Generación de cocultivos de esferoides epiteliales y fibroblastos humanos normales que flotan libremente

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo simple y muy práctico pero confiable para el cocultivo esferoidal directo de células epiteliales pulmonares humanas y fibroblastos sin depender de una matriz.

Resumen

Los sistemas de cultivo tridimensionales (3D) se han vuelto cada vez más populares debido a su capacidad para reproducir las propiedades y arquitecturas celulares naturales, imitando así estructuras similares a tejidos in vitro. Entre estos modelos, el cultivo de agregados celulares esféricos (los llamados esferoides) embebidos en una matriz extracelular semisólida (ECM) representa un modelo avanzado de cultivo celular casi in vivo , ya que permite diferentes estados celulares funcionales como resultado de las interacciones célula-célula y célula-ECM, así como gradientes de oxígeno y nutrientes. Debido a que los esferoides son técnicamente menos exigentes y relativamente baratos de obtener, se utilizan con frecuencia en el cribado de fármacos y en las pruebas de toxicidad, lo que permite el cribado de alto contenido para probar nuevos fármacos en la fase preclínica. Para ello, se recrean predominantemente estructuras 3D de diversos tumores. Al mismo tiempo, Matrigel es actualmente uno de los ECM más utilizados y se considera el estándar de oro en el cultivo de esferoides y organoides, aunque se trata de una matriz 3D basada en experimentos con ratones, cuya extracción, al igual que la experimentación con animales en general, se asocia a importantes preocupaciones éticas. Aquí, presentamos un protocolo libre de matriz para el cocultivo esferoidal directo de células epiteliales bronquiales humanas y fibroblastos, que puede considerarse como un método de cocultivo optimizado, especialmente en lo que respecta a la comunicación epitelio-fibroblasto y las interacciones dentro de los respectivos esferoides, sin depender de una matriz portadora (de origen animal). Al establecer estos cocultivos de esferoides epitelio-fibroblastoides que flotan libremente como una plataforma in vitro orientada al paciente para modelar las toxicidades del tejido normal (pulmón) de los enfoques terapéuticos contra el cáncer, no solo se puede lograr una reducción en el número de animales de experimentación, sino también un reemplazo adecuado y significativo de los experimentos con animales correspondientes.

Introducción

Los cultivos celulares bidimensionales (2D), en los que se cultivan células monocapa planas, se expanden y luego se colocan en placas para ensayos de investigación basados en células, siguen siendo un método fácil, conveniente, rentable y ampliamente utilizado para los procedimientos estándar de detección preclínica ^1,2. Para estudiar la diafonía interactiva (paracrina) entre varios tipos de células in vitro, se puede utilizar un medio condicionado de un tipo de célula para la estimulación de otro tipo de célula. Además, surgieron varios métodos de cocultivo, por ejemplo, métodos indirectos, en los que las células cocultivadas se separan físicamente mediante una membrana microporosa. Estos "sistemas Transwell" incluyen un inserto (la membrana microporosa) que se coloca en una placa de cultivo celular 2D tradicional. A continuación, un tipo de célula se siembra y crece en la membrana, compartiendo el mismo medio que el otro tipo que crece en el pocillo compañero, lo que permite comunicaciones paracrinas^{bidireccionales 2}. Los dos tipos de células podrían incluso sembrarse en los dos lados de la membrana, formando más bien un cocultivo de contacto directo de célula a célula, que es adecuado para investigar tejidos con estructura de barrera ^3,4.

Sin embargo, las respuestas celulares de estos sistemas de cultivo celular 2D, incluso avanzados, no siempre reflejan los resultados de los correspondientes experimentos con animales e incluso de los estudios clínicos, lo que se debe, entre otras cosas, a la falta de señalización directa entre los diferentes tipos de células y, por lo tanto, a la falta de organizaciones celulares similares in vivo. Por lo tanto, los sistemas de cultivo tridimensionales (3D) se han vuelto cada vez más populares debido a las capacidades de las características y arquitecturas celulares similares a las naturales que imitan estructuras similares a los tejidos in vitro ^5,6. Entre estos modelos, el cultivo de agregados celulares esféricos, denominados esferoides, incrustados en matrices extracelulares semisólidas proporciona un modelo de cocultivo celular más avanzado en el que se pueden lograr diferentes estados celulares funcionales siguiendo las interacciones célula-célula y célula-ECM, así como gradientes de oxígeno y nutrición⁷. Estos deseados cultivos in vivo in vivo, cultivos in vitro más complejos, deben generarse y mantenerse homogéneos en cuanto a los tamaños de ensamblaje celular, al tiempo que promueven el desarrollo y la diferenciación celular, sin dejar de ser efectivos, rápidos, consistentes y convenientes ^7,8.

Utilizando las características naturales de autoagregación y adhesión, los esferoides (principalmente esferoides tumorales) se generan generalmente mediante la técnica de gota colgante ^9,10. Como una de las primeras técnicas utilizadas para generar cuerpos embrionarios, el ensayo de gota colgante se ha convertido en un método ampliamente utilizado para generar numerosos esferoides homogéneos basados en los principios de gravedad y tensión superficial antes de la inclusión de la ECM utilizando Matrigel, el "estándar de oro" de las matrices extracelulares, aunque esté basado en ratones. Se realizó un esfuerzo sustancial para generar esferoides en enfoques libres de andamios ^8,11. Por ejemplo, los esferoides se pueden generar utilizando una botella de cultivo celular con un agitador, evitando así la siembra de células, el método más simple para producir esferoides a gran escala¹².

Lo más difícil en la complejación de cultivos celulares y, por lo tanto, en el establecimiento de un sistema fisiológicamente valioso como alternativas in vivo in vitro en el laboratorio, son protocolos complejos con muchos pasos diferentes (que aún deben establecerse). Por ejemplo, generar estructuras celulares primero usando un método, cosecharlas y luego incrustarlas en una matriz, especialmente el uso de matrices que no son fáciles de manejar, son pasos críticos que requieren más convencimiento antes de que un método pueda usarse de manera rutinaria y en serie. En este caso, utilizamos una placa de fijación ultra baja en un formato de 96 pocillos, que prácticamente no permite la unión de células al material de cultivo para establecer esferoides 3D complejos de células epiteliales pulmonares y fibroblastos. Los esferoides resultantes se forman de forma muy uniforme y bastante rápida en 24 horas, lo que acorta la línea de tiempo experimental. El cultivo prolongado y, por lo tanto, el crecimiento y la diferenciación celulares confiables se llevan a cabo en el mismo pozo durante todo el período, de modo que después de la siembra inicial solo es necesario reemplazar el medio durante todo el período de cultivo. Por lo tanto, presentamos un protocolo muy simple, rápido y, por lo tanto, altamente práctico para generar esferoides pulmonares humanos que replican morfológica y funcionalmente el epitelio de la vía aérea a niveles casi fisiológicos. Otra ventaja es que este protocolo se puede adaptar fácilmente a otras células.

Protocolo

Todos los pasos se realizan en condiciones estériles (cabina de bioseguridad). Para conocer las composiciones de medios utilizadas en este estudio, consulte la Tabla 1.

1. Preparación del material experimental

1. Cultivo y expansión de células epiteliales pulmonares humanas normales (HBEC3-KT) en placas de cultivo celular de plástico estándar (matraces T75) en medio de crecimiento epitelial normal utilizando una incubadora estándar¹³ (ver Tabla 1).
   NOTA: Para mejorar el crecimiento, el medio se puede complementar adicionalmente con un 10% de suero de ternera fetal (FCS).
2. Cultivo de fibroblastos humanos (HS-5) en medio RPMI suplementado con suero fetal de ternero al 10% y penicilina/estreptomicina^10,14 (ver Tabla 1).
3. Prepare el medio organoide pulmonar ramificado (medio BLO) suplementando DMEM/F12 con N-2, B27, penicilina-estreptomicina, albúmina sérica bovina, monotioglicerol, ácido ascórbico, KGF/FGF7, FGF10, ATRA y CHIR99021. (ver Tabla 1 y Tabla de Materiales).
   NOTA: Se recomienda preparar el medio fresco, al menos con la adición de KGF/FGF7, FGF10, ATRA y CHIR99021. Si se necesita más medio en un corto período de tiempo, solo se recomienda un breve período de almacenamiento de unos pocos días (hasta 1 semana) a 4 °C. Alternativamente, se puede utilizar el medio de diferenciación de organoides de las vías respiratorias PneumaCult disponible en el mercado.

2. Preparación de células epiteliales y fibroblastos

NOTA: Utilice ambos tipos de celdas cuando las celdas alcancen alrededor del 80% de confluencia. Prepare cada tipo de celda por separado.

1. Retire y deseche el medio de cultivo.
2. Lave las células enjuagando brevemente la capa celular con 5 mL de PBS.
3. Tripsinizar las células epiteliales añadiendo 2 mL de tripsina-EDTA al 0,5%, seguido de una breve incubación a 37 °C durante 4-8 min.
4. Extraiga células redondeadas y casi desprendidas mediante la adición de medios de crecimiento normales o PBS suplementados con FCS al 10% utilizando una pipeta serológica de 5 mL.
5. Pipetear el volumen adecuado hacia arriba y hacia abajo varias veces en el matraz T75 (a lo largo de la superficie de crecimiento) para separar aún más los grupos de células y transferir la suspensión celular a un tubo de 15 mL.
6. Coseche los fibroblastos HS5 respectivamente utilizando la tripsinización TE a 37 °C durante 3-5 min.
7. Granular cada tipo de célula (y, por lo tanto, libre de tripsina) por centrifugación (por ejemplo, 300-400 × g durante 5 minutos a temperatura ambiente [RT]) y resuspender (tanto las células epiteliales como los fibroblastos) en 1-2 mL de medio de crecimiento epitelial normal antes del recuento.
8. Determinar el número de células viables utilizando un volumen adecuado de células resuspendidas; cada uno diluido 1/5 usando tinción de azul de tripán al 0,4% en una cámara de recuento de Neubauer bajo un microscopio.

3. Generación de cultivos epiteliales de fibroblastos esferoides 3D

1. Diluya el número deseado de células en un medio de crecimiento epitelial normal utilizando un tubo de 15 ml. Calcule 2000 células epiteliales con 50 fibroblastos en 100 μL de medio para cada pocillo de las placas de 96 pocillos. El número de células resultante adecuado para una placa de 96 pocillos es de 200.000 células HBEC y 5.000 fibroblastos HS5 en 10 mL de medio de crecimiento epitelial normal.
2. Mezclar suavemente con pipetas serológicas estériles de 10 mL.
3. Transfiera la suspensión celular a un depósito de reactivo estéril para obtener una micropipeta multicanal.
4. Siembre las células en una placa de fijación ultrabaja transfiriendo 100 μL de la suspensión celular a cada pocillo utilizando una pipeta multicanal (12 canales).
5. Incubar en condiciones estándar de cultivo celular a 37 °C y 5% de CO₂ en una atmósfera humidificada.
   NOTA: La formación de esferoides se evalúa mediante un examen microscópico regular con un microscopio invertido y fotografiando esferoides para cada punto de tiempo deseado.
6. Después de 4 días, agregue 100 μL de medio BLO-por pocillo a los esferoides generados.
7. Incubar más a fondo en condiciones estándar de cultivo celular a 37 °C y 5% de CO₂ en una atmósfera humidificada.

4. Realizar un cambio regular de medios

1. Después de 7-8 días, realice un cambio de medio regular. Por lo tanto, coloque la placa en un ligero ángulo para que los esferoides se hundan en la dirección de inclinación de acuerdo con la gravedad.
2. Aspire el sobrenadante con cuidado y lo mejor posible con una punta de pipeta de 100-200 μL.
3. Vuelva a colocar la placa horizontalmente y llénela con 100-150 μL de medio BLO por pocillo (utilizando una pipeta multicanal)
4. Incubar más a fondo en condiciones estándar de cultivo celular a 37 °C y 5% de CO₂ en una atmósfera humidificada o iniciar un experimento/tratamiento.
   NOTA: Los esferoides se pueden cultivar durante períodos más largos (hasta 21 días). Luego, se debe realizar un cambio completo de medio al menos dos veces por semana.

5. Análisis posteriores (recolección de esferoides)

1. Realice exámenes y documentación microscópica regulares tomando fotos en combinación con mediciones de tamaño de esferoides y cálculos de volumen, lo que finalmente permite cuantificar el crecimiento de esferoides y las posibles alteraciones del crecimiento después de los tratamientos.
2. Para obtener imágenes de células vivas en los puntos de tiempo deseados, incube los esferoides durante 15 minutos adicionales con 1 μg/mL de Hoechst 33342 (o DAPI) para la tinción de núcleos y analícelos mediante microscopía de fluorescencia.
3. La recolección generó esferoides en el punto de tiempo deseado utilizando una pipeta de 200 μL con la salida cortada (mantener estéril) para aumentar el diámetro. Por lo tanto, aspire también el medio que contiene el esferoide. Combine y recoja los esferoides en un tubo de 2-5 mL. Después de 2-5 minutos, cuando los esferoides se hayan hundido debido a la gravedad, retire el sobrenadante y proceda al análisis aguas abajo.
4. Para la generación de lisados de proteínas esferoides enteros, añadir directamente tampón de lisis helado (150 mmol/L de NaCl, 1% de NP40, 0,5% de desoxicolato de sodio, 0,1% de dodecilsulfato de sodio, 50 mmol/L de Tris/HCl, pH 8, suplementado con un cóctel de inhibidores de la proteasa) al tubo que contiene los esferoides cosechados. Después de dos o tres ciclos de congelación y descongelación, determine el contenido de proteínas de los lisados y proceda al análisis posterior, por ejemplo, el análisis de Western blot¹⁵.
5. Para la generación de lisados de ARN de esferoides completos, agregue directamente tampón de lisis de ARN al tubo que contiene los esferoides recolectados y realice el aislamiento del ARN de acuerdo con las instrucciones del fabricante del respectivo kit de aislamiento de ARN utilizado.
6. Para la inmunohistoquímica (IHQ) y la tinción de inmunofluorescencia, siga los pasos 5.6.1-5.6.3.
   1. Tratar los esferoides cosechados con 1-2 mL de solución salina tamponada (PBS) con paraformaldehído/fosfato al 4% durante 30 min y posteriormente someterlos a inclusión y corte en parafina (3-5 μm).
   2. Antes de la tinción inmunofluorescente, prepare las muestras utilizando una serie descendente de alcohol e incube con una solución de recuperación de diana. A continuación, bloquee los portaobjetos con una solución bloqueante (suero de cabra normal al 2%/PBS) para reducir las interacciones inespecíficas e incube los anticuerpos primarios durante la noche a 4 °C.
   3. Detección de antígenos mediante anticuerpos secundarios marcados con fluorescencia. Contratinción de núcleos con DAPI. Realice tinciones adicionales (p. ej., kit de tinción PAS) de acuerdo con los protocolos del fabricante para la evaluación histológica.
7. Para suspensiones de una sola celda, siga los pasos 5.7.1 y 5.7.2.
   1. Vuelva a suspender los esferoides recolectados en 1-2 mL de TrypLE que contenga 100 U/mL de DNasa I, seguido de una incubación de 15 min a 37 °C. Detenga la digestión agregando PBS que contenga 2-5% de FCS, 2 mM de EDTA y ADNasa I.
   2. Pase la solución celular a través de un filtro de células de 70 μm a un tubo cónico nuevo antes del análisis posterior (por ejemplo, citometría de flujo o análisis de células individuales).
8. Para el análisis de secuenciación de ARN de una sola célula, siga los pasos 5.8.1-5.8.3.
   1. Etiquete las diferentes suspensiones de una sola célula de interés que representan diferentes puntos de tiempo o tratamientos utilizando un kit de multiplexación de una sola célula (humano) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
   2. Combine las muestras después y cárguelas en un carril en un cartucho de una sola celda con el objetivo de 10.000-40.000 celdas.
   3. Recupere células individuales, realice la transcripción inversa y la preparación de la biblioteca de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y secuencie el ARN aislado.

Resultados

Este sencillo protocolo permite el cocultivo esferoidal sin matriz de células epiteliales bronquiales humanas y fibroblastos en combinación con placas de fijación ultrabajas (Figura 1A). Durante el proceso de cultivo, se forman gradualmente esferoides pulmonares más complejos a partir de los esferoides generados inicialmente, con la generación eficiente de diferentes estructuras epiteliales y fibroblásticas que representan interacciones celulares directas, según lo revelado por los análisis ...

Discusión

Se han propuesto modelos de cultivo celular en 3D para cerrar la brecha entre los cultivos en 2D y los estudios in vivo, ya que este tipo de cultivo (co) imita mejor las propiedades fisiológicas, morfológicas y patológicas presentes in vivo porque están presentes más interacciones célula a célula, interacciones célula-ECM, respuestas a estímulos, expresión génica, expresión de proteínas y diferenciación^{17, Ar...}

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Pipetas serológicas estériles de 10 ml	ThermoFischer	170356N	Pipetas serológicas estériles Nunc, o
tubo cónico equivalente de 15 ml	Corning	430052	o equivalente
de 37 &grados; C/ 5% CO2 humidificado  incubadora
de 5 ml de pipetas serológicas estériles	ThermoFischer	170355N	Pipetas serológicas estériles Nunc, o
tubo cónico equivalente de 50 mL	Corning	CLS430829	o
equivalente ATRA (All-Trans Retinoic Acid)	StemCell Technologies	Cat#72262
Suplemento B-27 de 50 nM (50x),	ThermoFischer/Gibco	Cat#17504044	1x
BD Rhapsody WTA Amplification Kit	BD Bioscience	Cat#633801	usar según las instrucciones del fabricante
Cabina
Albúmina de suero bovino	Roche	Cat#BSAVHS-RO	0.4% (v/v)
Colador celular	Corning	352350	Falcon 70 µ m Filtro de células, blanco, estéril, empaquetado individualmente
Centrífuga	Eppendorf	https://www.fishersci.com/shop/products/eppendorf-5804-series-centrifuge-rotor-packages-9/p-4119001	por ejemplo, Centrífuga Eppendorf 5804 - Centrífuga de sobremesa
DMEM/F12	Invitrogen	Cat#11330-032	500 mL
DNasa I, libre de ARNasa (1  U/μ L)	ThermoFischer	Cat#EN0521	100 U/mL
EDTA (0,5 M), pH 8,0,	ThermoFischer	AM9260G	2 mM
Eppendorf Research más pipeta multicanal de 12 canales	Eppendorf		, por ejemplo, #3125000044 (10– 100 µ L) o #3125000060 (30– 300 µ L)
Suero fetal de ternero	ThermoFischer/Gibco	Cat#A5256701	10% (v/v)
HBEC3-KT	ATCC	CRL-4051	línea celular epitelial de pulmón normal humano
Solución de heparina (0.2%)	StemCell Technologies	Cat#7980	0.8 mL
Hoechst 33342	ThermoFischer	Cat#H1399	1 µ g/mL
HS-5	ATCC	CRL-3611	fibroblastos estromales humanos
Hu Recom FGF-10 (KGF-2) ACF	StemCell Technologies	Cat#78173.1	10 ng/mL
Hu Recom FGF-7 (KGF) ACF	StemCell Technologies	Cat#78186.1	10 ng/mL
	BD Bioscience	Cat#633781	usar de acuerdo con las instrucciones del fabricante
Solución madre de hidrocortisina	StemCell Technologies	Cat#7926	0.5 mL por 500 mL
Laduviglusib (CHIR-99021)	Biozol/Selleckchem	Cat#S1263	3 µ
Ácido L ascórbico	M Sigma-Aldrich	Cat#A92902	50 µ g/mL
Microscopio	ZEISS
Monotioglicerol	Sigma-Aldrich Cat	#M6145	0.4 µ Suplemento
M N-2 (100x)	ThermoFischer/Gibco	Cat#17502048	1x
Cámara de conteo Neubauer	Merck BR718605		por ejemplo, MARCA  cámara de escrutinio BLAUBRAND  Patrón de Neubauer
Suero de cabra normal	ThermoFischer	Cat#31873	2 % (v/v) en PBS
NP-40	Merck/Millipore	Cat#492016	NP-40-Alternative, 1 %
PAS Kit de tinción	Sigma Aldrich	Cat#1016460001	usar según las instrucciones del fabricante
PBS	ThermoFischer	Cat#10010023	1x
Penicilina-Estreptomicina (10.000  U/mL), 100x	ThermoFischer/Gibco	Cat#15140122	1x
PFA	ThermoFischer	Cat#J61899.	AK Paraformaldehído, 4 % en PBS
PneumaCult Airway Organoid Differentiation Medium (ODM)	StemCell Technologies	Cat#05060	PneumaCult Airway Organoid Organoid Basal Medium (#05061, 360 mL) y PneumaCult Airway Organoid Differentiation Supplement* (#05063, 40 mL)
PneumaCult Ex Plus Medium	StemCell Technologies	Cat#5040	Kit compuesto por PneumaCult-Ex Plus Basal Medium (#05041, 490 mL) y PneumaCult-Ex Plus 50X Supplement*(#05042, 10 mL)
Cóctel inhibidor de proteasa	Merck/Roche	Cat#4693132001	1 tab/10 mL
Rhapsody cDNA Kit	BD Bioscience	Cat#633773	utilizar según las instrucciones del fabricante
RPMI 1640 Medium	ThermoFischer/Gibco	Cat#11875093	500 mL
Cloruro de sodio	Merck/Sigma-Aldrich	S9625	150 mmol/L
Citrato de sodio	Merck/Sigma-Aldrich	Cat#1613859-1G	0.10%
Desoxicolato de sodio	Merck/Sigma-Aldrich	Cat#30970	0.50%
Sulfato de dodecilo de sodio	Merck/Sigma-Aldrich	Cat#11667289001	0,10%
Depósito de reactivo estéril para micropipeta multicanal (p. ej., 60 ml)	ThermoFischer	9510037	o
equivalente TC-Platte 96well BIOFLOAT a 4 Stü ck	Sarstedt (o facellitate)	83.3925.400 (o F202003)	placa de fijación ultrabaja
Tris/HCl	ThermoFischer	Cat#AM9855G	50 mmol/L , pH 8
Triton  X-100	Sigma-Aldrich	Cat#X100-5ML	0.05 %
Tinción azul de tripano (0,4%)	ThermoFischer	Cat#15250061	1/5 (v/v) con NGM
TrypLE	ThermoFischer	Cat#12604013	1x
tripsina-EDTA (0,5%)	ThermoFischer	Cat#15400054	solución de tripsina-EDTA (TE) al 0,05 % diluida asépticamente a 1X utilizando solución salina tamponada con fosfato (sin calcio ni magnesio)
Reactivo WST-1	CELLPRO-RO, Roche	Cat#5015944001	reactivo de proliferación celular