Comprensión de los cambios en la morfología mitocondrial a través de micrografías de fluorescencia dinámicas y tridimensionales

Summary

Aquí describimos el localizador de eventos mitocondriales (MEL), un complemento de ImageJ útil en la cuantificación de los cambios tridimensionales en la actividad de fisión y fusión mitocondrial a lo largo del tiempo. También describimos una tubería de procesamiento de imágenes útil para la limpieza de micrografías antes del análisis en ImageJ.

Abstract

Las mitocondrias son orgánulos altamente dinámicos que son vitales para la supervivencia de cualquier animal, que experimentan eventos regulares de fisión y fusión en respuesta a las necesidades o tensiones del huésped, lo que lleva a la remodelación constante de la red mitocondrial. Debido a esto, poder evaluar la red mitocondrial en tres dimensiones, así como a lo largo del tiempo, ofrece un beneficio para comprender cómo responde el sistema a factores como el estrés o la intervención farmacéutica. Las imágenes de fluorescencia de las redes mitocondriales de las células permiten visualizar y monitorear estos cambios. Sin embargo, la red mitocondrial a menudo se describe como una estructura bidimensional y estática que se define por métricas no estandarizadas. Por lo tanto, nos propusimos describir una tubería que permite al usuario preparar sus imágenes para el localizador de eventos mitocondriales (MEL), una herramienta de complemento de ImageJ que detecta eventos de fisión y fusión en la red mitocondrial a lo largo del tiempo y de manera tridimensional, ofreciendo así información sobre los cambios dinámicos que sufre esta red. Además, describimos los beneficios de comprender la fisión y la fusión a la luz de los cambios en el recuento mitocondrial y los cambios morfológicos.

Introduction

Las mitocondrias son orgánulos altamente dinámicos presentes en todas las células eucariotas, que les proporcionan energía y regulan su metabolismo. Por lo tanto, las mitocondrias se encuentran en la encrucijada de la muerte celular y la supervivencia. Se ha demostrado que las mitocondrias son esenciales para una variedad de procesos, que van desde la acidificación lisosomal y la acción motora molecular hasta la contracción muscular y la activación de sinapsis ^1,2.

Las mitocondrias se someten a eventos regulares de fisión y fusión para mantener una ....

Protocol

1. Tratamiento celular y adquisición de microscopía

1. Cultive las células GT1-7 en placas de 8 cámaras en DMEM suplementadas con 10% de FBS y 1% de Penstrep (medios completos). Deje que las células se adhieran durante la noche y luego trátelas con clorhidrato de metformina 2,5 mM hecho en DMEM con FBS al 10% durante 72 h, asegurándose de reemplazar el medio cada 24 h. Cotratar las células con 10 μM de CCCP 6 h antes de la obtención de imágenes y 400 nM de bafilomicina A1 (Baf) 4 h antes de la obtención de imágenes.
   NOTA: Esto se puede hacer con cualquier línea celular eucariota de su elección.
2. A....

Results

Selección de celdas apropiadas
Los usuarios deben tener en cuenta que la red mitocondrial cambia según el estado mitótico de la célula. Si el núcleo parece en forma de mancuerna o U, o si hay un espacio cerca del núcleo con falta de señal de fluorescencia, esto puede indicar que la célula se está acercando a la mitosis. En este estado, es probable que las mitocondrias sufran fisión debido a la división celular y no debido a la intervención del tratamiento y su efecto en la red (Figura compleme.......

Discussion

Aunque existe un número creciente de enfoques para describir la morfología mitocondrial, existen técnicas limitadas para capturar adecuadamente la dinámica mitocondrial de manera cuantitativa. Además, debe tenerse en cuenta que la morfología de la red mitocondrial, así como los mecanismos que gobiernan esta morfología, son de naturaleza variada. Esto da como resultado redes que están vinculadas a las necesidades de la célula, que van desde una formación ramificada para mejorar la producc.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Platos de 8 cámaras	ThermoFisher	#Z734853
Umbral ajustado			https://sites.google.com/site/qingzongtseng/adaptivethreshold
Bafilomicina A1	Laboratorios LKT	#B0026
Clorofenilhidrazona de cianuro de carbonilo (CCCP)	Merck	#C2759
Microscopio confocal	Carl Zeiss AG		Plataforma de superresolución LSM780 ELYRA PS.1
Medio Eagle modificado (DMEM) de Dulbecco	ThermoFisher	#341956062
Suero fetal bovino (FBS)	Sigma-Aldrich	#F0679
Enlace de Github			https://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin
GraphPad Prism v7.06
Celdas GT1-7	ATCC	SCC116
Hoecsht	Sigma-Aldrich	H6024
ImageJ v1.53t	Fiji
Macros			https://github.com/rensutheart/FMPP/tree/master/Sections
Metformina	Farmacopea Europea	M06050000
Penicilina/estreptomicina (PenStrep)	Sigma-Aldrich	#P4333
T25	Científico Bio-Smart	#70025
TMRE	ThermoFisher	#T669
Tripsina	Sigma-Aldrich	#T4049