Este protocolo tiene como objetivo probar si el amarillo de hidroxisafflor A (HSYA) atenúa la neurotoxicidad inducida por LPS en el pez cebra. La función motora se evaluó mediante un sistema de visión visual. La lesión del nervio dopaminérgico se examinó mediante inmunohistoquímica. Las moléculas implicadas en la vía TLR4/NF-κB se analizaron mediante Western blot.
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Artículo de investigación
El amarillo de hidroxisafflor A atenúa la toxicidad inducida por LPS en las neuronas dopaminérgicas del pez cebra mediante la regulación de la vía de señalización TLR4/NF-ĸB
En este artículo
Resumen
Resumen
La inflamación inducida por lipopolisacáridos (LPS) desempeña un papel crucial en el desencadenamiento y la perpetuación de las enfermedades neurodegenerativas, incluida la enfermedad de Parkinson (EP). El amarillo de hidroxisafflor A (HSYA) es el componente principal de Carthamus tinctorius L. Este estudio tiene como objetivo observar si HSYA podría mejorar la toxicidad inducida por LPS en las neuronas dopaminérgicas del pez cebra. Los peces cebra fueron expuestos a LPS y luego tratados con HSYA. Se realizaron pruebas de comportamiento para evaluar la función motora del pez cebra. Se examinó la lesión neuronal dopaminérgica y el nivel de dopamina. También se midieron TLR4, NF-κB, IL-1β y TNF-α. Demostró que el LPS (60 μg/mL, concentración final) inducía toxicidad en el pez cebra y causaba disfunción motora y daño a las neuronas tirosina hidroxilasa (TH) positivas. La exposición a LPS no solo disminuyó el contenido de dopamina, sino que también aumentó los niveles de IL-1β, TNF-α y la expresión de TLR4 y NF-κB. La HSYA mejoró la disfunción motora inducida por el LPS. Además, HSYA atenuó la pérdida de neuronas TH-positivas, que se acompañó de un aumento en el contenido de dopamina. El tratamiento con HSYA también inhibió la expresión de TLR4, NF-κB y la producción de IL-1β, TNF-α. En conclusión, este estudio demuestra que HSYA atenúa la lesión inducida por la inflamación en las neuronas dopaminérgicas del pez cebra mediante la regulación de la vía TLR4/NF-κB, que proporciona una base experimental para la prevención de la lesión inflamatoria en la EP.
Introducción
La patogenia de la enfermedad de Parkinson (EP) es el deterioro de la actividad motora debido a la lesión de las neuronas dopaminérgicas en el cerebro. Las manifestaciones de la EP incluyen disfunción motora, incluyendo temblor en reposo, bradicinesia, inestabilidad postural y tono muscular. Los niveles de citocinas en el líquido cefalorraquídeo y en las regiones cerebrales nigrostriatales post-mortem de los individuos con EP están elevados en comparación con los controles sanos de la misma edad1. Los mecanismos por los cuales la lesión neuronal dopaminérgica es causada por la inflamación han sido bien establecidos. En la EP, las neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo son sensibles a citocinas como el factor de necrosis tumoral (TNF)-ɑ 2. El lipopolisacárido (LPS) es un componente de las bacterias. El LPS se identifica como un ligando del receptor tipo Toll 4 (TLR-4). Una vez que se une a TLR-4, el LPS conduce a una respuesta inflamatoria y muestra toxicidad para el tejido. TLR-4 se localiza en la microglía del sistema nervioso central. El LPS activa el TLR-4 y, por lo tanto, produce TNF-α e IL-1β. La exposición central o periférica al LPS inducirá toxicidad para el sistema nervioso central. Existen pruebas que demuestran que la toxicidad inducida por LPS desempeña un papel en el desencadenamiento y la perpetuación de las enfermedades neurodegenerativas, incluida la EP 3,4,5.
Recientemente, el pez cebra se ha utilizado comúnmente como modelo para estudiar las enfermedades del sistema nervioso. El pez cebra y los humanos tienen un 80% de homología genética. Y el pez cebra tiene casi el mismo número de cromosomas que los humanos. Además, la estructura principal del cerebro del pez cebra y sus vías de señalización son similares a las de los mamíferos. El pez cebra también puede producir un gran número de embriones transparentes, desarrollarse rápidamente y es propenso a la manipulación genética. Estas ventajas hacen del pez cebra un excelente modelo para investigar la patogénesis de la EP y desarrollar el cribado de fármacos de alto rendimiento en la EP.
El amarillo de hidroxisafflor A (HSYA) es un ingrediente principal de Carthamus tinctorius L. Estudios anteriores han demostrado que el HSYA tiene propiedades antiinflamatorias. En cultivos mesencefálicos primarios, el HSYA de 20 μM a 640 μM no mostró ninguna toxicidad. Y la concentración de HSYA, que osciló entre 40 μM y 640 μM, redujo el daño neuronal dopaminérgico inducido por LPS7. Los ratones C57BL/6J fueron expuestos a la 6-hidroxidopamina para inducir un modelo de EP. HSYA no solo atenúa la función neurológica deteriorada, sino que también protege las neuronas dopaminérgicas en el cerebro. Además, HSYA redujo la expresión de ciclooxigenasa-2, óxido nítrico sintasa inducible y NF-κB en la sustancia negra8.
Hasta la fecha, no hay informes que demuestren la propiedad de HSYA para reducir la toxicidad del LPS in vivo. Demostró que HSYA atenuó la toxicidad inducida por LPS in vitro7. Sin embargo, la evaluación basada en células no representa todos los pasos del complejo proceso de neurotoxicidad. El pez cebra resulta particularmente valioso para desentrañar el mecanismo de toxicidad. En los últimos años, también se ha demostrado que HSYA es capaz de inhibir la activación de la vía inflamatoria NF-κB al disminuir la expresión de la proteína quinasa B, mejorando así la respuesta inflamatoria, y que HSYA también inhibe la vía de señalización inflamatoria asociada a la proteína activadora 1, que afecta a la proliferación celular y a la lesión inflamatoria inducida por el factor de necrosis tumoral α9, 10. Este estudio tiene como objetivo investigar si HYSA puede mejorar la toxicidad inducida por LPS en las neuronas dopaminérgicas del pez cebra.
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Protocolo
Los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con las Directrices de los Institutos Nacionales de Salud para el Uso de Animales de Laboratorio (Publicación 86-23, revisada en 1986). Y este estudio fue aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Yantai (YTDX20220623). Los reactivos y el equipo utilizado en este estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.
1. Mantenimiento del pez cebra
El pez cebra de la cepa AB (Danio rerio) se mantuvo en un sistema de recirculación de agua a una temperatura del agua de 27-28,5 °C (pH 7,0), en un ciclo de luz/oscuridad de 14/10 h. El pez cebra fue alimentado dos veces al día con camarones. Después del apareamiento natural, los embriones fertilizados se recolectaron en placas de Petri que contenían medio E3 con agua desionizada, KCl, NaCl, MgSO4·7H2O y CaCl2.
2. Toxicidad inducida por LPS en el pez cebra
Los embriones de pez cebra a las 24 h después de la fertilización (hpf) se recolectaron y se asignaron a los grupos control y LPS, con 60 embriones en cada grupo. El polvo de LPS se pesó y se añadió a una cierta cantidad de solución de PBS (pH = 7,4) para su disolución, preparada como una solución madre de LPS de 2 mg/mL, colocada a -20 °C para su almacenamiento y reserva. Durante el experimento, la solución de reserva de LPS se diluyó a 30 μg/mL, 60 μg/mL y 90 μg/mL de solución de LPS. Se añadió una solución de LPS a una concentración final de 30 μg/mL, 60 μg/mL o 90 μg/mL a las placas de Petri que contenían 24 embriones de pez cebra hpf; el volumen de solución para cada pozo experimental fue de 3 mL. En el grupo control, los embriones de pez cebra se cultivaron en medio E3 sin LPS. Las placas de Petri se colocaron en una cámara de incubación a temperatura constante a 28 °C. La exposición al LPS se repitió siguiendo el mismo procedimiento mencionado anteriormente durante cinco días consecutivos.
3. Efecto del inhibidor de TLR4 sobre la toxicidad inducida por LPS en pez cebra
Los embriones de pez cebra a 24 hpf se asignaron a los grupos control, LPS y TAK-242. Se han realizado varios estudios para validar el efecto regulador de TAK-242 a una concentración final de 1 μM sobre la regulación de la vía de señalización de TLR4, entre los cuales algunos estudios han demostrado que TAK-242, al inhibir la proliferación celular inducida por LPS y la liberación de factores inflamatorios, proporciona una nueva forma de resolver los problemas relacionados con la reducción del glaucoma en el postoperatorio11. En el grupo TAK-242, se añadió TAK-242 (1 μM, concentración final) a una placa de Petri que contenía 24 embriones de pez cebra hpf; el volumen de solución para cada pozo experimental fue de 3 mL. Después de 30 min, se añadió LPS (60 μg/mL, concentración final) para inducir toxicidad, y las concentraciones de LPS no causaron mortalidad del pez cebra. Los embriones del grupo control se mantuvieron solo en medio E3. Las placas de Petri se colocaron en una cámara de incubación a temperatura constante a 28 °C. El procedimiento anterior se repitió durante cinco días consecutivos.
4. Efecto de HSYA en la toxicidad inducida por LPS en pez cebra
Los embriones de pez cebra a 24 hpf se asignaron a los grupos control, LPS y HSYA. Se añadió HSYA a una concentración final de 20 μM, 40 μM u 80 μM a las placas de Petri que contenían 24 embriones de pez cebra hpf; el volumen de solución para cada pozo experimental fue de 3 mL. Después de 30 min, se añadió LPS (60 μg/mL, concentración final). Los embriones del grupo control se mantuvieron solo en medio E3. Las placas de Petri se colocaron en una cámara de incubación a temperatura constante a 28 °C. El procedimiento anterior se repitió durante cinco días consecutivos.
5. Evaluación conductual
El pez cebra se transfirió a los 60 pocillos del medio de una placa de 96 pocillos, con una larva de pez cebra por pocillo. Se añadió medio de cultivo E3 (250 μL) a cada pocillo para permitir la natación libre. La actividad locomotora se registró mediante un sistema de visión. Se añadió agua pura a la caja oscura (30 cm × 40 cm × 60 cm), que se puso en estado de calentamiento con la temperatura ajustada a 28 °C.
Una vez que la temperatura de la caja oscura alcanzó los 28 °C, se colocó en su interior la placa de 96 pocillos que contenía el pez cebra y se activó el sistema de visión visual para registrar la actividad locomotora. Se creó una nueva carpeta para almacenar los datos. Se seleccionó el archivo de video casero como fuente de video para ingresar a la interfaz de configuración experimental. En la sección Configuración del experimento , el número de zonas de observación se estableció en 60, lo que permitió la observación simultánea de 60 peces cebra. En la configuración de la arena, la imagen de la placa de 96 pocillos capturada por la lente aparecía en la pantalla, junto con los círculos de posición. Los módulos de la interfaz Organizar arenas se ajustaron para que el área de captura del objetivo se alineara con cada pozo. En el mapeo de hardware de Arena, la luz de la caja oscura se establecía en Luz encendida.
En Trial Control Settings, se creó un nuevo programa con un período de preparación de 10 minutos y un período de detección de 10 minutos, que luego se aplicó a todos los experimentos paralelos. La configuración de detección se utilizó para confirmar que la función de captura de lente funcionaba normalmente. En la lista de ensayos, se mostraron los datos de 60 peces cebra de cada grupo. El número de ensayos en la barra de herramientas se utilizó para generar una tabla de datos que contenía todos los grupos experimentales, asegurando la integridad de los datos.
Se confirmaron todos los ajustes y la temperatura de la caja oscura se mantuvo a 28 °C. Después de verificar que cada pocillo contenía un pez cebra con signos vitales, se inició el experimento. Durante el experimento, la lente del instrumento conductual registró la trayectoria del movimiento, la duración y los parámetros relacionados. Después de 20 minutos de la primera grabación, el sistema finalizó automáticamente y se preparó para la siguiente prueba. Se abrió la caja oscura y se reemplazó la placa de 96 pocillos por una nueva que contenía pez cebra para el experimento posterior.
Al final del experimento, se seleccionaron los resultados del módulo de análisis . Los parámetros experimentales, como la velocidad media, la distancia, la aceleración máxima y el ángulo de dirección absoluto, se extrajeron del módulo de resultados y se exportaron. Luego, los datos se compilaron para el análisis de las diferencias de comportamiento entre los grupos de peces cebra12.
6. Medición de citocinas proinflamatorias
Se recolectaron peces cebra. Las muestras se pesaron y se añadió PBS (0,01 M, pH = 7,4) a una relación gravimétrica de 1:9 y se homogeneizaron (5000 r/min, 30 s) a 4 °C. Los homogeneizados se centrifugaron a 4 °C, 5000 x g, 20 min, y se cosecharon sobrenadantes. La IL-1( y el TNF-α se analizaron con kits de ELISA para peces de acuerdo con las instrucciones proporcionadas por el fabricante.
7. Inmunohistoquímica
El pez cebra se fijó con 5 mL al 4% (v/v) de paraformaldehído. Se incrusta en parafina y se cortan secciones de 5 μm de grosor. Las secciones se incubaron con tampón de citrato (200 μL) en el microondas durante 10 min. Se incubaron en una solución de peróxido de hidrógeno y metanol al 0,3% durante 30 min para bloquear las peroxidasas endógenas. Lavar con PBS 3 veces, 5 min cada vez. El suero no inmune se incubó durante 30 min a 37 ºC. El anticuerpo primario anti-TH (1:100) se incubó durante 30 min a 37 ºC. Se lavó 3 veces con PBS. Incubado con anticuerpo secundario unido a peroxidasa de rábano picante (1:200) a 37 ºC durante 30 min. A continuación, se añadió 3,3'-diaminodbencidina. Las secciones se fotografiaron con un microscopio de campo claro.
8. Neurotransmisores
Se empleó HPLC-ECD para analizar el nivel de dopamina. El clorhidrato de dopamina se disolvió en ácido perclórico 0,1 M (HClO4) para obtener una solución de gradiente de concentración a 3,90625 ng/mL, 7,8125 ng/mL, 15,625 ng/mL, 31,25 ng/mL, 62,5 ng/mL y 125 ng/mL. Se analizaron una serie de soluciones estándar de dopamina mediante HPLC-ECD. La regresión lineal se realizó utilizando la concentración de dopamina y el área de pico de dopamina. Se trazó una curva estándar. Los tejidos de pez cebra se homogeneizaron con HClO0.1 M 413. Los homogeneizados se centrifugaron a 4 °C, 20.000 x g, 15 min. A continuación, las muestras se separaron en una columna ODS2 (E2118047; 4,6 × 250 mm, 5 μm). Se preparó el tampón: 25 mmol/L de acetato de sodio, 25 mmol/L de ácido cítrico, 0,01 mmol/L de sal disódica de ácido etilendiaminotetraacético, 1 mmol/L de sodio de 1-octanosulfonato y ácido acético, pH ajustado a 3,35. La fase móvil fue acetonitrilo: tampón (1:9, v/v). Después de la filtración al vacío con una membrana de filtro de 0,22 μm, la muestra se desgasificó mediante desgasificación ultrasónica durante 10 minutos. La temperatura del horno de columna era de 30 °C. El caudal fue de 1 mL/min. La muestra se inyectó a un volumen de 20 μL. El detector electroquímico funcionó a un voltaje de 1000 mV con un rango de 10 μA. La cantidad de dopamina en los tejidos del pez cebra se calculó a partir de la ecuación de regresión.
9. Western blot
Las proteínas se extrajeron del tejido de pez cebra y se ensayó la concentración (concentración final: 10 mg/mL). Las proteínas (50 μg/5 μL) se sometieron a electroforesis en gel de dodecil sulfato de sodio-poliacrilamida al 8%. La membrana de transferencia se realizó a 110 V durante 1 h. Las membranas se bloquearon con leche al 5% durante 1 h. Incubado a 4 °C con anticuerpos primarios: anti-TLR4 de conejo (1:1000), anti-NF-κB de conejo (1:2000), antilamina B1 de conejo (1:2000) o anti-GAPDH de conejo (1:1000). Después del lavado con TBST (3 veces durante 5 min cada una), las membranas se incubaron con anticuerpo secundario durante 1 h. Las bandas se visualizaron utilizando un kit de sustrato quimioluminiscente ECL y se cuantificaron mediante un sistema de imágenes en gel. Se utilizaron Lamin B1 y GAPDH como controles de carga.
10. Análisis estadístico
Todos los datos se expresaron como media ± DE y se analizaron con software estadístico. Los análisis estadísticos se realizaron mediante el análisis de varianza de una vía (ANOVA) seguido de la prueba de Tukey. Un valor de p de <0,05 fue estadísticamente significativo.
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Resultados
Efectos del LPS en la función motora del pez cebra
La velocidad media, la distancia total y la aceleración máxima del pez cebra en los grupos LPS (60 μg/mL y 90 μg/mL) se redujeron (P < 0,01) en comparación con el grupo control. La disfunción motora también se manifestó como cambios frecuentes en la dirección del movimiento. El ángulo de giro absoluto de la natación del pez cebra en los grupos LPS 60 μg/mL y LPS 90 μg/mL aumentó significativamente (P
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Discusión
Las plantas medicinales tienen un largo historial de aplicaciones antiinflamatorias y neuroprotectoras14. Nuestros estudios previos mostraron que HSYA tenía un efecto protector en modelos animales de EP inducidos por agentes neurotóxicos. Utilizando la toxicidad inducida por LPS en el pez cebra, este estudio demuestra que HSYA atenúa la lesión inducida por la inflamación en las neuronas dopaminérgicas del pez cebra mediante la regulación de la vía de señalización ...
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Divulgaciones
Los autores declaran no tener conflictos de intereses.
CONTRIBUCIÓN DEL AUTOR:
Conceptualización: Guirong Zhang, Bing Han. Adquisición de fondos: Guirong Zhang, Bing Han. Investigación: Huilin Zhang. Metodología: Huilin Zhang, Mingyue Li, Xiaohan Zhang, Yang Li. Supervisión: Guirong Zhang, Bing Han. Redacción del borrador original: Mingyue Li, Xiaohan Zhang, Yang Li. Redacción, revisión y edición: Huilin Zhang, Guirong Zhang, Bing Han.
Agradecimientos
Agradecemos a Rachel James por editar este manuscrito. Esta investigación fue financiada por la Fundación de Ciencias Naturales de la Provincia de Shandong (Subvención No. ZR2020MH377).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Kit de medición de concentración de proteínas BCA | Beyotime Biotechnology | P0012S Sistema de | |
| Beijing Sage Venture Technology Co. | ChampChemi 910 | ||
| Clorhidrato de dopamina | Sigma– Aldrich | PHR1090 | |
| Balanza electrónica | Shanghai OHAUS Instrument Co. | Kits ELISA AR-2140 | |
| para IL-1 y beta; | Kits ELISA de COIBO Biotechnology | CB10018-FI | |
| para TNF-α | COIBO Biotechnology | CB10148-FI | |
| GAPDH anticuerpo | Tecnología de señalización celular | 5174S | |
| GraphPad Prism 5.0 | Software estadístico GraphPad, Boston, MA, EE. UU., www.graphpad.com | Prism 5.0 | |
| Cromatografía líquida de alto rendimiento– detección electroquímica (HPLC– ECD) | GL Sciences, Ibaraki, Japón | ED723 | |
| Centrífuga de congelación de alta velocidad | Beijing Dalong Xingchuang Experimental Instrument Co. | D3024R | |
| HPLC– ECD | GL Sciences | ED723 | |
| HSYA | Luye Pharma Group Ltd. | ||
| Image Quant | GE Healthcare, Tokio, Japón | LAS 4000 | |
| Lamin B1 anticuerpo | Tecnología de señalización celular | 13435S | |
| LPS | Sigma– Microscopio Aldrich | L2630 | |
| Leica, Wetzlar | DM1000LED | ||
| Microscopio | Leica, Alemania | DM1000LED | |
| Etiquetadora de enzimas multifuncional | Shanghai Meigu Molecular Instrument Co. | SpectraMax Paradigm | |
| NF-κ Tecnología | de señalización celular | 8242S | |
| Sistema Noldus Visual Vision XT | Beijing Noldus Biotechnology Co., Ltd. | EthoVision XT15 | |
| Kit de extracción de proteínas nucleares y citoplasmáticas | Beyotime Biotechnology | P0028 | |
| PMSF | Beyotime Biotechnology | ST506 | |
| TAK-242 | Merck | 614316 | |
| Termostato | Shenzhen Galaxy Instrumentation Co. | ||
| Anticuerpo TLR4 | Abcam | ab13556 | |
| Pez cebra | Centro del Norte para National Pez cebra Model Animals | AB cepa | |
| Sistema de recirculación de agua de pez cebra | Beijing Aisheng Biotechnology Co., Ltd. | ESEN-AW-S1 |
Referencias
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