Evaluación multimodal del efecto protector del gentiopicrósido en la lesión celular HepG2 inducida por CDCA

Resumen

Este estudio demostró que el gentiopicrósido puede tratar la lesión hepática colestásica controlando la producción y el metabolismo de ácidos biliares y lípidos y previniendo el estrés oxidativo y las respuestas inflamatorias.

Resumen

Se ha demostrado que el principal componente activo de Swertia chirayita, el gentiopicrósido (GPS), protege el hígado en casos de colestasis. Con el fin de dilucidar el mecanismo de protección del GPS en la lesión hepática colestásica, las células HepG2 se trataron con ácido quenodesoxicólico (CDCA) para simular el entorno de colestasis in vitro, y se utilizó el método CCK-8 para determinar el efecto protector del GPS en las células HepG2. Utilizando un kit biológico, se detectaron los contenidos de TBA, T-CHO, TG, ALP, ALT, AST, GSH, IL-1β, IL-6, TNF-α, SOD y MDA intracelulares. Se utilizó microscopía láser confocal para confirmar el nivel de ROS. Las expresiones de las células HepG2 de SHP-2, Tgr5, CYP7A1 y NTCP se evaluaron mediante inmunofluorescencia y análisis de Western blot. A continuación, se utilizó el software Autodock para verificar el acoplamiento molecular de sus principales ingredientes activos. Los hallazgos demostraron que el GPS previno significativamente el daño que el CDCA causó a las células HepG2. Este efecto protector puede haberse logrado controlando la producción y el metabolismo de ácidos biliares y lípidos dentro de la célula y previniendo el estrés oxidativo y las respuestas inflamatorias.

Introducción

El sitio metabólico del sistema digestivo del cuerpo es el hígado. La secreción de bilis es un mecanismo clave en el proceso de catabolismo de grasas del sistema hepatobiliar. Los componentes primarios de la bilis, los ácidos biliares, son liberados por las células hepáticas y son cruciales para preservar el equilibrio del metabolismo de las grasas. Tanto para individuos sanos como para casos enfermos, los procesos fisiológicos y patológicos del hígado dependen del equilibrio de ácidos biliares libres y conjugados en el hígado. Si se altera este equilibrio, la circulación de ácidos biliares no funcionará normalmente, lo que puede conducir a la colestasis intrahepática y al posterior daño hepático¹. Según investigaciones ya realizadas, la lesión hepática colestásica (CLI) es una afección relacionada con trastornos metabólicos, desequilibrio de la microbiota intestinal y necrosis de las células hepáticas². Es provocada por una obstrucción del flujo biliar y la acumulación de ácidos biliares en las células hepáticas para CLI. Los casos graves de CLI pueden progresar a cirrosis hepática, fibrosis hepática e insuficiencia hepática³. Actualmente, el mecanismo subyacente a la CLI aún es algo confuso y complejo, y la mayoría de los pacientes reciben baja eficacia de la terapia con medicamentos⁴ junto con efectos secundarios significativos⁵. Como resultado, uno de los problemas más apremiantes que enfrenta la comunidad médica hoy en día es la búsqueda de medicamentos efectivos para la CLI.

La investigación actual ha demostrado la importancia de unos pocos receptores nucleares en el metabolismo de los ácidos biliares⁶. Entre estos, el receptor de ácidos biliares es un receptor regulador crucial de los ácidos biliares que puede unirse a los BA y activar la proteína tirosina fosfatasa (SHP)⁷. Por otro lado, la acumulación excesiva de BA en los hepatocitos que da lugar a colestasis inhibiría negativamente el receptor SHP y activaría el receptor CYP7A1 (citocromo P450 7A1), lo que conducirá a la producción de ácidos biliares⁸. Además, bloqueó el receptor de ácidos biliares TGR5 acoplado a proteína G para que no secretara BA y estimuló el receptor del polipéptido cotransportador de taurocolato de sodio (NTCP) para transportar BA. Hace que los ácidos biliares se acumulen en las células hepáticas, lo que daña el hígado⁹. En consecuencia, la investigación adicional sobre este mecanismo puede arrojar luz sobre opciones de tratamiento de CLI más viables.

Con una larga historia de uso en medicina, Swertia chirayita es una medicina tradicional tibetana china. Es considerado como el mejor Tida y es utilizado con frecuencia por los lugareños para tratar afecciones de la vesícula biliar y el hígado¹⁰. Se usa con frecuencia para tratar cálculos biliares, colecistitis, cirrosis, hepatitis y otras enfermedades hepáticas¹¹. Investigaciones recientes han revelado que algunos componentes químicos iridoides de Swertia, así como sus ingredientes activos, tienen un buen efecto terapéutico sobre enfermedades hepáticas como la fibrosis hepática y la lesión hepática aguda 12,13,14. Los ingredientes activos de Swertia chirayita alivian la enfermedad hepática al reducir la inflamación¹⁵ y sus propiedades antioxidantes¹⁶. Nuestra investigación preliminar ha demostrado que la fórmula compuesta de la medicina tibetana con Swertia chirayita como ingrediente principal exhibe un efecto terapéutico favorable sobre la CLI, lo que sugiere que Swertia chirayita tiene potencial como tratamiento para la CLI¹⁷. El principal ingrediente activo que se extrae y purifica de Swertia chirayita es el GPS (gentiopicrósido)¹⁸, que tiene una serie de acciones farmacológicas, como la protección del hígado¹⁹, la regulación del metabolismo de la glucosa²⁰, la mejora del microbioma intestinal²¹ y las propiedades antitumorales²². Investigaciones anteriores han demostrado que el GPS mejora el daño hepático en condiciones colestásicas y disminuye la colestasis intrahepática al regular al alza la expresión de los transportadores de ácidos biliares^23,24. De manera similar, la investigación realizada tanto in vivo como in vitro ha demostrado que el GPS puede disminuir el daño hepático al mejorar el metabolismo de los lípidos, reducir la inflamación y reducir el estrés oxidativo^25,26.

Las células HepG2 se utilizan con frecuencia en estudios in vitro de enfermedad hepática porque exhiben actividad enzimática metabólica de hepatocitos²⁷. Mientras tanto, los hepatocitos pueden secretar más bilis cuando se exponen a una de las cuatro formas de ácidos biliares libres, que incluyen CDCA²⁸. Como resultado, CDCA se puede emplear para crear un modelo celular de lesión hepática colestásica e imitar el entorno colestásico in vitro. Dado que la lesión de los hepatocitos inducida por el CDCA está mediada críticamente por el estrés oxidativo y las vías inflamatorias y considerando los efectos antioxidantes y antiinflamatorios documentados del GPS en otros contextos hepáticos²⁶, planteamos la hipótesis de que el GPS puede conferir protección contra la lesión hepática colestásica al aliviar la citotoxicidad inducida por el CDCA en las células HepG2. Este trabajo investigó el efecto protector del GPS sobre CLI y su mecanismo molecular utilizando un modelo de daño inducido por CDCA a las células HepG2.

Protocolo

Cultivo y tratamiento celular
Las células HepG2 y los medios MEM se compraron a un proveedor comercial. Las células HepG2 se cultivaron en medios MEM suplementados con 10% de FBS, 1% de penicilina de 100 U/mL y estreptomicina de 100 U/mL, a 37 °C y 5% de atmósfera de CO₂ . Después de la adhesión celular, se cambiaron los medios de cultivo. Las células se cultivaron en una proporción de 1:3 después de 2-3 días, y se utilizaron en el experimento una vez que el cultivo celular alcanzó un 80% de confluencia.

Ensayo de viabilidad celular
El día 1, las células se sembraron a 2 x 10⁴ células HepG2 (2 x 10⁵ células/ml, 100 μl por pocillo) en una placa de 96 pocillos en seis réplicas²⁹. El día 2, después de 24 h de inoculación, las células fueron tratadas con CDCA a diferentes concentraciones de CDCA (0, 20, 40, 60, 80, 100 μM) durante 12 h. La viabilidad celular se detectó mediante el método CCK-8. Después de 24 h de siembra celular inicial, las células fueron tratadas con CDCA a diferentes concentraciones de GPS (0, 25, 50, 100, 200, 400 y 800 μM) durante 24 h. El día 3, se detectó la viabilidad celular mediante el método CCK-8. El día 4, se sembraron 2 x 10⁴ células HepG2 (2 x 10⁵ células/mL, 100 μL por pocillo) en una placa de 96 pocillos en seis réplicas durante 24 h. En el día 5, las células se separan en seis grupos: Control, Modelo, Ácido ursodesoxicólico (UDCA) y GPS: 25 μM, 50 μM y 100 μM. Excluyendo el grupo de control, se agregó 60 μM de solución de CDCA a todos los grupos durante 12 h. Luego se agregaron la solución de UDCA (60 μM) y la solución de GPS (25 μM, 50 μM y 100 μM) durante 24 h, a los grupos de UDCA y GPS, respectivamente. El día 6, se detectó la viabilidad celular mediante el método CCK-8.

Ensayo de citocinas
De acuerdo con la literatura reportada, se utilizaron kits de TNF-α, IL-6 e IL-1β para detectar los niveles de factores inflamatorios en las células HepG2 después de diferentes tratamientos³⁰. Después de 24 h de intervención CDCA o CDCA+GPS, deseche el medio de cultivo y enjuáguelo con PBS. Centrifugar la suspensión celular a 69 x g durante 10 min, desechar el sobrenadante y tomar el precipitado celular. Agregue la solución de PBS y homogeneice en condiciones de baño de agua helada para preparar homogeneizados celulares. Después de una centrifugación de 10 min a 10.005 x g y 4 °C, se eliminó el sobrenadante y se utilizó la técnica BCA para medir la proteína total en el contenido celular. De acuerdo con las instrucciones del fabricante, los niveles de TNF-α, IL-6 e IL-1β en el sobrenadante celular se determinaron mediante ELISA. La absorbancia se midió a 450 nm utilizando un lector de microplacas multifuncional.

Detección de TBA, TG y T-CHO
Las pruebas TBA, TG y T-CHO se utilizaron de acuerdo con las instrucciones del kit para identificar el metabolismo de ácidos biliares y lípidos de las células HepG2³¹. TBA, TG y T-CHO se compraron comercialmente. Después de que los precipitados celulares se rompieron por ultrasonidos en un baño de agua helada, el homogeneizado celular se preparó agregando lisado RIPA durante 30 min. La absorbancia se midió a 450 nm utilizando un lector de microplacas multifuncional. Después de la adición de soluciones de trabajo de BCA a cada pocillo y la homogeneización de las células, la absorbancia se midió a 562 nm utilizando un enzimómetro, y el período de incubación fue de 30 min. La absorbancia del producto estándar se utilizó para construir la curva estándar, y se utilizó la siguiente fórmula para obtener el valor de absorbancia:
Contenido de TBA (μmol/gprot) = (Una_{muestra-A en blanco})/(Un_estándar en_{blanco-A en blanco})×C_calibración/Cpr
T-CHO, contenido de TG (mmol/gprot) = (A_{muestra-A blanco})/(Un_{estándar-A blanco})×C_estándar/Cpr

Evaluación de la función hepática
La función hepática se evaluó mediante ALT, AST y ALP. ALT, AST y ALP se compraron comercialmente. Después de dos rondas de limpieza de tampón PBS en las células recolectadas, las células se centrifugaron durante 10 min a 69 x g, se eliminó el sobrenadante, se precipitaron las células, se agregó tampón PBS y se creó el homogeneizado mediante trituración ultrasónica en un baño de agua helada. Luego se colocaron los orificios de prueba y control. Se siguió la mesa de operaciones mientras se agregaba el reactivo, agitando y mezclando suavemente la placa del orificio y dejándola reposar a temperatura ambiente durante 15 min. El valor OD de cada orificio se determinó utilizando un enzimómetro con una longitud de onda de 505 nm. A continuación, se introdujo el valor absoluto de DO en la curva estándar y se llevó a cabo un análisis cuantitativo adicional utilizando la fórmula.

Determinación de las actividades SOD, MDA, GSH
La actividad de SOD, el contenido de MDA y el contenido de GSH se evaluaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante, respectivamente. SOD, MDA y GSH se compraron comercialmente. Para decirlo brevemente, se utilizó una placa de seis pocillos para inocular las células. Después del tratamiento, las células se sometieron a un pretratamiento (recolección y rotura) de acuerdo con las instrucciones experimentales del kit. A continuación, se vertieron las soluciones de trabajo adecuadas en la placa de detección de células después de que se hubieran configurado los orificios en blanco, los orificios estándar y los orificios de medición de acuerdo con los pasos de operación de las instrucciones. Posteriormente, las células se cultivan a la temperatura y duración mencionadas en las instrucciones del kit. Luego se utilizó un kit de detección de BCA para cuantificar el contenido de proteínas. Finalmente, se determinó la absorbancia en la longitud de onda apropiada y se realizó un análisis cuantitativo más exhaustivo del índice de estrés oxidativo.

Detección de cambios en ROS en células HepG2 mediante sonda DCFH-DA
Se realizó un cultivo de rutina para el recuento celular. Las células HepG2 con una densidad de 1 x 10⁵ células/ml se inocularon en placas con fondo de vidrio a 1,5 ml cada una y se cultivaron de acuerdo con el método anterior. Después del cultivo, el medio se desechó y las células se lavaron con PBS. El DCFH-DA se diluyó a una concentración de 1:1000, se agregó a 1,5 mL de diluyente por pocillo y se incubó durante 20 min. Después de la incubación, las células se enjuagaron 3 veces con la solución de cultivo básica MEM. Luego, se agregaron 100 μL de medio de montaje antidecoloración con DAPI a cada plato. Se utilizó un microscopio confocal de fluorescencia para ver y tomar imágenes a 488 nm para excitación y 525 nm para emisión³².

Imágenes de inmunofluorescencia
Las células se lavaron 3 veces con tampón PBS después de la incubación. Después de fijarse durante 30 min con paraformaldehído al 4%, las células se limpiaron con tampón PBS en una mesa vibratoria. Se añadió el diluyente, luego se refrigeró a 4 °C lejos de la luz durante la noche. Después de eso, las células se recubrieron con diluyente fluorescente y se incubaron lejos de la luz durante 1 h a 37 °C. Después de la incubación, las células se lavaron tres veces con tampón PBS. Después de la fijación con paraformaldehído al 4% durante 30 min, las células se enjuagaron con tampón PBS en un agitador rotativo. Posteriormente, se agregaron 150 μL de diluyente de anticuerpos primarios y se incubaron durante la noche a 4 °C en condiciones de protección contra la luz. Se recuperó el diluyente primario de anticuerpos, seguido de la adición de un volumen adecuado de tampón PBS y agitación durante 5 min; Este procedimiento de lavado se repitió tres veces. Luego, cada placa recibió 150 μL de diluyente de anticuerpos secundarios fluorescentes y se incubó a 37 ° C durante 1 h en una incubadora protegida contra la luz. Se agregó un volumen apropiado de tampón PBS a cada plato y se lavó en un agitador giratorio durante 8 minutos, repetido durante tres ciclos. Finalmente, las células se cubrieron con suficiente solución de tinción DAPI durante 10 min, se montaron con un medio de montaje antidecoloración y se obtuvieron imágenes utilizando un sistema de imágenes de superresolución³³.

Análisis de Western blot
Después de diferentes tratamientos, se extrajo toda la proteína de las células HepG2 mediante lisado de RIPA y se determinó la concentración de proteína mediante la técnica BCA. Después de aislar la proteína diana utilizando SDS-PAGE al 10%, se transfirió a una membrana de PVDF de 0,45 μm. Después de eso, la membrana se selló durante 1,5 h a 25 °C utilizando BSA al 5%. Los anticuerpos primarios contra SHP-2 (1:1000), CYP7A1 (1:1000), Tgr5 (1:1000), NTCP (1:1000) y β-actina (1:1000) se incubaron durante la noche a 4 °C. A continuación, la membrana se incubó con anticuerpo secundario de inmunoglobulina G anti-conejo de cabra (1:10000) conjugado con peroxidasa de rábano picante durante 2 h a 25 °C. Las bandas recubiertas de peroxidasa se vieron utilizando una solución quimioluminiscente ECL de sensibilidad ultra alta, y las imágenes se tomaron utilizando un sistema de imágenes³⁴.

Acoplamiento molecular
Como se informó, el proceso de acoplamiento molecular se llevó a cabo de acuerdo con los siguientes procedimientos³⁵. La estructura de molécula pequeña del fármaco .mol2 se descargó de la plataforma ChemicalBook y la estructura .sdf de la proteína ligando se descargó de las plataformas Uniprot y RCSBPDB. El ligando y las moléculas de agua fueron eliminadas por el software Pymol, y la proteína del ligando se importó al software AutoDock para su hidrogenación y detección. El resultado final está en formato .pdbqt. El análisis de la caja de acoplamiento, RunAutoGrid, RunAutoDock y AutoDock Tools se realizaron en el software AutoDock, y se guardó la energía mínima de enlace de cada grupo de resultados de acoplamiento. Se seleccionó la conformación con la menor energía de unión libre de cada grupo, y su conformación ligando-receptor se visualizó mediante el software Pymol.

Análisis estadístico
Los datos antes mencionados se clasificaron estadísticamente utilizando GraphPad Prism 9.2, y todos los resultados experimentales se informaron como Media ± DE. Para comparar estadísticamente los datos entre los grupos, se empleó ANOVA de una vía. La diferencia entre los dos grupos se consideró significativa cuandop < 0,05.

Resultados

La concentración de CDCA se estableció en 0 μM, 20 μM, 40 μM, 60 μM, 80 μM y 100 μM de gradiente de concentración para los experimentos. Cuando la concentración de CDCA fue de 60 μM, la actividad celular fue significativamente diferente a la del grupo de control, y finalmente se utilizó 60 μM como concentración de CDCA (Figura 1A). Los resultados mostraron que después de la incubación durante 24 h después de la administración del fármaco, no hubo diferencias significativas en la actividad ce...

Discusión

La CLI es una enfermedad hepática causada por la obstrucción de la formación, secreción o excreción de bilis. Se manifiesta clínicamente como prurito, osteoporosis e incluso se desarrolla en fibrosis hepática, cirrosis y otras enfermedades, que ponen en grave peligro la vida y la salud 36,37,38. El UDCA es reconocido como el fármaco más utilizado en el tratamiento de la CLI³⁹

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
ALP	Instituto de Bioingeniería Nanjing Jiancheng	A059-2-2
ALT	Instituto de Bioingeniería Nanjing Jiancheng	C009-2-1
AST	Instituto de Bioingeniería Nanjing Jiancheng	C010-2-1
BCA	Boster Biological Technology Co., Ltd	AR0146
CDCA	Chengdu Medesheng Technology Co., Ltd	474-25-9
kit de recuento de células-8	Boster Biological Technology Co., Ltd	AR1160-500
Citocromo P450 7A1 Anticuerpo	Abmart Shanghai Co., Ltd.
DAPI	Beyotime Biotechnology	C1005
DMSO	Boster Biological Technology Co., Ltd	PYG0040
Cabra Anti-Rabbit IgG (H& L)	Chengdu Zen-Bioscience Co., Ltd.
Cabra Anti-Conejo IgG AF488	Abmart Shanghai Co., Ltd.
GPS	Chengdu Medesheng Technology Co., Ltd	RP210717
GSH	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	A006-2-1
HepG2 células	Procell Life Science & Technology Co., Ltd	CL-0103
HRP Cabra Anti-Conejo IgG Wuhan	ABclonal  Biotechnology Co., Ltd.	AS014
IL-1 y beta;	Elabscience Biotechnology Co., Ltd	E-EL-H0149c
IL-6	Elabscience Biotechnology Co., Ltd	E-EL-H6156
MDA	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	A003-1-2
MEM base medio	Procell Life Science & Technology Co., Ltd	PM150410
PBS	Boster Biological Technology Co., Ltd	PYG0021
Tampón de transferencia rápida (20 veces)	NCM Biotech	WB4600
RIPA	Boster Biological Technology Co., Ltd	BL651A
ROS	Beyotime Biotechnology	S0033S
SHP2 Rabbit pAb	Wuhan ABclonal  Biotechnology Co., Ltd.	A12486
SLC10A1 Anticuerpo	Abmart Shanghai Co., Ltd.
SOD	Instituto de Bioingeniería Nanjing Jiancheng	A001-3-1
TBA	Instituto de Bioingeniería Nanjing Jiancheng	E003-2-1
T-CHO	Instituto de Bioingeniería Nanjing Jiancheng	A111-1-1
TG	Instituto de Bioingeniería Nanjing Jiancheng	A110-1-1
TGR5 Anticuerpo policlonal	Compañía de biotecnología	ImmunoWay YT4636
TNF-α	Elabscience Biotechnology Co., Ltd	E-EL-H0109c
Solución de tripsina (0,25%)	Yeasen Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd	40126ES60
UDCA	Chengdu Lemetian Medical Technology Co., Ltd	DSTDX007601
β-Actin Rabbit mAb	Wuhan  ABclonal  Biotechnology Co., Ltd.	AC026