Artículo de método

Comprensión de los cambios en la morfología mitocondrial a través de micrografías de fluorescencia dinámicas y tridimensionales

DOI:

10.3791/68478

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15 de agosto de 2025

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1Department of Physiology, Stellenbosch University, 2Department of Biochemistry, University of Toronto, 3Department of Electrical and Electronic Engineering, Stellenbosch University

En este artículo

Resumen

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Aquí describimos el localizador de eventos mitocondriales (MEL), un complemento de ImageJ útil en la cuantificación de los cambios tridimensionales en la actividad de fisión y fusión mitocondrial a lo largo del tiempo. También describimos una tubería de procesamiento de imágenes útil para la limpieza de micrografías antes del análisis en ImageJ.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las mitocondrias son orgánulos altamente dinámicos que son vitales para la supervivencia de cualquier animal, que experimentan eventos regulares de fisión y fusión en respuesta a las necesidades o tensiones del huésped, lo que lleva a la remodelación constante de la red mitocondrial. Debido a esto, poder evaluar la red mitocondrial en tres dimensiones, así como a lo largo del tiempo, ofrece un beneficio para comprender cómo responde el sistema a factores como el estrés o la intervención farmacéutica. Las imágenes de fluorescencia de las redes mitocondriales de las células permiten visualizar y monitorear estos cambios. Sin embargo, la red mitocondrial a menudo se describe como una estructura bidimensional y estática que se define por métricas no estandarizadas. Por lo tanto, nos propusimos describir una tubería que permite al usuario preparar sus imágenes para el localizador de eventos mitocondriales (MEL), una herramienta de complemento de ImageJ que detecta eventos de fisión y fusión en la red mitocondrial a lo largo del tiempo y de manera tridimensional, ofreciendo así información sobre los cambios dinámicos que sufre esta red. Además, describimos los beneficios de comprender la fisión y la fusión a la luz de los cambios en el recuento mitocondrial y los cambios morfológicos.

Introducción

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Las mitocondrias son orgánulos altamente dinámicos presentes en todas las células eucariotas, que les proporcionan energía y regulan su metabolismo. Por lo tanto, las mitocondrias se encuentran en la encrucijada de la muerte celular y la supervivencia. Se ha demostrado que las mitocondrias son esenciales para una variedad de procesos, que van desde la acidificación lisosomal y la acción motora molecular hasta la contracción muscular y la activación de sinapsis 1,2.

Las mitocondrias se someten a eventos regulares de fisión y fusión para mantener una red mitocondrial que produce ATP de manera eficiente en respuesta a la demanda metabólica y el estrés de la célula. De hecho, se ha demostrado que las mitocondrias sufren fisión para facilitar la mitofagia, la eliminación selectiva de fragmentos mitocondriales. Por lo tanto, solo quedan en el sistema celular mitocondrias que respiran activamente y no están despolarizadas 3,4. La fusión, sin embargo, ocurre como un medio para aumentar la producción de ATP de la red en caso de que haya una mayor necesidad 5,6. Además, también se ha demostrado que tanto la fisión como la fusión juegan un papel importante en la partición y protección del ADN mitocondrial 7,8. Cabe señalar que el alcance de la fisión y la fusión requiere un control homeostático cuidadoso para garantizar una red mitocondrial saludable, ya que se ha demostrado que demasiado o muy poco de cualquiera de los procesos es perjudicial.

Se ha demostrado que la fisión excesiva conduce a una red mitocondrial fragmentada con la consiguiente disminución de los niveles de ATP en la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson y las tauopatías 9,10,11, y los niveles bajos de fisión pueden conducir a una acumulación de mitocondrias despolarizadas, lo que lleva a síntomas similares a los de la enfermedad de Parkinson 12. Se sabe que la hiperfusión de la red ocurre en momentos de estrés para aumentar la producción de ATP. Sin embargo, se ha demostrado que existir en este estado durante períodos prolongados de tiempo aumenta los niveles de ROS y la actividad de autofagia, lo que resulta en el inicio de la muerte celular 9,12.

Por lo tanto, queda claro que comprender el estado de la red mitocondrial ofrece información clave para comprender el estado de la célula y, por lo tanto, del organismo. La clara importancia de comprender la red mitocondrial en el contexto de la salud y la enfermedad, su capacidad para sufrir eventos de fisión y fusión, y su impacto en la salud celular es lo que ha motivado el desarrollo de este protocolo y las herramientas de análisis asociadas. Específicamente, las herramientas que permiten la caracterización de la dinámica mitocondrial son en gran medida limitadas y mal descritas en la literatura.

La morfología mitocondrial generalmente se determina mediante microscopía confocal seguida de análisis computacional, que requiere que las micrografías en bruto se sometan a cierto grado de procesamiento para mejorar su calidad para la evaluación, ya que esto describe mejor la organización mitocondrial. De esta manera, los usuarios pueden determinar muchos resultados morfométricos de la red mitocondrial, como el recuento, el volumen, la longitud y la relación de aspecto 13,14,15. Los usuarios pueden hacer uso de micrografías 2D o 3D para evaluaciones morfológicas, aunque el análisis 3D ofrece una mayor precisión y conocimiento ya que la red mitocondrial consta de estructuras 3D. Con el fin de analizar la fisión y la fusión, se recomienda el uso de micrografías con un eje z, ya que esto compensa mejor la tridimensionalidad de la red mitocondrial16.

Muchos estudios implican la categorización de las mitocondrias en estados fragmentados, filamentosos o intermedios como medio para describir la red16,17. El análisis 3D es particularmente beneficioso debido a las diferentes formas que toman las mitocondrias en la célula. Agregar tridimensionalidad al estudio de uno brinda confianza, especialmente a los recuentos mitocondriales, ya que es probable que las mitocondrias se muevan hacia arriba o hacia abajo a lo largo de un eje z. MEL es un complemento de ImageJ que depende de imágenes capturadas en 3D18. Aquí, utilizamos células neuronales del hipocampo de ratón GT1-7 teñidas con TMRE y Hoechst para visualizar la red mitocondrial, así como el núcleo de la célula. Luego, las células se colocaron a través de una tubería de preprocesamiento para mejorar la calidad de las micrografías en preparación para el análisis de imágenes.

Se han puesto a disposición muchas técnicas que permiten la determinación de la morfología mitocondrial basada en métricas estáticas. Pocos incluyen actividades de fisión y fusión y permiten capturar cuantitativamente el comportamiento dinámico de las mitocondrias 13,19,20,21. Aquí describiremos un protocolo para la mejora de la imagen antes de la determinación de las características de la red, con un enfoque en la fisión mitocondrial y la actividad de fusión. Demostraremos cómo esta técnica puede complementar los métodos publicados anteriormente para determinar la morfología mitocondrial.

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Protocolo

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1. Tratamiento celular y adquisición de microscopía

  1. Cultive las células GT1-7 en placas de 8 cámaras en DMEM suplementadas con 10% de FBS y 1% de Penstrep (medios completos). Deje que las células se adhieran durante la noche y luego trátelas con clorhidrato de metformina 2,5 mM hecho en DMEM con FBS al 10% durante 72 h, asegurándose de reemplazar el medio cada 24 h. Cotratar las células con 10 μM de CCCP 6 h antes de la obtención de imágenes y 400 nM de bafilomicina A1 (Baf) 4 h antes de la obtención de imágenes.
    NOTA: Esto se puede hacer con cualquier línea celular eucariota de su elección.
  2. Antes de la obtención de imágenes, prepare un cóctel de medios completos precalentados que contengan 5 nM de Hoechst y 100 nM de TMRE.
  3. Reemplace los medios de tratamiento celular con el cóctel de imágenes y deje un tiempo de incubación de 10 minutos antes de obtener imágenes.
    NOTA: Debido a la actividad dinámica de las mitocondrias, las células deben ser visualizadas con un microscopio con una cámara de incubación ajustada a 37 °C y 5% de CO2.

2. Imágenes

  1. Imágenes de celdas con un aumento de 100x con 1,4 NA.
  2. Ajuste la potencia del láser de modo que la potencia sea lo suficientemente baja como para evitar el fotoblanqueo, ~ 2%. Asegúrese de que la velocidad de escaneo sea alta. Capture imágenes con una resolución de 512 x 512.
  3. Establezca los intervalos de corte Z entre incrementos de 0,25 μm. Para seguir este protocolo, crea imágenes de las celdas de modo que consten de 10 pilas Z. Adquiera cinco marcos de tiempo sin ningún intervalo entre la adquisición de una pila Z.
    NOTA: Una vez optimizado, este protocolo no debe ajustarse entre grupos de tratamiento o grupos de experimentos, ya que las macros enumeradas aquí requieren que el protocolo de imágenes se estandarice en todas las células.

3. Evaluación computacional

NOTA: Todo el procesamiento posterior se realizó con ImageJ v1.53t. El complemento MEL, así como los módulos de soporte, se pueden encontrar en https://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin, mientras que todas las macros utilizadas se pueden encontrar en https://github.com/rensutheart/FMPP/tree/master/Sections.

  1. Preparación de imágenes
    1. Abra el archivo sin procesar en ImageJ.
    2. Para recortar varias celdas de una sola micrografía, comience duplicando la imagen hasta el número de celdas individuales que se van a analizar.
    3. Utilice la herramienta de sincronización de ventanas, la herramienta de dibujo a mano alzada y el ajuste de color para dibujar una región de interés alrededor de una celda de interés donde hay varias celdas en un campo de visión (Figura complementaria S1).
    4. Haga clic en Editar | Despejado por fuera.
    5. Divida los canales rojo y azul entre sí y guarde el canal mitocondrial como . Tiff.
  2. Generación y deconvolución de funciones de dispersión de puntos
    1. Para generar una función de dispersión de puntos (PSF), utilice el complemento del generador PSF utilizando información micrográfica incrustada. Ir a Plugins | PSF Generator para abrir el complemento. Además, vaya a Imagen | Mostrar información... o presione I para abrir la información de la imagen y desplácese hasta la parte inferior. Usando el tamaño y la profundidad del vóxel, en el cuadro Mostrar información, cambie Pixelsize XY a 166,1 nm y Z-step a 200 nm. Cambie la longitud de onda a 568 nm, el tamaño XYZ para que coincida con una resolución de imagen de 512 x 512 y una pila Z de 10 cortes Z (Figura complementaria S2).
    2. Ir a Plugins | Macros | Editar | Deconvolution_time_lapse_mine.ijm.
    3. Edite las líneas de entrada y salida y presione ejecutar (Figura complementaria S3).
  3. Mejora del contraste de imagen y desenfoque
    1. Ir a Plugins | Macros | Editar | Preprocessing.ijm.
    2. Dentro de las macros Preprocessing.ijm , use una resta de fondo con un radio de bola rodante igual a 6. Establezca Sigma Filter Plus de modo que el radio sea igual a 1, los píxeles utilizados sean iguales a 2 y la fracción mínima de píxeles sea igual a 0.2, con el complemento siendo consciente de los valores atípicos. Ajuste la configuración de CLAHE de modo que el tamaño del bloque sea 64; establezca los intervalos del histograma en 256, la pendiente máxima en 2,5 y Gamma en 0,8.
      NOTA: Todas estas configuraciones se han optimizado para nuestros conjuntos de datos, y los valores deben optimizarse para conjuntos de datos alternativos antes de aplicar. El filtrado Sigma se aplica para suavizar la imagen y mezclar eficazmente los píxeles cercanos para garantizar estructuras consistentes. Se aplica contraste local para aumentar el contraste entre los píxeles claros y oscuros y, junto con un cambio en la gamma, mejora la presencia de las estructuras mitocondriales al tiempo que minimiza los píxeles de fondo.
    3. Cambie la línea de entrada a la carpeta que contiene las micrografías que se han sometido a deconvolución (Figura complementaria S4).
    4. Haga clic en Ejecutar.
  4. Umbral de imagen
    NOTA: Aunque los usuarios pueden hacer uso de cualquier herramienta de umbral que elijan, recomendamos el complemento de umbral adaptativo de Qingzong Tseng (https://sites.google.com/site/qingzongtseng/adaptivethreshold).
    1. Abra un archivo de interés que haya sido modificado por las macros Preprocessed.ijm en ImageJ.
    2. Ir a Plugins | adaptiveThr.
    3. Establezca el umbral local en Media ponderada y el tamaño del bloque de píxeles según las preferencias del usuario.
      NOTA: El tamaño del bloque de píxeles debe mantenerse constante entre las células, ya que este valor afecta las evaluaciones dimensionales mitocondriales, como el volumen o la relación de aspecto.
    4. Para optimizar el tiempo, haga clic en vista previa y ajuste el tamaño del bloque de modo que se incluyan claramente tantas mitocondrias como sea posible. También ajuste el valor de resta para cada celda para eliminar el fondo innecesario. Guarde los archivos de micrografía en carpetas asociadas con el valor de resta (Figura complementaria S5).
      NOTA: Las macros Threshold.ijm incluyen un filtro de tamaño para eliminar partículas más pequeñas.
    5. Seleccionar complementos | Macros | Editar | Umbral.ijm.
    6. Edite las líneas input_path y output_path, así como blockSize, y reste líneas en el script de macros (Figura complementaria S6).
    7. Haga clic en Ejecutar.
  5. Detección de eventos de fisión y fusión mediante el complemento del localizador de eventos mitocondriales (MEL)
    NOTA: MEL está diseñado para procesar una secuencia de lapso de tiempo de z-stacks que consta de un solo canal, guardado como un solo Tiff a la vez. Aunque esto se puede hacer cambiando la línea de entrada al archivo Tiff de interés con umbral, también demostraremos un método para procesar varios archivos Tiff a la vez utilizando la función de concatenación en ImageJ.
    1. Abra hasta 10 micrografías con umbral que pertenezcan a las mismas condiciones de tratamiento.
      NOTA: Las micrografías deben tener el mismo número de cortes z para que esto funcione.
    2. Ir a la imagen | Pilas |Herramientas | Concatene y presione Ok.
    3. Para eliminar los pequeños puntos restantes que quedan por el umbral, vaya a Complementos | Archivadores de imágenes integrales | Eliminar valores atípicos. Utilice la vista previa para establecer los tamaños X e Y para eliminar los fragmentos necesarios.
    4. Guarde el archivo concatenado como un Tiff.
    5. Ir a Plugins | Macros | Editar | Quicktest_new.ijm y edite las rutas de entrada y salida según sea necesario (Figura complementaria S7).
      NOTA: Una vez completado, se encontrará una carpeta llamada "MEL_results" en la carpeta de salida con todos los resultados de MEL. Estos se muestran como eventos de fisión y fusión detectados en cada punto de tiempo, y el último punto de tiempo siempre debe eliminarse debido a la forma en que funciona MEL18.

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Resultados

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Selección de celdas apropiadas
Los usuarios deben tener en cuenta que la red mitocondrial cambia según el estado mitótico de la célula. Si el núcleo parece en forma de mancuerna o U, o si hay un espacio cerca del núcleo con falta de señal de fluorescencia, esto puede indicar que la célula se está acercando a la mitosis. En este estado, es probable que las mitocondrias sufran fisión debido a la división celular y no debido a la intervención del tratamiento y su efecto en la red (Figura compleme...

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Discusión

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Aunque existe un número creciente de enfoques para describir la morfología mitocondrial, existen técnicas limitadas para capturar adecuadamente la dinámica mitocondrial de manera cuantitativa. Además, debe tenerse en cuenta que la morfología de la red mitocondrial, así como los mecanismos que gobiernan esta morfología, son de naturaleza variada. Esto da como resultado redes que están vinculadas a las necesidades de la célula, que van desde una formación ramificada para mejorar la producc...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Esta investigación fue financiada por la Universidad de Stellenbosch, Sudáfrica, el Consejo de Investigación Médica de Sudáfrica (SAMRC) y la Fundación Nacional de Investigación (NRF) de Sudáfrica, así como los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (CIHR) y el Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá (NSERC).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Platos de 8 cámarasThermoFisher#Z734853
Umbral ajustadohttps://sites.google.com/site/qingzongtseng/adaptivethreshold
Bafilomicina A1Laboratorios LKT#B0026
Clorofenilhidrazona de cianuro de carbonilo (CCCP)Merck#C2759
Microscopio confocalCarl Zeiss AGPlataforma de superresolución LSM780 ELYRA PS.1
Medio Eagle modificado (DMEM) de DulbeccoThermoFisher#341956062
Suero fetal bovino (FBS)Sigma-Aldrich#F0679
Enlace de Githubhttps://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin
GraphPad Prism v7.06
Celdas GT1-7ATCCSCC116
HoecshtSigma-AldrichH6024
ImageJ v1.53tFiji
Macroshttps://github.com/rensutheart/FMPP/tree/master/Sections
MetforminaFarmacopea EuropeaM06050000
Penicilina/estreptomicina (PenStrep)Sigma-Aldrich#P4333
T25Científico Bio-Smart#70025
TMREThermoFisher#T669
TripsinaSigma-Aldrich#T4049

Referencias

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