvasculares y los cambios en la velocidad del flujo sanguíneo pulmonar, lo que ofrece un apoyo crucial para investigar las anomalías de ventilación y perfusión asociadas con LUAD. En este estudio, se estableció un modelo LUAD en ratones A/J utilizando 100 mg/kg de 4-(metilnitrosamino)-1-(3-piridil)-1-butanona (NNK). La WBP combinada con DU se empleó para monitorizar la función pulmonar y los parámetros hemodinámicos en ratones. Los resultados revelaron una disminución significativa (p < 0,05) en las métricas clave, incluido el flujo espiratorio del 50% (EF50), la ventilación por minuto (VM), el flujo espiratorio máximo (PEF), el flujo inspiratorio máximo (PIF), la pausa mejorada (Penh) y el volumen corriente (TV), así como una marcada reducción en la velocidad del flujo sanguíneo arterial pulmonar (p < 0,05) en el grupo modelo durante la progresión tumoral. Este enfoque combinado captura eficazmente las alteraciones funcionales que se producen durante el desarrollo patológico de LUAD en ratones, proporcionando un método no invasivo y eficiente para avanzar en la investigación de las enfermedades respiratorias.

Introducción

El adenocarcinoma de pulmón (LUAD) es el subtipo más común de cáncer de pulmón de células no pequeñas¹. Con el aumento de la contaminación ambiental, el consumo de tabaco y el envejecimiento de la población, la prevalencia mundial de LUAD ha aumentado anualmente ^2,3,4. Los estudios actuales indican que los pacientes experimentan disminuciones progresivas de la función pulmonar y alteraciones hemodinámicas a medida que avanza la LUAD 5,6,7,8. El desarrollo de métodos no invasivos, eficientes y rentables para rastrear y evaluar la función pulmonar y las fluctuaciones del flujo sanguíneo de la arteria pulmonar puede proporcionar evidencia crítica para el tratamiento clínico de la LUAD.

Las investigaciones existentes demuestran que el crecimiento tumoral de LUAD obstruye progresivamente las vías respiratorias, reduce la capacidad pulmonar y la ventilación⁹, y desencadena la secreción de citocinas inflamatorias que exacerban la estenosis de las vías respiratorias a través de la inflamación crónica localizada¹⁰. En consecuencia, la disminución de la función pulmonar conduce a un agravamiento de la hipoxia y a alteraciones del flujo sanguíneo^11,12. Estos cambios patológicos a menudo se manifiestan clínicamente como disnea progresiva y opresión torácica. Si bien las imágenes de TC no logran capturar en tiempo real las anomalías de los parámetros de la función pulmonar o las alteraciones hemodinámicas inducidas por la progresión de la LUAD, las tomografías computarizadas repetidas a corto plazo también aumentan la exposición a la radiación¹³. Por el contrario, la pletismografía de cuerpo entero (WBP) y la flujometría de ultrasonido Doppler sirven como enfoques complementarios no invasivos, fáciles de usar y reproducibles para el monitoreo dinámico. La integración de estas técnicas para monitorizar la función pulmonar y la hemodinámica podría mejorar la progresión de la enfermedad, la evaluación y la toma de decisiones terapéuticas.

En este estudio, utilizamos 4-(metilnitrosamino)-1-(3-piridil)-1-butanona (NNK) en ratones A/J para modelar el inicio y la progresión de LUAD. La función pulmonar y los cambios hemodinámicos se monitorizaron longitudinalmente mediante WBP y ecografía Doppler (UD) en las semanas 4, 10 y 20. Este enfoque tiene como objetivo proporcionar nuevos conocimientos sobre la fisiopatología y las estrategias terapéuticas de LUAD.

Protocolo

Todos los experimentos con animales descritos en este estudio fueron aprobados por el Comité de Ética sobre Bienestar Animal de la Universidad de Medicina Tradicional China de Chengdu y se llevaron a cabo de conformidad con las leyes y normas pertinentes para la ética de la investigación con animales (20240616IV). Las hembras endogámicas A/JGpt (7-8 semanas de edad) se mantuvieron a 20-24 °C y una humedad relativa de 40%-70%. A lo largo del ciclo de luz-oscuridad de 12 horas, los ratones recibieron alimento animal estándar y agua purificada. Los animales se aclimataron a este ambiente 7 días antes de comenzar los experimentos.

1. Creación y preparación del modelo animal

1. Disolver NNK en solución salina normal para preparar una solución madre con una concentración de 10 mg/mL.
2. Mida la función pulmonar usando WBP en las semanas 4 (día 28 después del modelado), 10 (día 70 después del modelado) y 20 (día 140 después del modelado). La velocidad del flujo sanguíneo arterial pulmonar se midió mediante uranio empobrecido en la semana 20 (día 140 después del modelado). Antes de cada medición, coloque a los ratones en un entorno adecuado para minimizar el estrés.

2. Pruebas de función pulmonar no invasivas

NOTA: El sistema WBP mide la función respiratoria en animales despiertos que se mueven libremente utilizando una cámara de medición especialmente diseñada. La cámara está equipada con pantallas neumotach, que permiten el paso del aire dentro y fuera de la cámara. La resistencia del aire creada por las pantallas neumotach provoca pequeños cambios de presión en la cámara en relación con el aire ambiente. Se conecta un transductor de presión sensible para medir estos cambios de presión dentro de la cámara, a partir del cual se puede derivar el flujo (llamado flujo de caja). El software proporciona parámetros respiratorios como el flujo y el volumen, junto con informes en tiempo real.

1. Obtenga los siguientes componentes principales: controlador WBP, transformador de potencia del controlador, barra de consola, cable de barra de consola largo y cable de barra de consola corto, columna del calibrador, pletismógrafo WBP, transductor de flujo, sonda de temperatura y humedad, cabezal del nebulizador (púrpura), filtro de flujo de polarización y tubería, PC.
2. Ensamble el hardware como se describe a continuación.
   1. Realice la conexión del panel trasero como se describe a continuación.
      1. Conecte la unidad controladora al ordenador mediante un cable USB 2.0 y asegúrese de que la conexión sea estable.
      2. Llene la columna con agua del grifo hasta la línea de llenado de agua, conéctela al puerto en la parte posterior del controlador y asegúrese de que la línea esté seca.
      3. Enchufe el transformador de potencia en la parte posterior del controlador, asegurándose de que esté bien conectado.
      4. Dependiendo de dónde se coloque la tira de consola, elija un cable de tira de consola largo o corto para conectarlo a la parte posterior del controlador.
      5. Empuje la unidad controladora en su lugar y organice la columna de calibración y el transformador de potencia.
   2. Realice la conexión del panel frontal como se describe a continuación.
      1. Conecte cada sensor de flujo en el puerto etiquetado como Sensor. Conecte cada filtro de flujo de polarización y tubería en el puerto del controlador etiquetado como Bias Flow en el panel frontal. Conecte una resistencia de aislamiento de flujo de polarización al extremo abierto del tubo de flujo de polarización.
   3. Realice la conexión de la cámara como se describe a continuación
      1. Coloque la cámara frente a la unidad controladora, asegurándose de que esté colocada sobre una superficie sólida y estable que esté libre de vibraciones.
      2. Conecte el sensor de flujo a la cámara y oriente el sensor de modo que el signo DSI quede hacia arriba.
      3. Conecte el tubo de flujo de polarización (con resistencia de aislamiento) al puerto inferior del pletismógrafo.
      4. Retire el tapón en la parte superior del pletismógrafo y reemplácelo con un cabezal nebulizador (morado).
3. Configure el software como se describe a continuación.
   1. Inicie el software del programa de control e inicie sesión. En la página de inicio del controlador, haga clic en Configuración de hardware. Inicie el asistente de configuración haciendo clic en Nueva configuración, luego seleccione WBP (número de serie: DEMO-061) y haga clic en Siguiente.
   2. En el menú desplegable Especie, seleccione Mouse. Establezca el caudal en los valores predeterminados. Seleccione 4 sitios (cada sitio corresponde a una cámara, con un máximo de 4 cámaras por sesión). Asegúrese de que el caudal de polarización para todos los sitios activos sea coherente. Haga coincidir los sitios del software con los puertos reales del controlador WBP. Por último, haga clic en Finalizar para completar la configuración.
4. Recogida de datos
   1. Abra el programa principal y calibre las cámaras, ya que este paso es crítico. Pase el ratón por encima del hardware para mostrar un icono de herramienta amarillo. Haga clic en el icono para acceder a la interfaz de calibración y, a continuación, haga clic en Todos para calibrar las cámaras de los cuatro animales simultáneamente.
   2. Cree el protocolo de estudio requerido seleccionando el Estudio de dosis-respuesta en Crear opciones de estudio. Establezca la configuración de GLP para que no siga GLP.
   3. Para configurar los parámetros de medición y las secuencias de tareas, haga clic en Nuevo parámetro para abrir el Generador de parámetros y agregar los parámetros que se van a medir. Utilice la configuración predeterminada para la secuencia de tareas.
   4. Para iniciar la recopilación de datos, vaya a la página Mi laboratorio en la estación de trabajo y, a continuación, arrastre y suelte el protocolo de estudio preparado en WBP para ratón.
   5. Haga clic en el botón del triángulo rojo de cada sitio para comenzar la adquisición de datos. Para iniciar los cuatro sitios simultáneamente, haga clic en Sesión > Confirmar todos los sitios. Después de iniciar la adquisición, la estación de trabajo abrirá la página Configurar adquisición y la utilizará para editar la información de cada mouse en los sitios de adquisición.
   6. Haga clic secuencialmente en Sesión > Confirmar todos los sitios para comenzar la recopilación de datos. Para asegurarse de que los resultados experimentales son verdaderos y fiables, estabilice los ratones experimentales en una habitación tranquila durante 30 minutos antes.
   7. Coloque los ratones silenciosos en el frasco de prueba completamente sellado. Haga clic en la opción Iniciar en el sistema para recopilar datos. El sistema recopila datos cada 2 s, por lo que recopila al menos 10 minutos. Intercepta 4 minutos de datos en el medio. Aquí, se probaron cinco animales en cada grupo, y la prueba se repitió 3 veces.
   8. Haga clic en Crear informe en la página Estudio y seleccione el tipo de informe. Guarde los datos experimentales en formato de hoja de cálculo. En este experimento, se utilizaron la tasa de flujo espiratorio máximo (PEF), la tasa de flujo inspiratorio máximo (PIF), la pausa mejorada (Penh) y el volumen corriente (TV) para evaluar la función pulmonar de los ratones.

3. Medición de la velocidad del flujo sanguíneo arterial pulmonar

1. Preparación animal
   1. Colocar el ratón en una cámara de inducción de anestesia y anestesiarlo con isoflurano al 5% (caudal: 1 L/min). Asegure el ratón en una plataforma de manipulación de animales, manteniendo la temperatura de la plataforma a 35-37 °C para preservar la temperatura corporal.
   2. Coloque la boca y la nariz del ratón dentro de una máscara de anestesia. Mantener la anestesia con isoflurano al 1%-2% (caudal: 0,6-1 L/min). Cuando el ratón mantiene una posición supina estable con frecuencia cardíaca estable y ritmo respiratorio regular, relajación muscular completa, ausencia de movimiento de las extremidades, ausencia de respuesta de espasmos de las vibrisas, desaparición del reflejo de retirada del pedal, membranas mucosas rosadas y ausencia de dilatación pupilar, se considera que ha alcanzado una profundidad de anestesia adecuada.
   3. En esta etapa, aplique 2-3 mg de ungüento veterinario en el saco conjuntival inferior con un hisopo de algodón estéril. Acaricie suavemente los párpados superior e inferior para promover el cierre sin comprimir el globo ocular, asegurando una distribución uniforme del ungüento a través de la superficie de la córnea.
2. Preparación del área de imágenes
   1. Elimine el vello del pecho con una crema depilatoria y un dispositivo depilatorio. Limpie el área tratada con una gasa húmeda o un pañuelo húmedo, luego aplique el agente de acoplamiento precalentado a 37 ° C de manera uniforme con un hisopo de algodón para lograr un grosor uniforme de 0,3 mm, asegurando la ausencia de burbujas de aire visibles.
3. Ecografía Doppler
   1. Utilice una sonda de ultrasonido Doppler de 40 MHz para medir la velocidad del flujo sanguíneo arterial pulmonar desde la vista del eje largo paraesternal. Incline la sonda 45° hacia la izquierda y la mesa de operaciones 15° hacia la derecha. Baje la sonda desde el lado derecho del tórax y ajuste los ejes X e Y para localizar el ventrículo derecho y la arteria pulmonar, guiándose por sus relaciones anatómicas espaciales, características morfológicas y dirección del flujo hemodinámico.
   2. Presione el botón CF para cambiar al modo Doppler. Visualice la señal azul de flujo sanguíneo arterial pulmonar. Coloque la línea de muestreo en la arteria pulmonar y presione el botón PW para mostrar el espectro de flujo sanguíneo arterial pulmonar.
   3. Presione el botón Congelar para congelar la imagen, luego presione el botón Medir y seleccione la opción Velocidad en la pantalla táctil. Coloque la línea de medición en el pico del espectro para obtener la velocidad máxima del flujo sanguíneo arterial pulmonar.
4. Adquisición de datos
   1. Utilice el software de análisis fuera de línea para seleccionar los datos de Doppler pulsado arterial pulmonar. Acceda al paquete de medición del paquete cardíaco, seleccione la función RV y PV, y genere la velocidad del flujo sanguíneo arterial pulmonar y las imágenes guardadas.

4. Análisis de datos

1. Utilice R4.4.2 y GraphPad Prism 9.5.1 para el análisis de datos y trace los datos. Las comparaciones intergrupales de los datos de función pulmonar se realizaron mediante la prueba t de muestras independientes, mientras que las comparaciones intragrupales utilizaron ANOVA de medidas repetidas. Las comparaciones de la velocidad del flujo sanguíneo arterial pulmonar entre los grupos se analizaron con la prueba t de muestras independientes, con significación estadística establecida en p < 0,05.

Resultados

Para validar la factibilidad, precisión y reproducibilidad de la metodología de evaluación de la función pulmonar y el flujo sanguíneo arterial pulmonar, trazamos las curvas medias minuto a minuto de PIF, PEF y flujo espiratorio al 50% de la capacidad vital (EF50, 10x aumentado) durante el período de seguimiento de la 4ª semana en el grupo en blanco (Figura 1A). Como se muestra en este panel, las tres curvas correspondientes exhiben un alto grado de conformidad en la forma. A pesar de los ca...

Discusión

En este estudio, se seleccionó NNK combinado con ratones A/J para crear un modelo de adenocarcinoma de pulmón según informes anteriores. Estudios relevantes han demostrado que NNK combinado con ratones A/J puede comenzar a tener una formación tumoral mínima en la^10ª semana, y una formación tumoral estable en la 16ª a la ^20ª semana^18,19. Por lo tanto, seleccionamos la prueba a la^4ª seman...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Ratones A/J	GemPharmatech LLC.
tubos de EDTA de 0,5 ml	Labshark
1-butanona,4-(metilnitrosoamino)-1-(3-piridinil)	Gu Shi Gong Yuan Medical Equipment Co.
75% etanol	ChengDu Chron Chemicals Co,. Ltd	2023052901
cámara de inducción de anestesia	Shanghai Tawans Intelligent Technology Co., Ltd.	MZ-MR
Crema depilatoria	Shanghai Yuyan Instruments Co., Ltd.
Dispositivo depilatorio	Shanghai Yuyan Instruments Co., Ltd.	3180
Isoflurano	Shanghai Duma Biotechnology Co., Ltd.	DM-M9462
Cinta médica	Beijing Lanbokangs Technology Co., Ltd.	19-5023
tricorder médico	MedChemexpress	69652
PBS solución tampón	Shanghai Fusheng Co., Ltd.	A-RY5256
solución salina (medicina)	Beijing Biolabs Technology Co.	GL1736‌
Agente de acoplamiento de ultrasonido	Qisheng (Shanghai) Medical Equipment Co., Ltd.