Este protocolo describe los métodos para establecer cultivos de montaje completo y disociados de ganglios de raíz dorsal de ratón (DRG) y su uso para evaluar las interacciones tumor-nervio.
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Artículo de método
Establecimiento de modelos in vitro del cultivo de ganglios de la raíz dorsal: enfoques complementarios para investigar la diafonía entre el cáncer y los nervios
En este artículo
Resumen
Resumen
La contribución del sistema nervioso al microambiente tumoral y la importancia de la invasión neuronal como vía de diseminación del cáncer son cada vez más reconocidas. Las interacciones de las células cancerosas con las neuronas pueden promover su invasión alrededor y dentro de los nervios, una característica de muchos cánceres con malos resultados clínicos. Los modelos in vitro para estudiar las interacciones recíprocas entre las neuronas y las células cancerosas proporcionan herramientas valiosas para comprender la propagación del cáncer e identificar enfoques para mitigarlo.
Aquí, describimos un protocolo para el aislamiento de ganglios de raíz dorsal murina (DRG) y el establecimiento de cultivos de monocapa disociados y de montaje completo que se pueden usar para visualizar la morfología de las neuronas y el crecimiento de las neuritas a lo largo del tiempo. Los DRG completos montados en Matrigel conservan la arquitectura nerviosa y las respuestas a los estímulos en un entorno heterogéneo más similar al nervio in vivo , mientras que los cultivos nerviosos disociados permiten evaluar más de cerca las interacciones directas célula a célula. Una vez que se establecen los cultivos de DRG, se pueden agregar células cancerosas para generar cocultivos que se pueden usar para visualizar los cambios en el crecimiento de las neuritas y la morfología de los nervios en respuesta a las células cancerosas. Se puede evaluar el crecimiento o la motilidad de las células cancerosas en respuesta a señales derivadas de los nervios a lo largo del tiempo o en condiciones de estimulación o inhibición del crecimiento, así como visualizar los efectos del contacto directo entre las células cancerosas y las extensiones nerviosas.
Dado que ambos modelos de cocultivo pueden generarse simultáneamente, este protocolo proporciona una visión más completa del impacto de las interacciones entre el cáncer y las neuronas y facilita las comparaciones de las condiciones de tratamiento y la integración de la información a nivel celular y de los ganglios completos. Este protocolo facilitará el estudio de las interacciones nervio-tumor y se puede utilizar para una amplia gama de aplicaciones, incluidos los estudios de señalización celular, el cribado de fármacos o el estudio de la heterogeneidad del entorno tumor-nervio y los mecanismos de diseminación tumoral a lo largo de los nervios.
Introducción
La diseminación tumoral, a través de invasión local y metástasis regional o a distancia, es la causa principal de muerte relacionada con el cáncer. Aunque la investigación se ha centrado en las rutas vasculares o linfáticas de propagación, la invasión neural de las células tumorales se observa con frecuencia en muchos tumores sólidos, incluidos los cánceres de páncreas 1,2, próstata 3, cabeza y cuello4, mama5 y colorrectal6. En los últimos años, numerosos estudios han destacado el papel emergente de los nervios en la promoción del crecimiento y la progresión tumoral, y como vías de diseminación, impulsando el desarrollo de metástasis 7,8. En este contexto, la neurociencia del cáncer se ha consolidado como un destacado campo de investigación, ofreciendo nuevas perspectivas en oncología al dilucidar las interacciones entre las células tumorales y los componentes fundamentales del sistema nervioso periférico (SNP) que pueden contribuir a estos procesos 8,9.
El SNP está formado por nervios periféricos y ganglios, que son estructuras heterogéneas compuestas por diversos tipos de células, incluyendo neuronas de diferentes tamaños y funciones, células de Schwann y otras células gliales, fibroblastos, macrófagos, mastocitos, melanocitos y células endoteliales vasculares que forman la vasculatura local10. El SNP es un componente crítico del microambiente tumoral (TME), y la comunicación recíproca entre las células cancerosas y los nervios, ya sea directamente a través del contacto físico o indirectamente a través de la liberación de factores neurotróficos, neurotransmisores, factores de crecimiento y otras señales, puede facilitar la invasión neuronal y promover fenotipos más agresivos8.
Los modelos in vitro se pueden utilizar para caracterizar los procesos que contribuyen al mantenimiento y reparación de los nervios y se utilizan cada vez más para examinar las interacciones celulares entre los nervios y las células cancerosas11,12. Un modelo in vitro frecuentemente utilizado involucra ganglios de raíz dorsal de ratón extraídos (DRG) co-cultivados con células tumorales11. Estos modelos a menudo utilizan el cultivo monocapa bidimensional (2D) de células DRG disociadas para estudiar la biología neuronal in vitro y se han utilizado para modelar las interacciones celulares en el SNP13,14. Sin embargo, los cultivos 2D carecen de la complejidad del microambiente nervioso y representan mal su arquitectura in vivo. Los montajes tridimensionales (3D) de neuronas periféricas o ganglios ofrecen una alternativa que recapitula de manera más efectiva la fisiología de los nervios periféricos para representar las interacciones nervio-ambiente de manera más holística 15,16,17,18. Sin embargo, la heterogeneidad de este modelo limita la capacidad de visualizar o cuantificar las interacciones célula-célula, y estos modelos son más efectivos para observar las respuestas generales de los nervios periféricos que para explorar las interacciones celulares específicas y las respuestas mecanicistas a los estímulos. Por lo tanto, está claro que los cultivos neuronales disociados y de montaje completo son complementarios y que la evaluación de modelos 2D y 3D en paralelo es óptima para evaluar tanto los efectos generales como las respuestas celulares individuales a los estímulos.
Este protocolo describe métodos para generar cultivos nerviosos dissociados (2D) y de montaje completo (3D) complementarios que se pueden utilizar para evaluar las interacciones entre los nervios y las células cancerosas tanto a nivel celular como tisular, proporcionando una visión más completa de estas interacciones que los métodos que utilizan un solo tipo de cultivo 1,13. Estos modelos se pueden utilizar para visualizar y evaluar los procesos celulares, incluida la morfología de las células nerviosas y el crecimiento de neuritas, así como las respuestas de las células tumorales a los agentes quimiotácticos secretados por los nervios, como los factores neurotróficos, y la diafonía entre las neuronas sensoriales y las células tumorales. También permite explorar las posibles interacciones entre las células tumorales y otros componentes del microambiente neural, como las células inmunitarias, los fibroblastos y la glía. Destacamos la aplicación de estos modelos para estudiar las interacciones entre las células nerviosas y cancerosas a lo largo del tiempo, visualizadas mediante tinción de células vivas o inmunofluorescencia, como ejemplos de enfoques para evaluar o cuantificar las interacciones y respuestas celulares. En conjunto, los resultados generados a partir del uso de estos métodos pueden mejorar nuestra comprensión de cómo el sistema nervioso promueve el crecimiento y la propagación del cáncer, lo que nos ayuda a desarrollar estrategias para atacar estos mecanismos.
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Protocolo
Todo el trabajo con ratones fue revisado y aprobado por la Oficina del Comité Universitario de Cuidado de Animales de la Universidad de Queen's (Protocolo número 2524). Los animales fueron mantenidos y sacrificados para la recolección de tejidos de acuerdo con las directrices éticas del Consejo Canadiense de Cuidado Animal y el Centro Nacional para el Reemplazo, Refinamiento y Reducción de Animales en Investigación (Reino Unido). En este protocolo, utilizamos tejido aislado de animales C57BL/6, pero también utilizamos con éxito otros genotipos, incluidos los animales Rag2IL2Rγc KO. Las secciones 1 a 6 se pueden realizar en un entorno limpio en una mesa de laboratorio esterilizada en superficie (ver Figura 1), mientras que las secciones 7 a 9 deben realizarse en una cabina de seguridad biológica. Para una mejor comprensión, se crearon representaciones esquemáticas de los pasos mencionados (Figura 1).
1. Preparación de soluciones madre
- Prepare la solución de papaína y la solución de colagenasa IV/dispasa II. Disolver la papaína en PBS estéril (solución salina tamponada con fosfato) a una concentración de 30 U/mL; almacenar en alícuotas de 1 mL a -20 °C. Disuelva la colagenasa tipo IV a 1,25 mg/mL y la dispasa II a 2,5 mg/mL en PBS. Conservar en alícuotas de 1 ml a -20 °C.
- Prepare el medio de cultivo neurobasal (F12) suplementado con un 2% de suplemento de B27 (solución madre 50x), suero bovino fetal (FBS) al 10% y penicilina-estreptomicina (Pen-Strep) al 1% (solución madre 100x).
- Prepare la solución salina equilibrada de Hank (HBSS) con penicilina-estreptomicina al 1% (solución madre 100x).
NOTA: Para apoyar la supervivencia inicial y la unión de las células, se utilizan medios F12 suplementados con un 10% de FBS para mejorar el establecimiento de los cultivos. Sin embargo, el FBS también promueve la proliferación de células no neuronales, incluidos los fibroblastos. Las condiciones de medios reducidos o sin suero (por ejemplo, F12 suplementado con B27 solamente) se pueden usar para minimizar el crecimiento de células no neuronales en el cultivo de DRG y el cocultivo de cáncer, pero pueden afectar la supervivencia, particularmente de los cultivos de neuronas disociadas. También se deben considerar los medios sin suero al recolectar medios acondicionados con DRG para evaluar sus efectos sobre el comportamiento de las células cancerosas.
2. Preparación de reactivos y materiales para la disección de GRD (Figura 1A)
- Instrumental quirúrgico en autoclave. Esterilizar la superficie del microscopio de disección con etanol al 70% y colocarlo en un banco limpio.
- Añadir 6-8 mL de HBSS-Pen-Strep (paso 1.3) a dos placas de cultivo de 10 cm y colocar en hielo.
NOTA: Estas placas se utilizarán para recolectar las columnas vertebrales después de la disección. Dependiendo de la cantidad de médula espinal que se diseccione, es posible que se necesiten placas adicionales. - Agregue 8-10 mL de HBSS-Pen-Strep a un tubo cónico de 15 mL y colóquelo en hielo.
- Agregue 3 mL de HBSS-Pen-Strep a una placa de cultivo de 3 cm y colóquela en hielo.
NOTA: El tubo de 15 mL preparado en el paso 2.3 se utilizará para recoger los GRD para la disociación, mientras que la placa de cultivo de 3 cm (paso 2.4) se utilizará para recoger los GRD para el modelo de montaje completo.
3. Preparación de reactivos y materiales para el cultivo de DRG de montaje completo
NOTA: Algunos pasos de esta sección pueden requerir preparación durante la noche. Aunque se puede utilizar cualquier tipo de placa de cultivo de tejidos para cultivos de DRG, los volúmenes y las instrucciones de este protocolo se optimizaron para portaobjetos con fondo de vidrio de 8 pocillos, lo que proporcionó una calidad de imagen óptima para nuestros análisis. Mantenga el portaobjetos con fondo de vidrio de 8 pocillos, las puntas de pipeta y Matrigel en hielo en todo momento.
- Descongele la solución de Matrigel a 4 °C durante la noche (o al menos 3 h) antes de usar. Asegúrate de mantener Matrigel cubierto de hielo en todo momento.
- Enfríe las puntas de pipeta y el portaobjetos de fondo de vidrio de 8 pocillos a -20 °C durante la noche para minimizar la adherencia de Matrigel a las puntas y evitar la polimerización prematura de Matrigel en la placa.
- Calentar los medios suplementados (paso 1.2) a 37 °C en un baño de agua.
4. Preparación de reactivos y materiales para el cultivo de DRG disociado
- Descongele la solución de papaína y la solución de colagenasa IV/dispasa II (paso 1.1) en un baño de agua a 37 °C hasta que esté listo para usar.
NOTA: Por cada ratón disecado, use 1 alícuota (1 mL) de cada solución de papaína y colagenasa IV/dispasa II. - Medios de cultivo cálidos suplementados (paso 1.2).
5. Extracción de la columna vertebral (Figura 1B) y disección de los GRD (Figura 1C)
- Eutanasia de ratones de 4 a 8 semanas de edad mediante una sobredosis de isoflurano seguida de dislocación cervical. Coloque al animal sacrificado sobre su abdomen y afeite su pelaje, concentrándose en el área sobre la columna vertebral (Figura 1B, pasos 1,2).
- Rocíe el lomo del animal con etanol al 70% y elimine el pelaje suelto, limpiándolo con toallas de papel desde la cola hasta el cráneo para evitar que el pelaje contamine la disección.
- Con unas tijeras esterilizadas, haga una incisión recta a lo largo de la superficie dorsal afeitada, desde la cola hasta el cráneo. Retraiga la piel de ambos lados de la incisión con pinzas romas para exponer la columna vertebral (Figura 1B, paso 3).
- Usando un par de pinzas y tijeras nuevas para evitar la contaminación con pelo, haga una incisión horizontal en la base (extremo de la cola) de la columna vertebral (Figura 1B, paso 4).
- Haga dos incisiones longitudinales paralelas a cada lado de la columna vertebral para liberarla. Use fórceps para levantar suavemente la columna vertebral y extraer el tejido conectivo circundante (Figura 1B, paso 5).
- Para liberar completamente la columna vertebral, haga una incisión en la parte superior de la columna vertebral (proximal al cráneo). Transfiera la columna vertebral a las placas preenfriadas de 10 cm que contienen HBSS-Pen-Strep en hielo (paso 2.2) (Figura 1C, paso 6).
NOTA: Es conveniente recoger todas las columnas vertebrales en la misma placa de 10 cm y mover las columnas individuales una a la vez a una placa separada para los siguientes pasos de disección.
6. Disección de los ganglios de la raíz dorsal (DRG)
- Con unas tijeras de resorte, retire cualquier tejido conectivo residual alrededor de la columna vertebral, exponiendo las vértebras (Figura 1C, paso 7). Esto permite una visualización más clara de la vértebra y facilita el corte a lo largo de la línea media. Recoja las columnas recortadas en un plato nuevo y preenfriado de 10 cm (paso 2.2).
- Uno a la vez, transfiera la médula espinal recortada a la platina del microscopio para su disección. Divida cuidadosamente la columna vertebral en el plano sagital con unas tijeras de resorte (Figura 1D, paso 8).
- Con pinzas de punta fina, extraiga la médula espinal de la columna vertebral, exponiendo los GRD bilateralmente a lo largo de las raíces de los nervios espinales (Figura 1D, paso 9).
NOTA: Se debe tener especial cuidado en este paso, ya que los DRG se pueden eliminar con la médula espinal si se manipula con demasiada brusquedad. - Corte los nervios espinales con unas tijeras de resorte y retire cualquier tejido conectivo alrededor de los DRG (Figura 1D, paso 10).
NOTA: La eliminación del tejido conectivo en este paso minimiza los residuos en los cultivos de DRG. - Con pinzas de punta fina, tire suavemente del DRG para extraerlo de la raíz dorsal. Para el cultivo de montaje completo, coloque los DRG en la placa de 3 cm (preparada en el paso 2.4) (Figura 1D, paso 11). Agrupe los GRD restantes en un tubo cónico de 15 ml (preparado en el paso 2.3) para utilizarlo en la disociación.
NOTA: Mantenga las placas y los tubos en hielo durante todo el proceso de disección. - Repita los pasos 6.4 a 6.5 hasta que se extraigan todos los DRG. Repita todos los pasos anteriores para cualquier columna vertebral adicional.
NOTA: Los ratones tienen 30-31 pares de DRG dependiendo de la cepa, lo que permitirá la recolección de hasta 60 DRG de cada animal. Si se recolectan DRG solo de la porción lumbar de la médula espinal, se pueden extraer 10 DRG. El uso de DRG del mismo animal para establecer ambos modelos de cultivo reduce la variabilidad intraexperimental y garantiza resultados consistentes y comparables entre experimentos complementarios.
NOTA: Todos los pasos posteriores a la extracción de los GRD deben realizarse en una cabina de seguridad biológica.
7. Cultivo DRG de montaje completo (Figura 2)
- Usando puntas preenfriadas (paso 3.2), pipetee 2 μL de Matrigel enfriado para formar una gota en cada pocillo de un portaobjetos con fondo de vidrio de 8 pocillos colocado sobre hielo (Figura 2A, paso 1). Para evitar que Matrigel polimerice prematuramente antes de agregar el DRG, pipetee solo una gota a la vez. Para evitar arañazos en la superficie del portaobjetos, colóquelo en un plato de 10 cm antes de colocarlo en hielo.
- Con pinzas de punta fina, transfiera un DRG a una placa seca y muévalo suavemente para eliminar cualquier exceso de HBSS, evitando una mayor dilución del Matrigel al agregar el DRG a la gota de Matrigel. Transfiera el DRG a la gota Matrigel (Figura 2A, paso 2).
NOTA: Utilice pinzas de punta fina para empujar suavemente el DRG en la gota de Matrigel, asegurándose de que el DRG esté completamente sumergido y colocado en el centro dentro de la gota. - Repita los pasos 7.1 a 7.2 para cada DRG agregado a una gota de Matrigel.
- Incubar el portaobjetos de 8 pocillos con fondo de vidrio a 37 °C durante 5 min en una incubadora humidificada para permitir que el Matrigel se polimerice (Figura 2A, paso 3).
- Agregue con cuidado 200 μL de medio de cultivo suplementado caliente a cada pocillo e incube a 37 °C con 5% de CO2 (Figura 2B, paso 4). Reemplace los medios con medios de cultivo nuevos suplementados cada 72 h.
- Monitorizar el GRD mediante microscopía de campo claro para evaluar su viabilidad y crecimiento neuronal cada 24 h (Figura 2C y Figura 3).
NOTA: La viabilidad puede indicarse por un aumento en la longitud y densidad de las neuritas. Las imágenes se pueden capturar a lo largo del tiempo para demostrar el desarrollo de las extensiones de la célula DRG (Figura 3).
8. Cultivo de DRG disociado (Figura 4)
NOTA: Se puede utilizar cualquier placa de pocillos múltiples para sembrar las neuronas DRG disociadas. Sin embargo, en este protocolo, se utilizaron portaobjetos con fondo de vidrio de 8 pocillos porque proporcionaron una mejor confluencia celular y calidad de imagen para los análisis de inmunofluorescencia.
- Recubrimiento de placas de cultivo con colágeno
- Prepare una solución de trabajo de 50 μg/mL de colágeno I acidificado en HCl estéril de 0,01 M en una cabina de seguridad biológica.
- Pipetee 100 μL de solución de colágeno I en cada pocillo del portaobjetos con fondo de vidrio de 8 pocillos. Incline y gire suavemente el portaobjetos para asegurarse de que la solución de colágeno cubra toda la superficie inferior de cada pocillo de manera uniforme. Incubar el portaobjetos a 37 °C en una incubadora humidificada durante 1 h para asegurar la polimerización del colágeno I.
NOTA: Durante el tiempo de incubación, proceda con los pasos 8.2 y 8.3. - Después de la incubación, pipetear suavemente cualquier solución residual de colágeno I no polimerizado de cada pocillo. Enjuague cada pocillo con 100 μL de PBS. Pipetea el exceso de PBS, dejando una fina capa residual para evitar que el colágeno se seque.
NOTA: El portaobjetos con fondo de vidrio de 8 pocillos puede permanecer en la cabina de seguridad biológica hasta que los GRD disociados estén listos para la etapa de siembra.
- Digestión enzimática
- Centrifugar suavemente el tubo de 15 ml que contiene los GRD extraídos (paso 6.5) durante 5 min a 200 × g a temperatura ambiente para peletizar los GRD. Retire suavemente el HBSS con una pipeta.
- Enjuague los GRD en medios suplementados precalentados, golpee suavemente el tubo para asegurarse de que todo el contenido se lave y centrifugue durante 5 minutos a 200 × g para granular los GRD.
- Pipetear el medio y agregar 1 mL de solución de papaína (Figura 4A, paso 1). Mezclar suavemente e incubar durante 20 min a 37 °C en una incubadora de cultivo de tejidos. Agite suavemente el tubo para agitarlo cada 5 min.
- Después de 20 minutos, agregue 4.5 mL de medio suplementado y mezcle suavemente para neutralizar la papaína. Tubo de centrífuga durante 5 min a 400 × g para pellets DRGs. Retire con cuidado el sobrenadante con una pipeta.
- Añadir 1 mL de solución de colagenasa IV/dispasa II e incubar durante 20 min a 37 °C en la incubadora. Agite suavemente el tubo cada 5 minutos (Figura 4A, paso 1).
- Después de 20 minutos, agregue 4,5 ml de medio suplementado y mezcle suavemente para neutralizar la solución de colagenasa IV/dispasa II. Tubo de centrífuga durante 5 min a 400 × g para pellets DRGs. Retire con cuidado el sobrenadante con una pipeta.
- Añadir 2 mL de medio suplementado y añadir DNasa I hasta una concentración final de 0,2 mg/mL. En este punto, los DRG se digieren completamente y pueden aparecer como un grupo suelto (Figura 4A, paso 2).
- Disociación mecánica
- Triture suavemente el DRG, pipeteando hacia arriba y hacia abajo 4-5 veces con una punta de pipeta de filtro de 1000 μL (Figura 4A, paso 2).
- Realice un segundo paso de trituración con una punta de pipeta de 200 μL 4-5x. Después de este paso, la muestra aparece turbia y quedan algunos grumos visibles de tejido (Figura 4A, paso 2).
- Filtre la suspensión celular a través de un filtro celular de 70 μm en un tubo cónico de 50 mL. Enjuague gradualmente el colador con 10 mL de medio para asegurar una filtración completa de las células a través del filtro (Figura 4A, paso 3).
- Tubo de centrífuga durante 5 min a 1.000 × g a las celdas de pellets. Retire el medio del pellet y vuelva a suspender en 500 μL de medio suplementado (Figura 4A, paso 4).
- Retire cualquier PBS residual de los pocillos del portaobjetos con fondo de vidrio de 8 pocillos. Distribuya la suspensión de DRG disociada entre los pocillos recubiertos de colágeno. Incubar los portaobjetos a 37 °C en una incubadora humidificada con 5% deCO2. Agregue más medios según sea necesario y reemplace los medios con medios de cultivo nuevos suplementados cada 48 h (Figura 4B, paso 5).
NOTA: Las células disociadas con DRG se pueden contar utilizando un hemocitómetro o una cámara de recuento de células y tinción con azul de tripán para garantizar un número constante de células por pocillo. Para este protocolo, se sembraron aproximadamente 1 × 105 celdas en cada pocillo. - Monitorice las células derivadas de DRG mediante microscopía de campo claro para evaluar la viabilidad y el crecimiento neuronal (Figura 4C y Figura 5).
NOTA: Las neuronas aparecen como cuerpos celulares redondeados con bordes definidos y pueden tardar 24 horas o más en adherirse, mientras que las células no neuronales generalmente se asientan antes que las neuronas. Es posible observar algunos crecimientos de neuritas después de 24 h y aumentan con el tiempo hasta 7 días en cultivo. Las células disociadas derivadas de DRG y las DRG de montaje completo se preincuban durante 72 h antes de añadir células cancerosas y establecer cocultivos.
9. Preparación de suspensiones de células cancerosas y establecimiento de cocultivos
NOTA: Se pueden utilizar células cancerosas adherentes de muchos tipos. Los medios de crecimiento y el número de células para los cocultivos dependerán de la línea celular. Recomendamos realizar pruebas preliminares antes del experimento para determinar el momento de la recolección de células y el número óptimo de siembra de células. El protocolo descrito aquí se basó en el uso de las líneas celulares de cáncer de páncreas humano PanC1 y MiaPaCa2, y la línea celular de cáncer de próstata DU-145.
- Lavar las células con medios sin suero y tripsinizarlas durante aproximadamente 3 min con 2 mL de tripsina/placa de 10 cm.
- Neutralice la tripsina agregando 6 mL de medio suplementado y pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo para asegurar una suspensión de una sola célula. Cuente las células con un hemocitómetro y una tinción de azul de tripán.
- Suspender las células cancerosas a una concentración de 2 × 105 células/ml en medios suplementados (paso 1.2).
NOTA: La densidad celular óptima puede variar según el tamaño de la célula, el tiempo de duplicación y la duración del cocultivo, y se puede ajustar según sea necesario. - DRG de montaje completo y cocultivo de células cancerosas (Figura 6B)
- Aspire los medios de todo el montaje de los cultivos DRG en el portaobjetos con fondo de vidrio de 8 pocillos.
- Pipetear suavemente 200 μL de la suspensión de células cancerosas (paso 9.3) sobre la gota de Matrigel que contiene todo el DRG de la montura.
NOTA: Esto asegura una distribución uniforme de las células cancerosas alrededor de la gota. Tenga cuidado de no tocar la gota de Matrigel con la punta de la pipeta. - Incubar el portaobjetos de cocultivo en una incubadora humidificada a 37 °C con 5% de CO2. Refresque los medios diariamente lavándolos con 200 μL de medios suplementados calentados una vez, y luego agregue 300 μL de medios suplementados a cada pocillo.
NOTA: Aspire suavemente el medio con una pipeta para evitar perturbar el cocultivo de células cancerosas DRG. Con el tiempo, a medida que los cocultivos se vuelven más complejos y organizados, también se vuelven más susceptibles a las perturbaciones que pueden afectar las interacciones celulares y la integridad del cocultivo. - Monitorizar el cocultivo utilizando un microscopio de campo claro o de fluorescencia a intervalos de 24 h para evaluar el comportamiento de las células cancerosas y las interacciones neuronales (Figura 6B).
NOTA: La frecuencia de observación se puede ajustar en función de la línea de tiempo experimental y las interacciones celulares de interés.
- Cocultivo disociado de DRG y células cancerosas (Figura 6C)
- Aspire los medios de las culturas disociadas en el portaobjetos de fondo de vidrio de 8 pocillos.
- Distribuya suavemente 200 μL de la suspensión de células cancerosas (paso 9.3) en cada pocillo. Siga los mismos pasos de incubación, refresco de medios y monitoreo que se describen para los cocultivos de montaje completo (pasos 9.4.3 y 9.4.4).
NOTA: Para una mejor visualización de los procesos celulares y las interacciones entre las células cancerosas y las neuronas, se pueden agregar rastreadores de células fluorescentes al cultivo, siguiendo el protocolo del fabricante.
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Resultados
Nuestro protocolo describe el aislamiento de células primarias derivadas de DRG de ratón y el establecimiento de dos modelos de cultivo complementarios: DRG disociado y cultivos de DRG montados enteros, que nos permiten investigar las interacciones entre células nerviosas y cancerosas a diferentes niveles de complejidad. Una ventaja clave de este protocolo es que ambos tipos de cultivo se pueden generar utilizando DRG aislados del mismo animal, lo que minimiza la variabilidad interanimal ...
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Discusión
El protocolo presentado aquí describe métodos mejorados para establecer cultivos de nervios primarios DRG en 2D y 3D y su aplicación en cocultivo con células cancerosas. Este protocolo avanza sobre los métodos anteriores al establecer los dos modelos en paralelo. Como los modelos 2D y 3D se establecen al mismo tiempo, utilizando nervios primarios aislados de los mismos animales, se minimiza la variación interanimal e interexperimental, y los datos de ambos modelos se pueden comparar o in...
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por subvenciones operativas de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (PJT-178274) (LMM), y por una Beca de Posgrado de Ontario (LCBO), y por una beca de la Coordinación para el Mejoramiento del Personal de Educación Superior - Brasil (CAPES) - Código Financiero 001 (ERP). LMM es la Cátedra Bracken de Genética y Medicina Molecular en la Universidad de Queen. Algunas imágenes se generaron en parte utilizando Biorender.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Fuerte | |||
| 70 µ m Filtro de células | Progene | 71-229483-ULT | Se utiliza para filtrar la suspensión celular |
| Portaobjetos con fondo de vidrio de 8 pocillos | IBidi, Múnich, Alemania | 80807 | |
| Dumont #5 - Pinzas Finas | Herramientas de ciencia fina, Foster City, EE. UU. | 11254-20 | |
| Pinzas Dumont #5 | Herramientas de ciencia fina, Foster City, EE. UU. | 11252-20 | |
| Tijeras finas | Herramientas de ciencia fina, Foster City, EE. UU. | 91460-11 | |
| Pinzas de patrón | Herramientas de ciencia fina, Foster City, EE. UU. | 91121-12 | |
| Tijeras de resorte | Herramientas de ciencia fina, Foster City, EE. UU. | 91500-09 | |
| Reactivos | |||
| 1x solución salina tamponada con fosfato | Sigma, St. Louis, Estados Unidos | D8662-500ML | Se utiliza para disolver enzimas |
| Suplemento B-27 (50x) | Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, EE. UU. | 17504044 | Se utiliza a una concentración del 2% en medios F12 |
| Colágeno bovino tipo I | Corning Incorporated, Nueva York, EE. UU. | 354231 | Utilizado para recubrir placas, solución de trabajo 50 y micro; g/ml en HCl 0,01 M |
| Colgenasa tipo IV | Sigma-Aldrich, St. Louis, Estados Unidos | C4-BIOC | Disolver en PBS a 1,25 mg/ml, alícuota, almacenar a -20 ° C |
| Dispase II | Roche, Basilea, Suiza | 4942078001 | Disolver en PBS a 2,5 mg/ml, alícuota, almacenar a -20 &grados; C |
| ADNasa I | Roche, Basilea, Suiza. | 11284932001 | Añadido a la concentración final de 0,2 mg/ml durante la disociación |
| Suero fetal bovino (FBS) | Sigma-Aldrich, St. Louis, Estados Unidos | F1051 | Se utiliza a una concentración del 10% en medios F12 |
| HBSS (Solución salina equilibrada de Hank) | Sigma, St. Louis, Estados Unidos | H6648-500ML | Preparado con penicilina-estreptomicina al 1% |
| Factor de crecimiento de Matrigel reducido | Corning Incorporated, Nueva York, EE. UU. | 356231 | Descongelar a 4 ° C durante la noche, mantener en hielo |
| Mezcla de nutrientes F-12 Jamón | Sigma-Aldrich, St. Louis, Estados Unidos | N6658-500ML | Medio basal para la preparación de medios de cultivo suplementados |
| Papaína | Roche, Basilea, Suiza. | 10108014001 | Disolver en PBS a 30 U/mL, alícuota, almacenar a -20 ° C |
| Penicilina-Estreptomicina (100x) | Sigma-Aldrich, St. Louis, Estados Unidos | P4333-100ML | Se utiliza a una concentración del 1% en los medios |
| Solución azul de tripano | Sigma-Aldrich, St. Louis, Estados Unidos | T8154-100ML | Para evaluar la viabilidad celular |
| TrypLE Express | Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, EE. UU. | 12605-028 | Para recolectar células cancerosas |
| Anticuerpos | |||
| β-anticuerpo de tubulina III | Abcam (Cambridge, Reino Unido) | AB15568 | Dilución 1:200 |
| Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, EE. UU. | A-11008 | Dilución 1:2000 |
| Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, EE. UU. | A-21442 | Dilución 1:2000 |
| Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, EE. UU. | A-21245 | Dilución 1:2000 |
| Anticuerpo NeuN | Sigma-Aldrich, St. Louis, Estados Unidos | MAB377 | Dilución 1:100 |
| Tintes fluorescentes y Sondas | |||
| ActinGreen 488 Reactivo ReadyProbes (faloidina) | Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, EE. UU. | Referencia R37110 | Dilución 1:40 |
| CellTrace Calceína Rojo-Naranja | Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, EE. UU. | C34851 | Rastreador celular utilizado para visualizar neuronas bajo microscopio de fluorescencia |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, EE. UU. | H3570 | Dilución 1:5000 |
Referencias
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