Una prueba de preferencia olfativa para medir los sesgos hedónicos olfativos en modelos murinos de depresión

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo de una prueba de preferencia olfativa que permite la evaluación de los sesgos olfativos negativos hacia los estímulos olfativos apetitivos y aversivos en modelos de depresión en ratones.

Resumen

La depresión es el mayor contribuyente a la discapacidad en todo el mundo, afectando a 280 millones de personas al año. Más allá de la reducción de la actividad y la motivación, se ha demostrado que la depresión se asocia con un sesgo negativo de la valencia: los pacientes encuentran que los estímulos sensoriales neutros y positivos son menos agradables y los negativos más desagradables en comparación con los individuos sanos. En particular, el sesgo hedónico olfativo puede representar un marcador de estado de la enfermedad en los pacientes y puede medirse fácilmente en modelos de ratón. Sin embargo, hay muy pocas pruebas en animales para medir el sesgo emocional de forma traslacional. Aquí proponemos un protocolo para una evaluación confiable de la atribución de valencia de olor de ratones control y depresivos a través de la exploración de odorantes asociados con varios valores hedónicos. Utilizando esta prueba de preferencia olfativa y varias lecturas de comportamiento, confirmamos un sesgo olfativo negativo hacia los estímulos apetitivos y aversivos en dos modelos distintos de depresión en ratones. Es importante destacar que este método es aplicable tanto a hombres como a mujeres. Por último, este protocolo permite múltiples adaptaciones para mejorar la evaluación de la respuesta emocional y puede combinarse fácilmente con herramientas clásicas para la monitorización en directo de la actividad neuronal.

Introducción

La depresión es un trastorno grave del estado de ánimo y una de las principales causas de discapacidad en todo el mundo. Según la Organización Mundial de la Salud, aproximadamente 280 millones de personas, es decir, el 4% de la población, experimentan depresión. Es un 50% más común entre las mujeres que entre los hombres, y el brote de COVID-19 aumentó en un 25% la prevalencia de trastornos depresivos en el primer año de la pandemia (Organización Mundial de la Salud, 2022). Además, alrededor de un tercio de los pacientes no responden a las terapias antidepresivas clásicas, se necesitan semanas para observar los efectos antidepresivos y la fisiopatología de los trastornos del estado de ánimo sigue siendo en gran medida desconocida.

Con base en el DSM-5¹, un diagnóstico de depresión se basa en varios síntomas, que incluyen estado de ánimo deprimido, pérdida de interés o placer, variación significativa de peso, desaceleración física y psicológica, fatiga, sentimientos de inutilidad, dificultad para concentrarse y pensamientos recurrentes de muerte. Los estudios clínicos también demostraron que los trastornos del estado de ánimo vienen acompañados de alteraciones sensoriales: los pacientes deprimidos encuentran los estímulos sensoriales menos agradables que los sujetos control ^2,3,4.

La "valencia" hedónica se refiere al grado en que algo es placentero (valencia positiva) o aversivo (valencia negativa). La asignación de valencia a un estímulo puede desencadenar un comportamiento adaptado, incluyendo el acercamiento o la evitación⁵. Curiosamente, este proceso está muy conservado entre especies, desde insectos hasta humanos⁶. Por lo tanto, la depresión se asocia con un sesgo negativo de la valencia. Sin embargo, el diagnóstico clínico se basa poco en las evaluaciones de sesgos sensoriales.

Entre las modalidades sensoriales, el olfato es particularmente interesante, ya que las entradas olfativas evitan en gran medida los relés talámicos y se proyectan al sistema límbico en los mamíferos, incluidos los humanos. Desde un punto de vista evolutivo, se ha demostrado que este sistema es crítico en la codificación de un conjunto de respuestas primarias a los estímulos ambientales 7,8,9,10,11,12. Además de estos circuitos neuronales compartidos, los estudios clínicos revelan una relación bilateral entre el olfato y la depresión, ya que los pacientes deprimidos experimentan alteraciones olfativas, así como trastornos olfativos que causan síntomas depresivos¹³. Además, se recupera la función olfativa en pacientes deprimidos después de medicación o terapia 14,15,16,17. Estos resultados sugieren que los déficits olfativos podrían ser un biomarcador de estado (estado de las manifestaciones clínicas en los pacientes) más que un rasgo (propiedades que juegan un papel antecedente, posiblemente causal, en la fisiopatología del trastorno psiquiátrico y, por lo tanto, pueden utilizarse para el diagnóstico precoz y presintomático) de la enfermedad¹⁸. En consecuencia, una mejor y más profunda comprensión de cómo se altera la modalidad olfativa en la depresión podría allanar el camino hacia nuevas herramientas terapéuticas para el diagnóstico y la detección de la respuesta al tratamiento.

Por lo tanto, la evaluación del sesgo hedónico olfativo en modelos de depresión sería de particular interés, tanto para evaluar el fenotipo depresivo inducido como para investigar los mecanismos neuronales detrás de estos cambios en la asignación de valencia. Estudios anteriores ya han utilizado enfoques conductuales para evaluar la asignación de valencia de olor en ratones. Sin embargo, estas pruebas presentan varias advertencias: requieren dispositivos sofisticados¹⁹ que en su mayoría involucran cajas cerradas por una tapa 19,20,21, implican un contacto físico constante con la solución de olor^20,21,22 y/o resultan en tiempos de exploración de olor muy cortos 21,22,23. Esto hace que estos ensayos sean incompatibles con las herramientas clásicas de monitorización en vivo de la actividad neuronal que requieren duraciones de muestreo más largas en ratones atados.

Además, Malkesman et al. ya desarrollaron el Test de Olfateo de Orina Femenina (FUST) para monitorear la actividad de búsqueda de recompensa en roedores mediante la medición de la investigación olfativa de ratones machos expuestos a orina de ratón hembra²⁴. Sin embargo, esta prueba solo evalúa la respuesta conductual a un estímulo positivo particular de naturaleza social, y con tiempos de interacción cortos. Además, esta prueba fue diseñada exclusivamente para roedores machos, aunque la depresión es dos veces más prevalente entre las mujeres que entre los hombres.

Para superar todas estas limitaciones, desarrollamos aquí un Test de Preferencia Olfativa (OPT) adaptado de Bigot et ^al.14, donde tanto ratones machos como hembras pueden ser expuestos a una gran variedad de olores neutros, positivos y negativos con el fin de evaluar con precisión la respuesta hedónica en el contexto de la depresión. La elección de los olores puede basarse en publicaciones previas^14,25, pero esta prueba también permite explorar nuevos estímulos sociales, nutricionales, relacionados con la infección, utilizando tanto componentes naturales como mezclas químicas monomoleculares o específicamente diseñadas.

Protocolo

Todos los procedimientos experimentales y de cuidado animal siguieron las directrices nacionales y europeas (2010/63/UE) y fueron aprobados por el Ministerio de Investigación francés (APAFiS: #16380-2018080217358599_v1; APAFIS #51636-2024101718013761_v4). Los ratones machos y hembras C57BL/6JRj (modelo UCMS) y ratones machos C57BL/6NTac (modelo CORT) (8 semanas de edad) fueron alojados socialmente (4-5 ratones por jaula) y mantenidos en condiciones estándar (23 ± 1 °C; humedad 40%) en un ciclo de luz/oscuridad de 14/10 h (luces encendidas a las 7 a.m.) con comida y agua ad libitum.

1. La configuración experimental

1. Instalación de la arena
   1. Prepare el montaje experimental, que consiste en una arena de dos compartimentos (45 cm × 50 cm × 25 cm) hecha de paredes de plexiglás gris y un suelo blanco. Divida los dos compartimentos (25 cm × 45 cm) por una pared de plexiglás gris (37 cm × 25 cm).
   2. Coloque una placa de Petri perforada (60 mm × 15 mm con 7 agujeros de 5 mm de diámetro) en la parte inferior de la pared de cada compartimento.
   3. Fije verticalmente las placas de Petri en la pared con adhesivo de doble cara o adhesivo sensible a la presión (por ejemplo, Blu-tack).
   4. Coloque una cámara en la parte superior de la arena para registrar el comportamiento de los animales (2 m por encima de la arena) y rastrear automáticamente sus movimientos durante el experimento.
2. Elección de olores
   1. Antes del experimento, elija una lista de olores con valencia neutra, positiva y negativa que se analizarán (consulte la Tabla 1 para ver ejemplos).
   2. Verifique que todos los olores elegidos tengan una presión de vapor similar. Además, evalúe la difusión en la arena para detectar algunos olores con un detector de fotoionización (PID)²⁶.
   3. Pruebe cada olor en un día separado.
      NOTA: Se recomienda planificar primero el uso de olores neutros, luego los apetitivos y terminar con los olores aversivos para minimizar los efectos de la exploración de un día para otro. Este pedido minimiza los efectos de arrastre de un día de prueba a otro. Alternativamente, se puede utilizar una presentación aleatoria, pero todos los grupos experimentales deben ser probados con la misma secuencia de olor.
3. Diseño de grupos experimentales
   1. Divida a los ratones en al menos dos grupos experimentales: ratones de control y ratones que se someterán al modelo de depresión. Aloja a los animales del mismo grupo en las mismas jaulas.
      ATENCIÓN: Cada grupo experimental debe contener al menos aproximadamente 7-8 individuos para obtener significación estadística. Las jaulas deben estar ubicadas cerca en el establo del animal para minimizar el efecto jaula.
   2. Inducir un fenotipo similar a la depresión en grupos de ratones relevantes utilizando el modelo de depresión de elección.
      NOTA: La descripción de protocolos para inducir comportamientos similares a la depresión en ratones está más allá del alcance de este artículo. Sin embargo, este estudio presenta experimentos que utilizan dos modelos diferentes (el Estrés Crónico Leve Impredecible [UCMS] y la Corticosterona [CORT])^27,28 como resultados representativos para esta prueba de preferencia olfativa. En resumen, el modelo UCMS se basa en la exposición a una variedad de diferentes factores estresantes ambientales durante varias semanas, mientras que el modelo CORT consiste en la administración crónica de corticosterona disuelta en el agua potable de ratones (alrededor de 5 mg/kg/día dependiendo de la cantidad que beban los ratones).

2. Fase de habituación

1. Habituación general y manejo
   1. A su llegada, deje a los ratones sin molestarlos durante 1 semana sin cambiar la ropa de cama. Agregue material de algodón suplementario y un iglú en la jaula para reducir el estrés.
   2. Después de 1 semana, manipule suavemente a todos los ratones diariamente durante 3-4 días y acostúmbrelos a la manipulación de tazas, preferiblemente en la sala experimental.
2. Condiciones experimentales de la prueba
   1. Transfiera el mouse a la sala de pruebas de comportamiento 30 minutos antes del inicio del experimento.
      NOTA: Idealmente, la sala de comportamiento debe incluir dos partes separadas que permitan que los animales estén en una parte mientras el ratón probado actúa en la otra.
   2. Tenga en cuenta que se mantengan las condiciones estándar de la vivienda (23 ± 1 °C; humedad 40%) y que no haya sonidos, luces ni olores molestos en la habitación.
   3. Con un luxómetro, configure la iluminación a aproximadamente 40 lux en la arena. Asegúrese de que la iluminación sea homogénea en la arena.
3. Habituación a la arena
   1. Agregue un papel de filtro limpio (42,5 mm) en ambas placas de Petri (60 mm × 15 mm).
   2. Use cinta adhesiva transparente para sujetar la tapa de la placa de Petri a su parte inferior (porque se colocará verticalmente).
   3. El primer día, coloque suavemente todos los ratones de la misma jaula juntos en la arena durante 10 minutos para reducir la neofobia.
      PRECAUCIÓN: Siempre coloque los ratones en la arena manipulándolos con la taza para evitar el estrés debido a que los levantan por la cola.
   4. Al día siguiente, introduce a cada ratón individualmente en la arena, justo entre los dos compartimentos, y registra el comportamiento durante 10 minutos.
   5. Repita durante 2-3 días seguidos.
4. Criterio de exploración
   1. Define las dos áreas (25 cm, 15 cm) en las que se han colocado las placas de Petri y mide el tiempo que cada animal pasa en cada zona.
   2. Promedie estas medidas a través de todos los pasos de habituación individuales.
   3. Si el tiempo medio de permanencia en cada una de las zonas es superior a 50 s, se cumple el criterio. Si no es así, repetir las sesiones de habituación hasta alcanzar el criterio, o excluir al animal del análisis.
      NOTA: Se podrán realizar un máximo de dos sesiones de habituación al día (mañana y tarde).

3. Fase de prueba

1. Preparación del olor
   1. El día de la prueba, prepare el olor con la dilución correcta bajo una cubierta química. Diluir el olor en aceite mineral o agua destilada, dependiendo de la estructura química. Para evitar la contaminación, almacene el aceite mineral en una habitación separada y ventilada lejos de los odorantes.
      NOTA: Se recomienda el uso de una nueva botella de aceite mineral al comenzar un nuevo experimento.
   2. Guarde la solución odorante en un frasco de vidrio. Evite los recipientes de tubos de plástico que podrían agregar contaminación por olores.
   3. Justo antes de probar cada ratón, recoja 200 μL de la solución de olor con una micropipeta utilizando puntas de filtro y colóquela sobre el papel de filtro en una de las dos placas de Petri.
   4. Deje que el otro papel de filtro en la segunda placa de Petri permanezca intacto.
   5. Transfiera las placas de Petri en la sala de pruebas y fíjelas verticalmente en la pared de la arena.
      PRECAUCIÓN: No prepare ni deseche las soluciones odorantes en la sala experimental para evitar la contaminación por olores. Cámbiese los guantes regularmente durante el experimento. Si se sospecha que los guantes podrían estar contaminados durante la manipulación de olores, cámbielos antes de agarrar los ratones para analizarlos.
2. Prueba de comportamiento
   1. Coloca cada ratón individualmente en la arena, justo entre los dos compartimentos.
   2. Graba durante 10 min.
   3. Retira el ratón de la arena.
   4. Elimina el olor de la placa de Petri.
   5. Limpie la arena con una solución desinfectante (por ejemplo, etanol al 70%) y séquela.
   6. Deseche el papel de filtro y repita la preparación del olor para el próximo mouse.
   7. Lo ideal es probar solo un olor por día. Preferiblemente, use primero los olores neutros, luego los olores positivos y finalmente los olores negativos (ver Figura 1).
      PRECAUCIÓN: Realice los pasos de habituación y prueba aproximadamente a la misma hora del día durante los días del experimento (idealmente entre las 9 a.m. y las 3 p.m.). Si el número de animales requiere un período de tiempo más largo, esté atento a probar diferentes grupos experimentales de manera alterna para evitar cualquier sesgo diurno. Si es necesario evaluar a machos y hembras en el mismo experimento, prefiera probar un sexo después del otro.
      NOTA: Use placas de Petri limpias todos los días de la prueba para evitar la contaminación por olores. Cabe destacar que las placas de Petri perforadas se pueden reutilizar para varios experimentos después de una limpieza adecuada y la descontaminación de olores.

4. Análisis de datos

1. Seguimiento del comportamiento
   1. Utilice un programa de seguimiento automático para registrar la posición del ratón a través de las pruebas.
   2. Defina zonas separadas en la arena para el análisis (consulte la Figura 1):
      1. Defina una "zona de olor" (25 cm × 15 cm), el área donde se coloca la placa de Petri con el papel de filtro empapado con el olor (es decir, el área más cercana al olor que representa aproximadamente un tercio del compartimiento de la superficie).
      2. Defina una "zona de control" (25 cm × 15 cm), simétrica a la "zona de olor", pero sin ningún olor añadido en la placa de Petri.
      3. Defina una "zona detrás del olor" (25 cm × 30 cm), es decir, el resto del compartimento es donde se coloca la placa de Petri del olor.
      4. Defina una "zona de control trasera" (25 cm × 30 cm), simétrica a la "zona de control trasera", que consiste en el resto del compartimento sin olores.
         NOTA: El seguimiento del punto central del cuerpo del ratón es suficiente para analizar la preferencia olfativa del animal. Sin embargo, el seguimiento específico de la nariz de cada ratón puede ilustrar con mayor precisión la investigación olfativa por parte del animal.
2. Lecturas de la respuesta hedónica
   1. Utilizando el seguimiento automático, recopile la siguiente información para cada ratón y cada día de la prueba, incluidos los pasos de habituación:
      1. Registre la distancia total recorrida en la arena (m).
      2. Registre el tiempo que pasa en cada zona de la(s) arena(s).
      3. Registre el número de entradas en cada zona de la arena.
   2. Utilice la distancia total recorrida para evaluar los principales efectos locomotores.
   3. Para evaluar las diferencias en la preferencia olfativa hacia varios olores, utilice las lecturas principales:
      1. Aprovecha el tiempo que pasas en la zona de olor.
      2. Utilice el número de entradas en la zona de olor.
      3. Utilice un índice de preferencia, calculado como el tiempo que se pasa en la zona de olor normalizado con el tiempo que se pasa en esta zona durante la habituación (la normalización se realiza en ratones de todos los grupos). La media se refiere a la media aritmética del tiempo pasado en la zona de olor, y sd se refiere a su desviación estándar.
         
      4. Utilice un índice de exploración de olores, calculado como el promedio de los valores normalizados de la distancia recorrida, el tiempo pasado en la zona de olor y el número de entradas en la zona de olor de la siguiente manera:
         
         
         NOTA: Este índice de preferencia se puede adaptar si es necesario, por ejemplo, comparando los tiempos pasados en la zona de olor con los de control. Si los grupos muestran diferencias significativas en su exploración de la "zona de olor" durante la habituación, la normalización se puede realizar solo con respecto al grupo de control, en lugar de con respecto a todos los grupos combinados.
   4. Represente visualmente estas lecturas para ratones de control y depresivos como media ± error estándar de la media (SEM).
   5. Utilice el análisis de varianza bidireccional de medidas repetidas (ANOVA) seguido de pruebas post hoc (aquí la prueba de diferencia mínima significativa de Fisher no corregida) para tener en cuenta ambos grupos experimentales, los olores (factor de medida repetida) y los factores de efecto de interacción. El factor de interacción indica si las diferencias entre los grupos son consistentes en todos los olores presentados.
   6. Verificar la normalidad y homocedasticidad mediante pruebas adaptadas (prueba de Shapiro-Wilk, prueba de Bartlett). La significación estadística se estableció en *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001.

Resultados

Para comprobar que los ratones depresivos presentan un sesgo olfativo negativo^14,29 y que éste puede medirse de forma fiable mediante el protocolo del test de preferencia olfativa que describimos aquí, evaluamos la respuesta hedónica a diferentes olores en dos modelos distintos de ratón de depresión.

En primer lugar, utilizamos un modelo de ratón de estrés crónico leve impredecible (UCMS) de 4 semanas de duración adaptado de²⁸ (véase el Archivo Suplementario 1 para ver el protocolo detallado) para inducir un fenotipo depresivo en ratones hembra jóvenes C57BL/6JRj (Figura 2A, B). Estos ratones hembra se probaron en la prueba de preferencia olfativa con orina de ratón macho (MU, pura) como olor apetitivo y 2,4,5-trimetiltiazol (TMT, 5% en aceite mineral) como olor aversivo. En promedio, cada ratón pasó al menos 50 s en la zona de "control" y "olor" durante la habituación, cumpliendo el criterio (Figura 2C). Sin embargo, a través de la habituación, los ratones UCMS pasaron significativamente más tiempo en la "zona de control" en comparación con los controles, pero como no hay una diferencia significativa con respecto a la zona donde se agregará el olor, esta diferencia puede descartarse. En cuanto a la distancia, los ratones control se movieron significativamente más que los UCMS cuando se expusieron a MU, pero no durante la habituación ni en presencia de TMT (Figura 2D). Finalmente, todas las lecturas de la respuesta hedónica (tiempo de permanencia en la zona de olor, número de entradas en la zona de olor e índice de preferencia) muestran diferencias significativas o una tendencia estadística entre las hembras de control y las de UCMS (Figura 2E-G). Este efecto también es visible a través del índice global de exploración de olores, que es una medida combinada de la respuesta hedónica y locomotora (Figura 2H). Consistentemente, cada lectura demuestra un sesgo hedónico negativo en respuesta a los estímulos olfativos apetitivos y aversivos. Curiosamente, la puntuación de emocionalidad, que se calcula como un valor normalizado del fenotipo similar a la ansiedad y la depresión basado en una gran batería de pruebas conductuales¹⁴, se correlaciona positivamente con el índice de exploración de olores tanto de MU como de TMT (Figura 2I), mostrando una relación entre la respuesta conductual a los olores positivos y negativos y el fenotipo de ansiedad y tipo depresivo.

En segundo lugar, esta vez utilizamos el mismo protocolo UCMS para inducir un fenotipo similar al depresivo en ratones macho. Durante la prueba de preferencia olfativa, estos ratones fueron expuestos a orina de ratón hembra (FU, pura), que es apetitiva, y TMT como antes, como un olor negativo (Figura 3A, B). No hay diferencia en el tiempo empleado en las cuatro zonas durante la habituación, ni en la distancia recorrida a través de la prueba (Figura 3C,D). El tiempo de permanencia en la zona de olor muestra una reducción significativa de la exploración de FU y TMT en UCMS en comparación con los controles (Figura 3E). Además, los ratones UCMS entran significativamente menos en la zona de olor, o tienden a hacerlo, y presentan un índice de preferencia significativamente reducido tanto para FU como para TMT (Figura 3F,G), lo que confirma un sesgo olfativo negativo en un estado similar al depresivo. Del mismo modo, el índice de exploración de olores muestra una respuesta conductual negativa a FU y TMT de los ratones UCMS en comparación con los controles (Figura 3H), que tienden a correlacionarse positivamente con la puntuación de emocionalidad de los animales (Figura 3I).

En un tercer experimento, recurrimos a otro modelo de depresión que se basa en la administración crónica de corticosterona (CORT) en el agua potable de ratones machos C57BL/6NTac, mientras que los ratones control solo reciben la solución vehículo (Veh) (10% de 2-hidroxipropil-beta-ciclodextrina) ²⁷. Después de cuatro semanas de tratamiento con CORT o Veh, los ratones se habituaron durante cuatro días y luego se expusieron a un olor neutro (OCT: 2-trans octenal, 1% en agua), un olor positivo (PO: aceite de maní) y un olor negativo (TMT: 2,4,5-trimetiltiazol, 5% en aceite mineral) (Figura 4A,B). A través de la habituación, no hubo diferencias entre Veh y CORT (Figura 4C). Sin embargo, ambos grupos pasaron significativamente más tiempo en la "zona de olor" en comparación con la "zona de control". No hay diferencias en cuanto a la distancia recorrida, excepto por el olor positivo (PO) por el que los ratones Veh se movieron más que CORT (Figura 4D). Es importante destacar que, al igual que en el caso de los ratones UCMS, el tiempo que se pasó en la zona de olor se redujo significativamente en los ratones CORT cuando se expusieron a un olor neutro y apetitivo (Figura 4E). La reducción de la exploración de olores también es visible a través de una reducción significativa o una tendencia a un menor número de entradas en la zona de olores (Figura 4F). En este caso, se revelan diferencias entre los grupos en función de la lectura analizada, probablemente debido a las limitaciones relacionadas con el número de animales utilizados, así como a un posible efecto suelo causado por el bajo tiempo de exploración observado después de la exposición al TMT. En general, el índice de preferencia es significativamente más bajo en los ratones CORT para todos los estímulos olfativos en comparación con Veh (Figura 4H). Finalmente, el índice de exploración de olores para todos los olores se correlaciona significativamente con la puntuación de emocionalidad de los animales (Figura 4I), lo que demuestra una vez más que esta prueba de preferencia olfativa es una herramienta adecuada para evaluar el sesgo emocional negativo en varios modelos de depresión en ratones.

Finalmente, podemos descartar la posibilidad de que las diferencias observadas puedan ser causadas por una reducción de la actividad locomotora, más que por sesgos emocionales. De hecho, la locomoción no difiere entre los grupos durante la habituación cuando se evalúa la distancia total recorrida (Figura 2D, Figura 3D, Figura 4D). Además, según el análisis estadístico, una reducción general en el compromiso con la tarea o un efecto de novedad tampoco pueden explicar estos sesgos. De hecho, encontramos un efecto significativo del factor olor en el análisis del índice de preferencia, sin interacción significativa entre los grupos experimentales y los olores. Estos resultados demuestran que los ratones de tipo depresivo realizan la tarea, y que su exploración reducida es específica para cada señal olfativa.

Figura 1: Esquema general de la línea de tiempo y configuración de la prueba de preferencia olfativa. Los ratones se habitúan por primera vez a la arena. En el primer día de habituación, los ratones de la misma jaula se colocan juntos para reducir la neofobia. Al día siguiente, se colocan individualmente en la arena. Después de la habituación, se agrega un olor a una de las cámaras. Primero se prueban preferentemente los olores neutros, seguidos de los olores positivos y finalmente los olores negativos. Para el análisis, la arena se puede dividir en cuatro zonas diferentes. Creado con Biorender. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Sesgo olfativo negativo en un modelo de ratón hembra de UCMS de depresión. (A,B) Cronología y grupos experimentales del estudio: Ratones hembra Control y UCMS (Unpredictable Chronic Mild Stress) se prueban en el Test de Preferencia Olfativa con olor positivo (MU: orina de ratón macho, pura) y negativo (TMT: 2,4,5-trimetiltiazol, 5% en aceite mineral). Creado con Biorender. (C) Los ratones UCMS pasaron en promedio significativamente más tiempo en la "zona de control" y menos tiempo en la "zona detrás del olor" en comparación con los controles durante la habituación (Grupo: F(1, 12) = 74.03, p < 0.0001; Zona: F(2.434, 29.21) = 7.688, p = 0.0012; Interacción: F(3, 36) = 5,148, p = 0,0046). (D) La distancia total recorrida se redujo significativamente en UCMS cuando se expuso a MU, pero no para la habituación (Hab) y TMT (Grupo: F(1, 12) = 4.664, p = 0.0518; Olor: F(1.871, 22.45) = 4.846, p = 0.0195; Interacción: F(2, 24) = 4,797, p = 0,0177). (E) Los ratones UCMS pasaron significativamente menos tiempo explorando MU y TMT (Grupo: F(1, 12) = 24.39, p = 0.0003; Olor: F(1, 12) = 59.69, p < 0.0001; Interacción: F(1, 12) = 2,267, p = 0,1580). (F) Los ratones UCMS entraron menos de la zona de olor o atendidos (Grupo: F(1, 12) = 9.279, p = 0.0102; Olor: F(1, 12) = 5.100, p = 0.0433; Interacción: F(1, 12) = 1,649, p = 0,2233). (G) El índice de preferencia por MU y TMT se reduce significativamente en los ratones UCMS (Grupo: F(1, 12) = 24.39, p = 0.0003; Olor: F(1, 12) = 59.69, p < 0.0001; Interacción: F(1, 12) = 2,267, p = 0,1580). (H) El índice de exploración de olores para MU y TMT se reduce significativamente en ratones UCMS (F(1, 12) = 14.71, p = 0.0024; Olor: F(1, 12) = 0, p > 0,9999; Interacción: F(1, 12) = 0,02630, p = 0,8739). (I) El índice de exploración de olores para MU y TMT se correlaciona positivamente con la puntuación de emocionalidad de los animales (MU: Pearson R² = 0.4837, F(1,12) = 11.24, **p = 0.0058; TMT: Pearson R² = 0,5340, F(1,12) = 13,75, **p = 0,0030). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Sesgo olfativo negativo en un modelo de ratón macho UCMS de depresión. (A,B) Cronología y grupos experimentales del estudio: Los ratones macho control y UCMS se prueban en el Test de Preferencia Olfativa con un olor positivo (FU: orina de ratón hembra, pura) y negativo (TMT: 2,4,5-trimetiltiazol, 5% en aceite mineral). Creado con Biorender. (C) No hay diferencias en promedio en el tiempo de permanencia en las diferentes zonas de la arena a través de la habituación (Grupo: F(1, 13) = 3,921, p = 0,0693; Zoner = F(1,688, 21,94) = 34,57, p < 0,0001; Interacción: F(3, 39) = 0,7385, p = 0,5355). (D) No hay diferencias en la distancia total recorrida entre los controles y el UCMS (Grupo: F(1, 13) = 2.313, p = 0.1522; Olor: F(1.722, 22.38) = 1.746, p = 0.1998; Interacción: F(2, 26) = 0,8806, p = 0,4266). (E) El tiempo dedicado a explorar la zona de olor con FU y TMT se reduce significativamente en los ratones UCMS (Grupo: F(1, 13) = 6,808, p = 0,0216; Olor: F(1, 13) = 16.21, p = 0.0014; Interacción: F(1, 13) = 0,3304, p = 0,5753). (F) Los ratones UCMS entraron significativamente menos veces en la zona de olor para TMT, y tendieron a FU (Grupo: F(1, 13) = 6.572, p = 0.0236; Olor: F(1, 13) = 3.784, p = 0.0737; Interacción: F(1, 13) = 0,2145, p = 0,6509). (G) El índice de preferencia de los ratones UCMS se reduce significativamente para FU y TMT (Grupo: F(1,13) = 6,808, p = 0,0216; Olor: F(1, 13) = 16.21, p = 0.0014; Interacción: F(1, 13) = 0,3304, p = 0,5753); (H) El índice de exploración de olores del UCMS se reduce significativamente para ambos olores (Grupo: F(1, 13) = 12.42, p = 0.0037; Olor: F(1, 13) = 0.002580, p = 0.9603; Interacción: F(1, 13) = 0,5804, p = 0,4598). (I) El índice de exploración de olores para FU y TMT tiende a correlacionarse positivamente con la puntuación de emocionalidad de los animales (FU: Pearson R² = 0.2573, F(1, 13) = 4.504, p = 0.0536; TMT: Pearson R² = 0,2266, F(1, 13) = 3,809, p = 0,0729). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Sesgo olfativo negativo en un modelo de ratón macho CORT de depresión. (A,B) Cronología y grupos experimentales del estudio: Los ratones machos Veh y CORT se prueban en la prueba de preferencia olfativa con un olor neutro (OCT: trans-2-octenal, 1% en agua), positivo (PO: aceite de cacahuete, puro) y negativo (TMT: 2,4,5-trimetiltiazol, 5% en aceite mineral). A los ratones Veh y CORT se les administra la solución Vehicle y Vehicle + Corticosterona, respectivamente, durante toda la duración del experimento. Creado con Biorender. (C) Tiempo promedio de permanencia en las diferentes zonas de la arena durante la habituación (Grupo: F(1, 10) = 0,07588, p = 0,7886; Zona: F(2.224, 22.24) = 6.939, p = 0.0036; Interacción: F(3, 30) = 0,7033, p = 0,5575). (D) Distancia total recorrida durante la prueba de Habituación (Hab) y los diferentes olores (Grupo: F(1, 10) = 4.193, p = 0.0678; Olor: F(3, 30) = 11.80, p < 0.0001; Interacción: F(3, 30) = 1,489, p = 0,2375). (E) Los ratones CORT pasan menos tiempo en la zona de olor que Veh para OCT y PO (Grupo: F(1, 10) = 5.094, p = 0.0476; Olor: F(2, 20) = 28.87, p < 0.0001; Interacción: F(2, 20) = 3,841, p = 0,0388). (F) Los ratones CORT entran menos veces en la zona de olor o tienden a ella en comparación con Veh (Grupo: F(1, 10) = 6,832, p = 0,0259; Olor: F(2, 20) = 2.738, p = 0.0889; Interacción: F(2, 20) = 0,2902, p = 0,7512). (G) Los qmice de CORT muestran un índice de preferencia más bajo para OCT y PO (Grupo: F(1, 10) = 5.895, p = 0.0356; Olor: F(2, 20) = 20.83, p < 0.0001; Interacción: F(2, 20) = 1,437, p = 0,2611). (H) El índice de exploración de olores se reduce significativamente en los ratones UCMS para todos los olores (Grupo: F(1, 10) = 12.35, p = 0.0056; Olor: F(2, 20) = 0.04381, p = 0.9572; Interacción: F(2, 20) = 0,3622, p = 0,7006). (I) El índice de exploración de olores para cada olor se correlaciona positivamente con la puntuación de emocionalidad de los animales (OCT: Pearson R² = 0.5601, F(1, 10) = 12.73, **p = 0.0051; PO: Pearson R² = 0,4495, F(1, 10) = 8,165, *p = 0,0170; TMT: Pearson R² = 0,5061, F(1, 10) = 10,25, **p = 0,0095). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Nombre	Abreviatura	Dilución	Valencia
2,4,5-trimetiltiazol	TMT	5% en aceite mineral	Negativo
2-transoctenal	OCT	1% en agua	Neutral
Orina de ratón hembra	FU	Puro	Positivo
Orina de ratón macho	MU	Puro	Positivo
Aceite de cacahuete	PO	Puro	Positivo

Tabla 1: Ejemplos de olores con valencia neutra, positiva y negativa.

Ficha complementaria 1: Protocolo para el estrés crónico leve impredecible de 4 semanas. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

El sesgo emocional negativo es una característica importante de los trastornos depresivos y es de particular interés para comprender mejor la fisiopatología de la enfermedad. Por lo tanto, es crucial incluir la evaluación de los sesgos sensoriales en modelos preclínicos para mejorar la caracterización del fenotipo depresivo e investigar qué mecanismos biológicos subyacen al procesamiento emocional y sus alteraciones en condiciones patológicas. Además, el olfato es un sentido de elección para estudiar los sesgos emocionales. Desde una perspectiva traslacional, es ettológicamente relevante evaluar el procesamiento emocional tanto en ratones como en humanos. Además, los sistemas olfativo y emocional están muy entrelazados y comparten estructuras neuronales comunes a lo largo de la evolución. Existe una fuerte relación recíproca entre el deterioro del olfato y la depresión¹⁰, lo que hace que el olfato sea una herramienta prometedora y poderosa para ser utilizada para el diagnóstico y la respuesta al tratamiento, así como en la investigación fundamental.

Aquí, desarrollamos un protocolo para una prueba de preferencia olfativa para evaluar los sesgos emocionales olfativos en dos modelos de ratón de depresión. Es importante destacar que este método permite evaluar la respuesta a una gran variedad de estímulos con valencia variable, tanto positivos como negativos, así como a estímulos neutros que podrían cambiar de valor en condiciones patológicas. Estos estímulos posteriores no son obligatorios para la validez de la prueba, pero pueden aportar información adicional interesante al experimento. Esta prueba también permite evaluar la escalabilidad de la respuesta mediante el uso de diferentes concentraciones de olor. Es crucial evaluar la respuesta a estímulos con diferentes valores hedónicos y separar el procesamiento emocional positivo del negativo en el contexto de la depresión. De hecho, los resultados preclínicos indican que el tratamiento con antidepresivos puede no restaurar uniformemente el procesamiento olfativo igualmente positivo y negativo¹⁴. La exploración espontánea de estímulos olfativos apetitivos o aversivos innatamente destacados también previene los factores de confusión de los déficits cognitivos o motivacionales asociados con estados similares a los depresivos^30,31. Por lo tanto, este protocolo no requiere largas fases de aprendizaje, lo que tiene beneficios técnicos. Es importante tener en cuenta que ambos modelos utilizados en este estudio se basan en intervenciones llevadas a cabo en la edad adulta, por lo que se requerirán experimentos futuros para evaluar si este protocolo también es sensible a la evaluación de otros factores de riesgo de depresión, incluida la adversidad en la vida temprana.

Es importante destacar que este protocolo es aplicable tanto para hombres como para mujeres, lo cual es fundamental ya que las mujeres tienen el doble de probabilidades de verse afectadas por la depresión que los hombres. Sin embargo, es probable que los hombres estén infradiagnosticados de depresión debido a las expectativas sociales, la vergüenza o el estigma, como se revisa en Shi et ^al.32. Sin embargo, la depresión parece diferir entre hombres y mujeres, en términos de sintomatología (manifestaciones clínicas), etiología (causas biológicas) y predicción del tratamiento 33,34,35, sin embargo, muchos modelos y pruebas de depresión todavía están diseñados principalmente para sujetos masculinos solamente. Por ejemplo, la prueba estándar de olfateo de orina femenina²⁴ utiliza un protocolo similar, pero se basa en una señal de olor social única. Aunque muy informativa, esta prueba da como resultado un tiempo de exploración corto (30 s en los controles) y está adaptada principalmente a ratones machos, ya que la orina de las hembras no tiene el mismo significado etológico y hedónico para ambos sexos. Por último, parece que la respuesta olfativa hedónica es sensible al tratamiento antidepresivo¹⁴, lo que convierte a nuestro test en una herramienta de elección para caracterizar de forma fiable estados similares a los depresivos, sustituyendo a otros ensayos controvertidos como el test de natación forzada 36,37,38.

Es importante destacar que la prueba da como resultado tiempos de exploración de estímulos más largos (100-200 s) en comparación con las pruebas descritas anteriormente 21,22,23. El aumento de la duración de la exploración es particularmente importante cuando esta prueba se combina con técnicas de monitoreo en vivo de la actividad neuronal, por ejemplo. Además, esta prueba no requiere privación de alimentos/agua, evitando factores de confusión metabólicos. Finalmente, esta prueba se puede realizar durante el período de luz, reduciendo las restricciones experimentales (ciclo inverso, registros infrarrojos).

Sin embargo, para llevar a cabo este protocolo con éxito, algunos pasos técnicos son críticos. En primer lugar, es esencial que los experimentos se realicen en un entorno muy controlado y no estresante: la iluminación debe ser homogénea y no ser demasiado brillante, y no debe haber sonidos ni olores molestos en la habitación. Los ratones se pueden probar en la arena una vez al día, y la prueba debe realizarse aproximadamente a la misma hora todos los días. Además, se recomienda un experimentador único al realizar estos experimentos para reducir el estrés de los animales.

En segundo lugar, se debe asegurar una exploración suficiente de la arena a través de días de habituación. Si un ratón pasa menos de 50 s en promedio en cualquiera de las zonas donde se colocan placas de Petri durante la habituación, se pueden agregar uno o dos días adicionales de habituación antes de probar los olores. Si el ratón aún no está explorando la arena el tiempo suficiente, debe excluirse del análisis. En el caso de una exploración inicial disimétrica de la "zona de olor" durante la habituación entre grupos experimentales, el cálculo del índice de preferencia puede adaptarse para corregir los sesgos de preferencia espontáneos diferenciales, por ejemplo, normalizando por el tiempo empleado durante la habituación con respecto a cada grupo, o incluso con respecto a su propia exploración durante la habituación. De hecho, otra dificultad puede ser la alta variabilidad entre los grupos experimentales. Si surge el problema, para limitar la variabilidad intraindividual, los ratones pueden ser probados en dos días consecutivos con el mismo olor. Los resultados se pueden promediar entre los dos días. Es importante destacar que las pruebas consecutivas de la respuesta olfativa no se supone que afecten significativamente el comportamiento exploratorio¹⁴.

Con respecto a la preparación de olores, las soluciones deben prepararse en una habitación diferente a la de la prueba, y los experimentadores deben ser conscientes de que la solución no se difunde excesivamente en la sala de comportamiento. Por último, es preferible que las soluciones se preparen poco antes de la prueba y se almacenen en un vial de vidrio antiolor para que el olor no se desvanezca ni se contamine. Para algunos olores como la orina de ratón macho y hembra que supuestamente son muy apetecibles, si los ratones de control no presentan lecturas de exploración asociadas con valencia altamente positiva, se debe verificar la solución. En particular, la orina de ratón debe recogerse recién recolectada de ratones jóvenes (máximo 5 meses de edad) poco antes de la prueba (máximo 2-3 días antes) y almacenarse a 4 °C para preservar las propiedades olfativas. Cabe destacar que la recolección durante varios días consecutivos debería prevenir los efectos debidos a las etapas del ciclo estral en ratones hembra. Si es necesario, la orina puede mantenerse a -20 °C para su almacenamiento a largo plazo, aunque este procedimiento no se recomienda ya que reduce sensiblemente la intensidad del olor. Del mismo modo, el placer percibido del aceite de maní también puede ser variable, dependiendo del lote o la marca, por ejemplo. Es importante destacar que se pueden agregar dos olores distintos u olores con diferentes concentraciones en los compartimentos, en lugar de la "zona de control" sin odorante, para medir la preferencia entre dos soluciones odorantes.

Por último, el test de preferencia olfativa puede adaptarse de diversas maneras para mejorar su diseño y ampliar sus posibles aplicaciones. De hecho, aparte de la lectura motora, la evaluación de la respuesta emocional a través de esta prueba podría mejorarse combinando diferentes técnicas para medir diversos componentes de las emociones⁶. Por ejemplo, se puede colocar un micrófono de ultrasonido al lado de la arena para registrar vocalizaciones ultrasónicas, que pueden ser emitidas en respuesta a ciertos estímulos positivos y negativos ^24,39. La temperatura corporal también se puede controlar mediante una cámara infrarroja o un transmisor de telemetría en tiempo real implantable 40,41,42. Algunos de estos transmisores son incluso capaces de acceder a las frecuencias cardíacas y respiratorias 43,44,45. La combinación de estas herramientas ayudaría a construir una evaluación conductual más refinada de la respuesta emocional. La prueba de preferencia olfativa también se puede combinar fácilmente con otras técnicas para dilucidar aún más los mecanismos neuronales detrás de la desregulación emocional, como la optogenética, la fotometría de fibra o las imágenes en vivo con miniscopio o los registros de electrofisiología in vivo. Por último, este protocolo se puede trasladar fácilmente a la clínica integrando la evaluación de los sesgos sensoriales y la respuesta olfativa hedónica en la investigación en humanos e incluso como herramienta de respuesta diagnóstica o de tratamiento.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
2,4,5-trimetiltiazol	Sigma-Aldrich	W332518-100G-K
2-trans octenal	Sigma-Aldrich	52464-1ML
Blu-tack	UHU	N/A
Papel de filtro	Fisher Scientific	11710125	42,5 milímetros
Vial de vidrio	DUTSCHER DOMINIQUE	958983
Aceite mineral	Sigma-Aldrich	M5904-500ML
Noldus Ethovision	Noldus Ethovision	Versión 17.5	Alternativamente, se podría usar Single Mouse Tracker en el software ICY de código abierto o Deeplabcut
Placa de Petri	Halcón	351007	Placa de Petri de 60 mm x 15 mm con 7 orificios hechos a medida de 5 mm de diámetro
Arena de plexiglás	Hecho a medida	N/A	Arena de plexiglás de 45 cm x 50 cm x 25 cm dividida en dos cámaras por una pared de 37 cm x 25 cm en el medio.