Tomografía de microscopía electrónica de transmisión de barrido en virología: imágenes 3D de muestras congeladas a alta presión y sustituidas por congelación

Resumen

Este protocolo de video ilustra cómo realizar una tomografía de microscopía electrónica de transmisión de barrido de muestras virológicas. Para obtener resultados óptimos, las muestras se preparan mediante congelación a alta presión y posterior sustitución por congelación.

Resumen

La microscopía electrónica (EM) y especialmente las técnicas EM tridimensionales (3D) se han convertido en métodos establecidos en virología estructural. La investigación de la alteración de la ultraestructura celular inducida por virus, como las fábricas de replicación inducidas por el virus del Zika (ZIKV) o los orgánulos de replicación del coronavirus, exige imágenes en 3D. La tomografía de microscopía electrónica de transmisión (TEM) es un método ampliamente utilizado, a pesar de su limitación a muestras con un espesor de hasta 200 nm. La tomografía de microscopía electrónica de barrido (SEM) con haz de iones enfocados puede producir datos 3D de mayores volúmenes con una resolución isotrópica, aunque generalmente más baja. Se utilizan técnicas alternativas, como la microscopía electrónica de barrido facial en bloque (BF-SEM), la tomografía de matriz SEM o la obtención de imágenes TEM de secciones seriadas para obtener imágenes de volúmenes más grandes. Sin embargo, en comparación con las técnicas mencionadas anteriormente, estas técnicas tienen el costo de una resolución mucho menor a lo largo del eje Z de la muestra. Una técnica que proporciona información 3D de muestras de hasta 1 μm de espesor con una resolución isotrópica de unos pocos nanómetros es la tomografía de microscopía electrónica de transmisión de barrido (STEM).

Aquí, presentamos un protocolo para la preparación de muestras virológicas congeladas a alta presión, sustituidas por congelación e incluidas en resina y su análisis mediante tomografía STEM. Este protocolo se beneficia de las ventajas de las imágenes a temperatura ambiente al tiempo que preserva la ultraestructura biológica en un estado casi nativo. Mostramos dos ejemplos representativos de preguntas que pueden responderse mediante tomografía STEM. En primer lugar, aplicamos el protocolo para estudiar la morfogénesis del virión de un virus de la estomatitis vesicular recombinante (VSV). Las tomografías STEM ofrecen información sobre la gemación de VSV recombinante a la que de otro modo no se podría acceder mediante imágenes 2D. En segundo lugar, mostramos microscopía electrónica y de luz correlativa (CLEM) utilizando imágenes de transferencia de energía por resonancia de Foerster (FRET) y tomografía STEM (FRET-3D-CLEM) de nanofibrillas peptídicas EF-C. Esta combinación recientemente publicada ofrece nuevos conocimientos sobre la captación y el desmontaje de nanofibrillas peptídicas que mejoran la infección, especialmente aprovechando el gran volumen al que puede acceder la tomografía STEM.

Introducción

Figura 1: Comparación de diferentes técnicas de microscopía 3D, considerando resolución, instrumentación, tiempo de adquisición y esfuerzo. El volumen máximo factible de las técnicas se encuentra entre la tomografía crio-TEM técnicamente exigente que ofrece resolución molecular y la microscopía óptica, donde la resolución está limitada por el límite de difracción de la luz. Abreviaturas: TEM = microscopía electrónica de transmisión; STEM = TEM de exploración; SEM = microscopía electrónica de barrido; FIB = haz de iones enfocado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Las estructuras y sistemas relacionados con los virus abarcan una escala desde el régimen sub-angstrom (p. ej., moléculas pequeñas para viroterapia, proteínas virales aisladas) hasta varios metros (p. ej., organismos infectados completos). Las partículas virales están en el rango de 20-1.000 nm y se investigan principalmente en su contexto biológico, como las células huésped y las líneas celulares productoras de virus, que están en el rango de μm. Por lo tanto, la visualización de estructuras específicas relacionadas con virus depende de la elección de una técnica que proporcione un campo de visión suficiente y una resolución adecuada. El estudio de las células infectadas por el virus y los trozos de tejido se basa en técnicas de microscopía (Figura 1). Si bien las imágenes generales de células y tejidos se pueden adquirir mediante microscopía óptica clásica, las estructuras intracelulares involucradas en la replicación del virus a menudo se estudian mediante microscopía electrónica (EM). Aunque hoy en día se utiliza principalmente en la investigación virológica básica, la EM también se utiliza en el diagnóstico ^1,2 y también ha encontrado su camino en aplicaciones biofarmacéuticas³.

A menudo, los enfoques EM 2D como la microscopía electrónica de transmisión clásica (TEM) no pueden responder suficientemente a una pregunta biológica determinada. En virología, este es especialmente el caso cuando se estudian las interacciones virus-huésped-célula como la unión y entrada de viriones, la formación de fábricas virales o la morfogénesis de viriones 4,5,6,7,8,9. Por lo tanto, la tomografía EM se utiliza para analizar la ultraestructura 3D de muestras biológicas. En principio, hay dos formas de adquirir un tomograma de una determinada muestra: 1) imágenes paso a paso de cortes en serie que luego se combinan en una pila de imágenes 3D, o 2) adquisición de proyecciones desde diferentes ángulos de visión de la muestra seguida de una reconstrucción computacional de la información en una pila de imágenes virtuales.

Las técnicas del primer tipo incluyen imágenes de secciones seriadas por TEM o SEM (tomografía de matriz SEM), SEM de cara de bloque seriada y tomografía SEM de haz de iones enfocado (FIB). Las imágenes SEM y TEM de secciones seriadas carecen de la resolución en z, que está limitada por el grosor de la sección, pero proporciona un gran campo de visión y se basa en equipos que están fácilmente disponibles en la mayoría de los laboratorios de EM⁴. La tomografía FIB-SEM puede producir una resolución isotrópica, pero los costos de dispositivo y mantenimiento pueden ser un desafío, y la obtención de imágenes de células enteras con resolución isotrópica requiere mucho tiempo ^9,10.

El segundo tipo de tomografía se basa exclusivamente en la transmisión del haz de electrones a través de una muestra. Esto se puede hacer utilizando dos modalidades de imagen diferentes: TEM o microscopía electrónica de transmisión de barrido (STEM). Si bien la tomografía TEM está más extendida y es más fácil de implementar, el grosor de la sección está limitado a ~ 200 nm. Por lo tanto, las estructuras más grandes que el grosor de la sección, como las mitocondrias, las vesículas o los viriones, no se pueden visualizar dentro de un solo tomograma. La tomografía STEM ofrece la posibilidad de obtener imágenes de muestras de hasta 1 μm de espesor^11,12. Sin embargo, requiere un STEM con alto voltaje de aceleración (≥200 kV) y una configuración que admita ángulos de inclinación altos, así como un pequeño ángulo de semiconvergencia¹³. Aunque la imagen STEM es una técnica común en la ciencia de los materiales, sigue siendo una técnica rara en los laboratorios de EM biológicos.

Aquí, presentamos un enfoque basado en la aplicación para utilizar la tomografía STEM para muestras virológicas. Debido a la alta complejidad y la naturaleza laboriosa de la tomografía EM, la preparación de muestras de alta calidad es crucial. Si bien la TEM (tomografía) criogénica es sin duda el estándar de oro para las investigaciones a nivel molecular, las imágenes a temperatura ambiente de células congeladas a alta presión y sustituidas por congelación proporcionan una preservación sólida y claridad de la ultraestructura celular ^7,14. Brevemente, las células adherentes se cultivan en un disco de zafiro y se infectan o se tratan de otra manera como se desee. Luego, las células se inmovilizan congelándolas a alta presión a velocidades de enfriamiento muy altas, lo que resulta en la vitrificación del agua que contienen. Posteriormente, el agua se reemplaza por un solvente mientras las muestras se contrastan y se vuelven a llevar lentamente a temperatura ambiente. Luego, las muestras se incrustan gradualmente en resina.

Existen muchos protocolos para la congelación a alta presión y la sustitución por congelación, que difieren en la maquinaria, el sistema de transporte y la composición de la muestra. Se han publicado protocolos detallados para la congelación a alta presión, incluido uno de Walther et ^al.15, y un protocolo de video de Steyer et ^al.16, que se centra en la preparación de tejidos para FIB-SEM utilizando la mejora del contraste asistido por microondas. Para la investigación virológica, Read et ^al.17 y Romero-Brey¹⁸ publicaron protocolos detallados para la preparación de células infectadas por virus mediante congelación a alta presión con discos de zafiro y su posterior análisis mediante tomografía electrónica. También se ha descrito previamente el corte ultradelgado ^15,17. Consulte la bibliografía citada para obtener más detalles sobre estos enfoques.

Aquí, presentamos un flujo de trabajo que es una versión adaptada y actualizada de los protocolos publicados anteriormente^15,17 emparejados por primera vez con una guía de video detallada. El protocolo proporciona un flujo de trabajo para la preparación de muestras mediante congelación a alta presión, sustitución por congelación e inclusión en resina epoxi. Las secciones de 800 nm-1.000 nm de espesor se cortan con un ultramicrotomo. Se adquiere una serie basculante con un STEM de 200 kV, utilizando el software EM tools. Este protocolo está optimizado para células adherentes y proporciona un flujo de trabajo integral al tiempo que permite modificaciones para otros tipos de muestras, como células de tejido o suspensión. Para la tomografía STEM en condiciones criogénicas, consulte el trabajo del grupo^19,20 de Michael ^Elbaum.

Protocolo

1. Cultivo celular

1. Preparación de discos de zafiro
   1. Limpie los discos de zafiro lavándolos 3 veces en etanol al 100% durante 20 min. Elimine el etanol restante tirando de los discos sobre un papel de filtro seco. Deje los discos en una cámara de secado a 37 °C durante al menos 30 min, o hasta que estén completamente secos.
      NOTA: En este protocolo, se utilizan discos de zafiro con un diámetro de 3 mm y un grosor de 0,16 mm. Para otros sistemas, un flujo de trabajo optimizado para células tisulares o en suspensión, consulte Walther et ^al.15. McDonald et ^al.21 proporcionan algunos "consejos y trucos" para células cultivadas y otros sistemas.
   2. Cubra con carbono los discos de zafiro colocando aproximadamente 50 discos de zafiro planos sobre un cristal de reloj limpio y cubriéndolos con una capa de carbono de 10-15 nm de espesor utilizando un dispositivo de recubrimiento de carbono. Hornee los discos durante la noche a 120 ° C para estabilizar la capa de carbono.
      NOTA: Para enfoques EM correlativos, introduzca un sistema de coordenadas: coloque una rejilla de búsqueda en la parte superior de los discos de zafiro antes del recubrimiento de carbono, de modo que la rejilla sea visible como un negativo en el disco²¹.
   3. Para poder identificar el lado recubierto de carbono del disco de zafiro más adelante, use una herramienta afilada (por ejemplo, la punta de una pinza) para rayar una marca en el carbón que solo se puede leer correctamente desde un lado.
      NOTA: Recomendamos el número "2" o similar (Figura 2A, B). Omita este paso para discos de zafiro con un sistema de coordenadas recubierto.
   4. Guarde los discos de zafiro en una cámara de secado a 37 °C hasta su uso posterior.
      NOTA: No se recomienda reutilizar discos de zafiro, ya que esto aumenta la probabilidad de que se rompan durante la congelación a alta presión.
2. Cultivo celular
   1. Poco antes de la colocación en cultivo celular, descargue el lado recubierto de carbono de los discos con un dispositivo de descarga incandescente para hacerlos hidrófilos (por ejemplo, 0,26 mbar con una corriente de 20 mA durante 40 s). Luego, esterilice los discos exponiéndolos a la luz ultravioleta durante 15 minutos.
      NOTA: La exposición a la luz ultravioleta durante más de 30 minutos puede dañar el recubrimiento de carbono.
   2. Use pinzas estériles para colocar los discos en el fondo de una placa de cultivo que contenga medios, asegurándose de que los discos no floten. Siembre con cuidado las células en la parte superior. En caso de que los discos de zafiro floten en los medios de cultivo celular, descargue el brillo durante más tiempo al repetir el experimento.
      NOTA: Es crucial que el "2" esté correctamente orientado, lo que significa que el lado recubierto de carbono mira hacia arriba. Se desea una monocapa celular en los discos con una confluencia final de ~ 80%. El crecimiento celular en los discos de zafiro puede diferir del de la placa de cultivo circundante. Verifique la distribución y la calidad de las células en los discos con un microscopio de luz invertida antes de continuar con el protocolo. La distribución de las células se puede mejorar balanceando suavemente la placa mientras se siembran las células.
      Para las celdas de suspensión, cubra los discos de zafiro recubiertos de carbono con poli-L-lisina o use capilares, como se describe en¹⁵. No exponga los discos cubiertos de poli-L-lisina a la luz ultravioleta, ya que esto puede dañar el recubrimiento de poli-L-lisina.
   3. Realice cualquier tratamiento deseado de las células (por ejemplo, infección, tratamiento farmacológico) mientras mantiene los discos de zafiro en su lugar. Manipule los discos con cuidado para evitar que se desprendan las celdas o rayen la capa de carbono. Incube las células en consecuencia. Realice la prefijación química con, por ejemplo, glutaraldehído al 2,5%, sacarosa al 1% en tampón de fosfato 0,1 M (pH 7,3) o paraformaldehído al 4%, de acuerdo con las regulaciones locales, antes de transportar las muestras al congelador de alta presión ^1,7,22.
      NOTA: Antes de que las muestras infectadas salgan de los laboratorios de nivel de bioseguridad, cumpla con todas las regulaciones locales de bioseguridad aplicables al sistema modelo.

Figura 2: Congelación a alta presión. (A) Discos de zafiro que muestran una capa de carbono con "2" (izquierda) o un sistema de coordenadas para microscopía electrónica y de luz correlativa (derecha). (B) Representación esquemática de un sándwich SD-espaciador de oro-SD mientras se prepara para la congelación a alta presión. Las células cultivadas en los discos se enfrentan entre sí y, por lo tanto, están protegidas en la cavidad estrecha. (C) Soporte para congelación a alta presión que contiene un sándwich SD. (D) Materiales y dispositivos para cargar el soporte HPF: (1) Placa calefactora, (2) Microscopio estereoscópico, (3) Papel de filtro, (4) Tubo de reacción que contiene 1-hexadecino, (5) Pinzas, (6) SD sin recubrimiento, (7) Placa de Petri con espaciadores dorados, (8) Soporte HPF. (E) Configuración del sistema HPF: (1) LN-box para transferir muestras congeladas (ver también F), (2) secador de pelo para acelerar el calentamiento del soporte HPF después de la congelación, (3) Dewar de nitrógeno para rellenar la caja LN. (F) Caja LN para contener muestras congeladas después de la congelación a alta presión con un canal central (contorno punteado) en el que se puede abrir el soporte HPF y manipular las SD de manera segura. Materiales necesarios directamente después de la congelación a alta presión: (1) Soporte para hasta seis recipientes de muestra, (2) pinzas aisladas, (3) recipientes de muestra con tapa. Los recipientes contienen pequeños orificios y pesos pequeños (por ejemplo, un tornillo) para que se sumerjan en nitrógeno líquido. Abreviaturas: SD = disco de zafiro; HPF = congelador de alta presión; LN = nitrógeno líquido. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

2. Preparación de muestras para microscopía electrónica

1. Congelación a alta presión
   NOTA: Este protocolo describe la congelación a alta presión con el congelador de alta presión al que se hace referencia (HPF, Tabla de materiales). Los pasos descritos no deberían diferir mucho para otras máquinas, ya que tienen el mismo propósito.
   1. Siga las instrucciones del fabricante para configurar el congelador de alta presión. Asegúrese de un suministro adecuado de nitrógeno líquido (Figura 2E), encienda la máquina y realice una prueba de funcionamiento.
   2. Configure un espacio de trabajo para cargar los discos en el soporte HPF (Figura 2D). Tenga listos los siguientes elementos: una placa calefactora (1), un microscopio estereoscópico (2), trozos de papel de filtro (3), tubo de reacción con hexadeceno como relleno (4), pinzas (5), discos de zafiro vacíos / sin recubrimiento para congelar un número impar de SD con celdas (6), espaciadores de oro (7) y el soporte HPF (8, detalle en la Figura 2C).
   3. Prepare un espacio de trabajo para manipular muestras congeladas (Figura 2E, F). Antes de comenzar la congelación a alta presión, prepare los siguientes equipos:
      1. Prepare la LN-box y llénela con nitrógeno líquido (Figura 2E, F) en preparación para manipular y transferir los discos de zafiro congelados desde el soporte HPF a las cápsulas de almacenamiento.
      2. Prepare un pequeño dewar (3 en la Figura 2E) y llénelo con nitrógeno líquido: prepárese para rellenar la LN-box con nitrógeno líquido varias veces durante el proceso de congelación.
      3. Mantenga listas las pinzas aisladas (2 en la Figura 2F).
      4. Prepare recipientes de muestra que contendrán los discos de zafiro después de la congelación a alta presión (cápsulas de almacenamiento, 3 en la Figura 2F). Asegúrese de que tengan una tapa y varios orificios para verter nitrógeno líquido y pesos pequeños (por ejemplo, tornillos pequeños o similares) para asegurarse de que no floten. Etiquete los recipientes antes de usarlos y enfríelos previamente en la caja LN.
         NOTA: Utilizamos cápsulas BEEM como cápsulas de almacenamiento.
   4. Mantenga las muestras en una incubadora cerca del congelador de alta presión si las células no han sido prefijadas, o si no es posible, en una placa calentada (1 en la Figura 2D), para mantener las condiciones fisiológicas (37 ° C, 5% de CO₂) el mayor tiempo posible.
   5. Asegúrese de que haya un número suficiente de células en los discos de zafiro y de una buena calidad de las células antes de iniciar la congelación a alta presión. Para hacerlo, inspeccione los discos con un microscopio de luz invertida.
   6. Realice congelación a alta presión.
      1. Tome un disco de zafiro de la placa de cultivo con unas pinzas y colóquelo en el soporte HPF (Figura 2C) con el lado recubierto de carbono hacia arriba ("2" es legible). Antes de eso, elimine el exceso de medio sumergiendo el disco rápidamente en papel de filtro, pero tenga cuidado de no dejar que las celdas se sequen.
      2. Sumerja un espaciador de oro en hexadeceno y colóquelo con cuidado encima del disco de zafiro. Tome un segundo disco de zafiro y colóquelo encima del espaciador dorado con el lado recubierto de carbono hacia abajo, formando un disco de zafiro - espaciador de oro - sándwich de disco de zafiro con las celdas apuntando una hacia la otra. Asegúrese de que no haya aire atrapado en la cavidad del sándwich.
      3. Cierre el soporte HPF. Realice este paso con cuidado pero rápidamente para minimizar el estrés en la muestra, especialmente para las células vivas que no han sido prefijadas.
         NOTA: Para muestras que contienen sustancias cancerígenas, mutágenas o tóxicas para la reproducción (CMR), como fijadores químicos, cargue el soporte HPF debajo de una campana extractora para minimizar la exposición.
      4. Inicie el proceso de congelación. Inserte rápidamente el soporte HPF en el congelador de alta presión, bloquéelo de acuerdo con las instrucciones del fabricante e inicie el proceso de congelación.
   7. Retire las muestras vitrificadas del soporte HPF. Transfiera rápidamente la punta del soporte HPF que transporta los discos de zafiro ahora congelados a la LN-box preenfriada. Retire los discos con cuidado del soporte HPF en el canal central de la caja LN (línea discontinua en la Figura 2F). Después de eso, caliente el soporte HPF y retire el etanol residual o hexadeceno antes de comenzar a ensamblar el siguiente sándwich.
      NOTA: A partir de ahora, asegúrese de que todo lo que toque los discos esté preenfriado en nitrógeno líquido. Realice los pasos de transferencia rápidamente en una atmósfera de nitrógeno y almacene los discos en nitrógeno líquido para evitar la descongelación de la muestra. Practique la transferencia del soporte de la HPF a la LN-box con anticipación para garantizar una transición suave y rápida. El proceso de calentamiento del soporte se puede acelerar después de la congelación usando un secador de pelo (2 en la Figura 2E).
   8. Después de retirar los discos de zafiro del soporte, colóquelos en los recipientes etiquetados para transferirlos al dispositivo de sustitución por congelación o para almacenarlos con nitrógeno líquido hasta su posterior procesamiento. Si los discos de zafiro están apilados juntos después de HPF, use un bisturí para separar los discos de zafiro antes de la sustitución por congelación.
      NOTA: Tenga cuidado de no romper los discos y evite fuerzas de cizallamiento. Planifique suficiente tiempo para este paso.
2. Congelación-sustitución
   1. Configure el dispositivo de sustitución por congelación siguiendo las instrucciones del fabricante. Llene el dewar de nitrógeno líquido e inicie el programa para preenfriar la cámara de muestras a -90 °C. Asegúrese de que haya suficiente nitrógeno líquido para todo el proceso de sustitución.
      NOTA: Los productos químicos involucrados son peligrosos. Realice todos los pasos bajo una campana extractora y cumpla con las pautas locales de medio ambiente, salud y seguridad (EHS).
   2. Prepare la solución de sustitución por congelación que contenga acetato de uranilo al 0,1% (p/v), tetróxido de osmio (OsO₄) al 0,2% (p/v) y 5% (v/v) de agua en acetona. Para preparar un volumen de 6 ml (suficiente para llenar 24 crioviales, lo que equivale a la capacidad máxima del dispositivo de sustitución utilizado aquí), siga estos pasos:
      1. Pesa 6 mg de acetato de uranilo en un recipiente de vidrio con tapa hermética.
      2. Agregue 300 μL de tetróxido de osmio al 4% (p / v) en agua.
      3. Cierre el recipiente y sonique durante 5 min para disolver el acetato de uranilo.
      4. Agregue 5,7 ml de acetona, mezcle y divida uniformemente la solución en crioviales compatibles con el dispositivo de sustitución por congelación.
   3. Coloque los viales criogénicos cerrados que contienen la solución de sustitución por congelación en el dispositivo de sustitución por congelación preenfriado a -90 °C y espere hasta que la solución también se enfríe a -90 °C (durante aproximadamente 20 min).
   4. Llene la caja LN con nitrógeno líquido. Para transferir los discos de zafiro al dispositivo de sustitución por congelación, enfríe previamente las pinzas, un bisturí y unos alicates (o pinzas grandes) en nitrógeno líquido.
   5. Utilice las pinzas grandes preenfriadas para transferir las cápsulas de almacenamiento con las muestras congeladas a alta presión desde el tanque de almacenamiento a la caja LN.
      NOTA: Trabaje rápidamente para evitar la descongelación de las muestras. Al procesar muestras directamente después de la congelación a alta presión, se puede omitir este paso.
   6. Transfiera las muestras congeladas a alta presión al dispositivo de sustitución por congelación. Separe los discos de zafiro uno por uno mientras los mantiene en nitrógeno líquido. Transfiera rápidamente cada disco individualmente a un criovial con solución de sustitución por congelación, asegurándose de que el disco esté completamente sumergido. Cierre el criovial y vuelva a colocarlo inmediatamente en el dispositivo de sustitución por congelación.
      NOTA: Durante la transferencia, mantenga el criovial en la atmósfera de nitrógeno líquido para evitar que la solución de sustitución se caliente, pero no en nitrógeno líquido para evitar que se congele. Sostenga el vial con los dedos cerca de la tapa para evitar que la solución de sustitución se caliente. Manipule la solución de sustitución con cuidado, ya que contiene sustancias tóxicas.
   7. Una vez que todos los discos se transfieren al dispositivo de sustitución, inicie el proceso de sustitución de congelación. Configure el dispositivo para que aumente gradualmente la temperatura durante 16 h de -90 °C a 0 °C, con un paso de incubación de 1 h a 0 °C, seguido de un aumento gradual a 20 °C durante 1 h.
   8. Tan pronto como las muestras alcancen los 20 °C, continúe directamente con el lavado de las muestras durante 3 x 30 min con acetona al 100%.
      NOTA: No deje que las celdas de los discos se sequen. Realice todos los pasos posteriores bajo una campana extractora. Recoja todos los desechos en un contenedor adecuado y deséchelos de acuerdo con las regulaciones locales de EHS.
3. Incrustación
   1. Prepare resina epoxi recién preparada de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
      NOTA: Realice todos los pasos con resina epoxi debajo de una campana extractora. Recomendamos preparar resina nueva para cada procedimiento de inclusión debido a la menor viscosidad y, por lo tanto, a una mejor infiltración de la muestra.
   2. Para preincrustar las muestras, incube las muestras en una solución que contenga 1/3 de resina epoxi y 2/3 de acetona durante 1 h. Reemplace la solución con 2/3 de resina epoxi y 1/3 de acetona e incube durante 3 h. Cambie la solución con resina epoxi 100% y déjela incubar durante la noche con la tapa del vial abierta para permitir que la acetona restante se evapore.
   3. Al día siguiente, transfiera los discos de zafiro a tubos de reacción nuevos y etiquetados llenos de resina epoxi recién preparada. Coloque los discos horizontalmente, apoyados en la pared del tubo de reacción, y asegúrese de que el lado con las células mire hacia arriba en el tubo de reacción (el "2" se puede leer con un microscopio estereoscópico). Colocar los tubos de reacción con la tapa abierta en un horno a 60 °C y dejar polimerizar la resina epoxi durante al menos 48 h.
      NOTA: Si es necesario incrustar un fragmento de disco de zafiro, insértelo con la ayuda de una punta polimerizada de un bloque de resina de un experimento anterior: Coloque la punta en el tubo de reacción, rellene el tubo con resina fresca y coloque el disco roto encima de la punta polimerizada.
      Cualquier consumible de un solo uso contaminado con resina epoxi debe colocarse en un horno a 60 °C para permitir que la resina se polimerice completamente antes de desecharla. Las pinzas y otros artículos se pueden limpiar con etanol de antemano.
   4. Sumerja la punta de un tubo de reacción cerrado en nitrógeno líquido durante aproximadamente 10 s. Posteriormente, retire el bloque de resina del tubo de reacción golpeando el tubo de reacción sobre la mesa. El disco de zafiro se separa fácilmente de la capa de carbono que permanece en la parte superior de las celdas incrustadas.
      NOTA: Asegúrese de que su medio de inclusión tolere los cambios de temperatura inducidos por el tratamiento con nitrógeno líquido.
4. Preparación de secciones de tomografía STEM
   1. Prepare secciones que sean mucho más gruesas que las secciones ultrafinas para la obtención de imágenes TEM, generalmente entre 800 nm y 1 μm.
      NOTA: La preparación de secciones para la tomografía STEM difiere ligeramente de la ultramicrotomía convencional. Para un protocolo detallado que describe la preparación de las secciones de tomografía STEM, consulte Walther et ^al.15 y Villinger et ^al.10.
      Antes de continuar con la preparación de los tramos de tomografía STEM, asegúrese de que la calidad de las células es buena. Para ello, realice un corte ultrafino (~70 nm) y un análisis TEM (Figura 3D, E).
   2. Recoja las secciones en rejillas de cobre de barras paralelas, de modo que ninguna barra de rejilla bloquee el haz de electrones al inclinar la muestra en ángulos altos. Para una mejor fijación de la sección, trate las rejillas con poli-L-lisina al 0,01%: prepare una pequeña alícuota de poli-L-lisina al 0,01% a partir de una solución madre al 0,1%, sumerja las rejillas en la alícuota, séquelas cuidadosamente arrastrando el borde de la rejilla sobre un papel de filtro. Descarga las rejillas y úsalas para recolectar las secciones.
   3. Tratar las secciones con oro coloidal como marcadores fiduciales para la alineación de la serie de inclinación (ver sección 3).
   4. Aplique una capa de carbono a las secciones para estabilizarlas y hacerlas más conductoras.

Figura 3: Control de calidad mediante TEM: diferentes apariencias de las células después de la inclusión, el recorte y el corte ultrafino. (A) Celdas incrustadas en resina epoxi después de que se eliminó la SD. La capa de carbono con el '2' rayado permanece en las celdas incrustadas en resina y es claramente visible. Las celdas casi transparentes se distribuyen uniformemente por la cara del bloque. (B) Cara del bloque recortada antes de la microtomía. Parte del 2 rayado todavía es visible en la superficie del bloque de resina. (C) Secciones de 70 nm de espesor montadas en una rejilla TEM. (D) Visión general de TEM de una sección ultrafina completa. Tenga en cuenta los agujeros en la sección (puntas de flecha blancas) que resultan de la infiltración incompleta de resina y son un artefacto común. (E) Vista ampliada de una celda seleccionada marcada con un rectángulo blanco en (D). Similar a (D), la inclusión incompleta es visible en la membrana plasmática (puntas de flecha blancas); sin embargo, el resto de la célula muestra una buena conservación e incrustación. Barras de escala = 100 μm (D), 10 μm (E). Abreviaturas: SD = disco de zafiro; TEM = microscopía electrónica de transmisión. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

3. Imágenes

1. Adquisición de la serie de inclinación STEM
   1. Configure el microscopio de acuerdo con las pautas del fabricante. Asegure la alineación adecuada de la viga.
   2. Llene con cuidado el dewar de nitrógeno líquido en el microscopio.
   3. Seleccione el soporte de tomografía correcto en el software de operación del microscopio.
   4. Inserte la rejilla en el soporte. Preste atención a que las barras de la rejilla estén orientadas perpendicularmente al eje de inclinación para evitar que las barras bloqueen el haz de electrones en ángulos de inclinación altos.
   5. Inserte el soporte en el microscopio.
   6. Alinee la viga realizando los siguientes pasos:
      1. Cargue el archivo de alineación proporcionado por el fabricante. Abra la válvula de haz y trabaje en modo TEM por ahora. Establezca un aumento de aproximadamente 20,000x y establezca el enfoque estándar presionando STD Focus.
      2. Busque un agujero en la muestra. Esto es más fácil en el modo de bajo aumento (presione LowMag).
      3. Asegúrese de que no haya ninguna abertura insertada. Establece el tamaño del punto en 1 y el Alfa en 3. Minimice el haz en la pantalla de visualización girando el botón de brillo en sentido contrario a las agujas del reloj y céntrelo con los botones de cambio de haz.
      4. Alineación correcta de la pistola: En el panel de alineación del software de operación del microscopio, seleccione Pistola y el wobbler del ánodo. Ajuste la simetría del haz con los botones DEF/STIG . Confirme que el movimiento del haz en la pantalla fluorescente es homogéneo. Mueva el punto más brillante al centro de la pantalla con los botones SHIFT ; Anule la selección de todo cuando haya terminado.
      5. Corregir estigmatizadores de condensador: En el mismo panel de alineación , seleccione CLA y HT wobbler. Ajuste con los botones DEF / STIG para lograr un movimiento homogéneo.
      6. Ajuste la apertura de la lente del condensador: maximice el haz en la pantalla fluorescente girando el botón de brillo en el sentido de las agujas del reloj. Inserte la apertura de la lente de condensador más pequeña y asegúrese de que esté alineada correctamente en el haz alternando el brillo. Si el haz se mueve asimétricamente en la pantalla de visualización, ajuste manualmente la apertura usando los accionamientos de apertura manuales. Si la apertura aparece distorsionada en la pantalla fluorescente, corrija nuevamente los estigmatizadores del condensador CLA con DEF / STIG (paso anterior 3.1.6.5).
      7. Cambie al modo STEM (seleccione ASID).
         NOTA: Puede interrumpir el diálogo de relajación de la lente después de 5-10 s.
      8. Mueva el escenario a una región delgada y rica en contraste de la muestra. Presione STD Focus y elimine todas las aberturas. Cambie a 25.000 aumentos con un tamaño de punto de 1,5 nm, ajuste la longitud de la cámara entre 80 y 120 cm y seleccione el modo de punto.
      9. Cambie el valor z del goniómetro hasta que el ronchigrama sea visible en la pantalla de visualización. Cambie la duración de la cámara si el ronchigrama es tenue. Si no es redondo, use el botón COND Stig para ajustarlo.
      10. Inserte la apertura de lente de condensador más pequeña. Utilice los accionamientos de apertura manuales para centrar la apertura alrededor del ronchigrama.
   7. Inserte el detector apropiado. Según la pregunta de investigación, use el detector de campo claro y/o el detector de campo oscuro. Active el modo de escaneo y adquiera una primera imagen de prueba de la muestra.
   8. Seleccione un aumento mayor que el deseado para el tomograma (superior a 800.000x). Enfoque correcto y astigmatismo: haga esto cerca pero no directamente en la región de interés (ROI) para evitar daños en el haz en áreas críticas de la muestra.
      NOTA: Los marcadores fiduciales de oro pueden facilitar este paso.
   9. Establezca la altura eucéntrica para asegurarse de que el ROI permanezca centrado en todo el rango de inclinación (es decir, -72 ° a 72 °). Seleccione una característica cerca del ROI, llévela al centro, enfoque, corrija el astigmatismo e incline el escenario paso a paso a - 72 °. Ajuste la posición z del soporte para mantener la función centrada y ajustar el contraste y el brillo si es necesario. Si es necesario, repita esto inclinando paso a paso a +72 °.
   10. Elija el campo de visión navegando de vuelta al ROI, enfoque y adquiera una imagen general (Figura 4). Establezca el aumento deseado para la adquisición de la serie de inclinación.
   11. Configure la adquisición automática en serie de imágenes de -72° a +72° e imagen cada 1,5°.
   12. Para contrarrestar los efectos mecánicos que se producen al cambiar la dirección de la inclinación de la platina, comience la serie de inclinación con un ángulo más grande que el que se va a iniciar para obtener imágenes. Si se obtiene una imagen de -72° a 72°, comience inclinando la platina de 0° a -74° y luego comience la adquisición de imágenes en el camino a +72°, adquiriendo la primera imagen a -72°.
   13. Inicie la adquisición automática de la serie de inclinación. Asegúrese de habilitar el enfoque dinámico en el software de adquisición.
       NOTA: Si la adquisición de la serie de inclinación finaliza prematuramente, corrija la altura eucéntrica. Especialmente con un aumento mayor, esto puede causar problemas con la adquisición automatizada de la serie de inclinación debido a la migración del ROI fuera del campo de visión.
       Un software de uso común para la tomografía STEM y TEM es SerialEM. Kirchweger et ^al.20 han publicado un protocolo de video para tomografía Cryo-STEM utilizando SerialEM, que se puede adaptar fácilmente para tomografía STEM a temperatura ambiente.

Figura 4: Adquisición de la serie Tilt . (A) STEM de 200 kV. (B) Descripción general de STEM de una celda congelada a alta presión y sustituida por congelación incrustada en resina epoxi. La serie de inclinación que se muestra en (C-E) se adquirió en la posición marcada con el rectángulo blanco. (C-E) Imágenes seleccionadas de una serie de inclinación adquiridas de -72° a +72°. Los fiduciales de oro en ambos lados de la sección se utilizan para la reconstrucción de tomogramas computacionales. Los fiduciales agrupados como los marcados con las elipses blancas no se pueden usar para la reconstrucción del tomograma, pero son bien reconocibles en ángulos de inclinación altos. Esas estructuras o estructuras similares fuera de la región de interés son útiles para establecer la altura eucéntrica. Barra de escala = 1 μm (B). Abreviatura: STEM = microscopía electrónica de transmisión de barrido. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

4. Reconstrucción y segmentación por tomografía

1. Realizar la reconstrucción del tomograma (por ejemplo, con el software Etomo del paquete de software IMOD²³).
   1. Realice la primera alineación de la serie de inclinación y reconstruya el tomograma utilizando una proyección posterior ponderada.
      NOTA: Se puede encontrar un protocolo detallado en el sitio web de IMOD: Guía de tomografía IMOD (https://bio3d.colorado.edu/imod/doc/tomoguide.html). Para el procesamiento de imágenes adquiridas con el detector de campo oscuro, consulte el trabajo publicado anteriormente^11,13.
2. Segmentar estructuras celulares (por ejemplo, con software como 3DMOD del paquete IMOD o soluciones basadas en IA).

Resultados

La tomografía STEM ofrece la posibilidad de obtener imágenes de secciones más gruesas que la tomografía TEM con resolución isotrópica en el rango nanométrico y, en comparación con la tomografía FIB-SEM, proporciona un flujo de trabajo de imágenes relativamente eficiente en el tiempo. En virología, esto es especialmente útil ya que permite obtener imágenes de una gran cantidad de características ultraestructurales para análisis estadísticos en 3D o cuando se buscan eventos raros. A continuación, mostramos dos resultados representativos que demuestran cómo se puede utilizar la tomografía STEM con respecto a estos dos aspectos.

Visualización de viriones VSV recombinantes en ciernes

Existe una amplia variedad de virus que forman partículas de diferentes formas y tamaños. Para analizar la forma de los viriones en una suspensión de virus, a menudo es suficiente un método simple como TEM de tinción negativa. Caracterizar la morfología de los viriones en el contexto celular es más difícil. Esto es especialmente cierto para los virus que forman partículas con morfología anisotrópica, como rhabdoviridae. VSV es un rabdovirus que forma viriones en forma de bala de ~180 nm de longitud. En las células en suspensión, los viriones están orientados aleatoriamente, lo que dificulta discernir siempre la forma de la bala en las imágenes 2D (Figura 5A-C). Para definir correctamente la forma de bala de todos los viriones VSV recombinantes en una muestra, se necesita un método 3D con resolución isotrópica, uno que también pueda proporcionar información volumétrica en un área de muestra suficientemente grande. Una tomografía STEM puede incluir muchos viriones completos en un solo conjunto de datos (Figura 5D, E). De este modo, es posible obtener imágenes de un gran número de viriones para el análisis estadístico, incluso si solo se adquiere un tomograma por célula. En comparación, un tomograma TEM de una sección de 200 nm de espesor solo capturaría unos pocos viriones VSV recombinantes completos (como se indica en la Figura 5E).

Figura 5: Tomografía STEM de sitios de gemación VSV recombinantes. (A-C) Los detalles de una sección virtual de una tomografía STEM obtenida de una sección de 800 nm de espesor muestran que la forma de la bala no siempre es visible debido a (A, B) diferentes orientaciones de los viriones. (C) Solo los viriones que están orientados paralelos al plano de visión se presentan como balas bien definidas. (D) Los sitios de gemación de VSV recombinante se asemejan a grandes grupos de viriones sin orientación preferida. (E) La vista lateral de la tomografía demuestra la capacidad de capturar muchos viriones VSV recombinantes completos en una sección mediante tomografía STEM. La pila de imágenes virtuales tiene un grosor de aproximadamente 600 nm en esta posición. Las líneas discontinuas representan el grosor aproximado de una sección para tomografía TEM (200 nm), donde solo se incluirían unos pocos viriones completos en forma de bala. Barra de escala = 500 nm (D). Abreviaturas: STEM = microscopía electrónica de transmisión de barrido; VSV = virus de la estomatitis vesicular. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Degradación de nanofibrillas peptídicas EF-C

En el contexto de la terapia génica, las nanofibrillas peptídicas que mejoran la transducción se han convertido en un tema de interés. En un estudio publicado recientemente²⁴, se utilizaron imágenes correlativas utilizando imágenes de transferencia de energía por resonancia de Foerster (FRET) y tomografía STEM (FRET-3D-CLEM) para investigar la captación y el desensamblaje de nanofibrillas peptídicas EF-C. Las altas eficiencias de FRET, correspondientes a pares FRET que están cerca unos de otros, emiten fluorescencia roja correspondiente a fibrillas ensambladas. Las bajas eficiencias de FRET, correspondientes a pares de FRET que están lejos unos de otros, emiten fluorescencia verde, que representan fibrillas desmontadas. Ambas señales aparecen en las células cuando están en el proceso de absorber y degradar las nanofibrillas peptídicas EF-C. Las áreas donde se encuentran eficiencias FRET altas y bajas aparecen en amarillo (Figura 6A).

Figura 6: Imágenes de la degradación de nanofibrillas peptídicas EF-C mediante imágenes FRET correlativas y tomografía STEM (FRET-3D-CLEM). (A) Microscopía confocal de una célula incubada con nanofibrillas EF-C que fueron marcadas con un par FRET. Las señales verdes corresponden a fibrillas supuestamente desmontadas. El rojo corresponde a fibrillas supuestamente intactas. El amarillo corresponde a las áreas donde se detecta una mezcla de la señal roja y verde. Nu núcleo. (B) Descripción general de STEM de una sección de 800 nm de espesor de la misma celda. (C) Se indica la posición del tomograma. La imagen es una composición de dos imágenes adquiridas en diferentes secciones, porque la celda estaba parcialmente bloqueada por la cuadrícula de barras en una de las secciones. El núcleo está marcado con Nu en A, B y C. (C) Sección virtual del tomograma. Las puntas de flecha rojas marcan regiones que se superponen con señales de fluorescencia roja. La tomografía STEM confirma la presencia de fibrillas intactas. La punta de flecha verde apunta a una región con fibrillas desmontadas. (D) Segmentación del tomograma. Un filopodio endocitosado está pellizcando la membrana de la vesícula (flecha blanca). El gran volumen que se puede investigar con una tomografía STEM (aquí aproximadamente: 7 μm x 7 μm x 550 nm) facilita la observación de un evento tan raro. (E) Secciones virtuales 19, 24 y 29 del tomograma. Con un tamaño de píxel de 6,8 nm, las secciones están separadas por 27,2 nm cada una. La cifra se reproduce a partir de los datos publicados por Rauch-Wirth et ^al.24 . Barras de escala = 5 μm (A), 1 μm (C). Abreviaturas: STEM = microscopía electrónica de transmisión de barrido; FRET = Transferencia de energía de resonancia de Foerster. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La visualización se realizó mediante este enfoque correlativo para confirmar que las fibrillas EF-C son absorbidas por la célula y posteriormente degradadas. La microscopía óptica nos permite elegir células para microscopía electrónica que proporcionan señales rojas y verdes, para comparar la apariencia ultraestructural correlacionada con las diferentes señales de fluorescencia. Los tomografías STEM de la misma célula muestran que la señal roja puede originarse en fibrillas que aún están fuera de la célula o aparentemente recién internalizadas por macropinocitosis (Figura 6C). Además, CLEM verificó que la señal verde efectivamente se originó a partir de fibrillas degradadas (Figura 6B, C que se pueden encontrar en los lisosomas (Figura 6C, vesícula más grande). Debido al gran volumen accesible por tomografía STEM y la visualización 3D de las estructuras, es más fácil correlacionar la señal de la microscopía óptica con las características ultraestructurales e interpretarlas. Además, con este enfoque se pueden detectar eventos raros, como filopodios pellizcados dentro del lisosoma (Figura 6D, E, flecha blanca).

Discusión

La tomografía STEM ofrece una resolución comparable a la tomografía TEM combinada con la capacidad de investigar volúmenes con un grosor de hasta 1 μm. Por lo tanto, lo consideramos ideal para obtener imágenes de cambios inducidos por virus en las estructuras intracelulares, como la remodelación de la membrana ^4,6,25, la gemación de viriones 7 o la endocitosis 5. Dependiendo de la pregunta de investigación, se pueden considerar otras técnicas de VolumeEM. Para una técnica que proporciona un campo de visión más grande con una resolución comparable, recomendamos la tomografía FIB-SEM. La tomografía FIB-SEM será más lenta que la tomografía STEM cuando se obtenga una imagen de un volumen comparable con una resolución similar, ya que el tiempo de imagen aumenta cuando aumenta la resolución. A menudo, esto se contrarresta imaginando campos de visión más pequeños. Además, una resolución z de 6,8 nm (Figura 6) sería técnicamente desafiante con el fresado por haz de iones. Por lo tanto, FIB-SEM es óptimo para obtener imágenes de estructuras más grandes como células enteras y tejidos 9,10,26,27, aunque generalmente con tamaños de píxeles (isotrópicos) de varias decenas de nanómetros. Además, las tomografías FIB-SEM no muestran efectos de "cuña faltante", lo cual es típico de los tomogramas reconstruidos a partir de una serie de inclinación. Además, con el desarrollo de las máquinas FIB de plasma, actualmente se están introduciendo en el campo alternativas que proporcionan un fresado más rápido y preciso.

Si una alta resolución en z no es crucial, las imágenes TEM o SEM de secciones seriadas pueden ser una alternativa que permita la investigación de un campo de visión muy grande en poco tiempo ^28,29, sin embargo, generalmente con resolución anisotrópica. En la tomografía TEM, se pueden combinar diferentes tomografías de secciones gruesas seriadas^30,31. Lo mismo es posible en la tomografía STEM; Sin embargo, dado el grosor de las secciones que se pueden investigar, hay menos necesidad de combinar varios tomogramas. En virología, la tomografía TEM se usa a menudo para caracterizar la remodelación de la membrana inducida por virus 32,33,34,35. Si bien la tomografía TEM en sí misma proporciona información valiosa sobre el ciclo de replicación de los virus, la mayoría de los casos de uso se beneficiarían de la capacidad de la tomografía STEM para obtener imágenes de volúmenes más gruesos. Esto es especialmente cierto para viriones con morfología anisotrópica, como rhabdoviridae, donde la tomografía TEM solo puede capturar unos pocos viriones completos en un tomograma³⁵ o para obtener imágenes de varios viriones envolventes en un compartimento de replicación con un tamaño del complejo de ensamblaje viral citoplasmático (cVAC) del citomegalovirus humano (HCMV)⁴.

La tomografía STEM en condiciones criogénicas ofrece más información funcional¹⁹ y se dispone de un protocolo de video²⁰. Nuestro protocolo difiere en el flujo de trabajo de preparación de muestras, que, en lugar de preservar la muestra en el estado nativo, proporciona una preservación ultraestructural casi nativa. Si bien la tomografía STEM de muestras congeladas a alta presión y sustituidas por congelación no puede lograr la preservación ultraestructural y la resolución atómica observadas en la EM criogénica, se beneficia de las ventajas de un equipo más simple, muestras más estables y un mayor rendimiento.

Los siguientes pasos son fundamentales para el éxito del método:

Primero, un objetivo claro del experimento de imágenes. Debido a la naturaleza laboriosa de la técnica, se necesita un experimento bien planificado con un objetivo claro para obtener imágenes. El conocimiento detallado del sistema modelo (línea celular y virus) debe generarse de antemano mediante el uso de otros métodos que son menos difíciles de realizar. Por lo tanto, fomentamos la optimización de las tasas de infectividad en los experimentos previos basados en microscopía óptica y el ajuste de las condiciones experimentales para adaptarse al sistema biológico. Los parámetros de optimización incluyen el número de células, la multiplicidad de infecciones (MOI) y los puntos de tiempo basados en el virus y el evento que se va a fotografiar. Esto asegurará una alta proporción de células evaluables en la muestra.

En segundo lugar, preparación de muestras de alta calidad. Enfatizamos la importancia de una preparación de muestras de calidad. En la actualidad, consideramos la vitrificación por congelación a alta presión como el estándar de oro para muestras gruesas como las células. La sustitución por congelación, la inclusión y la posterior obtención de imágenes a temperatura ambiente es una forma sólida de obtener resultados de alta calidad cuando se combina con la tomografía STEM. Por lo tanto, es crucial establecer una rutina estable para la preparación de muestras. Para ello, nos gustaría destacar la literatura sobre congelación a alta presión^14,21. Si se va a utilizar una solución de sustitución por congelación menos tóxica, recomendamos utilizar permanganato de potasio como sustituto del tetróxido de osmio, como lo describen Schauflinger et ^al.36.

Finalmente, se debe establecer un flujo de trabajo fluido para la adquisición de series de inclinación, incluido un microscopio bien alineado, de acuerdo con las instrucciones de usuario del STEM y diferirá de un microscopio a otro. Establecer un flujo de trabajo fluido también depende del generador de escaneo y del software de adquisición de imágenes.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
1-Hexadeceno	Merck KGaA	8220640500
200 rejillas de cobre con barras paralelas	Plano GmbH	G2014C
37 & deg; Cámara de secado en C	Binder GmbH	9010-0323
Acetona	VWR international GmbH	20066330
DDSA	Ciencias de la Microscopía Electrónica	13710
Cuchillo de diamante	Diatome Ltd	https://www.diatomeknives.com/ultra-35
DMP-30	Ciencias de la Microscopía Electrónica	13600
Embed-812 Resina	Ciencias de la Microscopía Electrónica	14900
Herramientas EM	TVIPS GmbH	Software TVIPS: EM-Tools; https://www.tvips.com/imaging-software/em-tools/
Etanol al 100%	Merck KGaA	1.00983.2511
Papel de filtro	VWR international GmbH	516-0812
Flaschen mit Schnappdeckelglas 11 mL	VWR international GmbH	548-0625
Formvar	Ciencias de la Microscopía Electrónica	15830-25
Unidad de sustitución por congelación Leica EM AFS2	Leica Microsystems GmbH	https://www.leica-microsystems.com/products/sample-preparation-for-electron-microscopy/p/leica-em-afs2/
Glod Sol 25 nm	Reactivos y Reactivos de Oro de AURION Immuno Accesorios	425.011
Oro de pino y oslash; 2000 y MU; m	Science Services GmbH	GA2000-Au
Graiticules Buchstaben-Netzchen Kupfer	Plano GmbH	NH6C
Placa calefactora	MEDAX GmbH & Co. KG	12501
Sistema de vaporización de alto vacío BAF 300	BAL-TEC AG
Congelador de alta presión Wohlwend HPF Compact 01	Oficina de Ingeniería M. Wohlwend GmbH	https://www.wohlwend-hpf.ch/index.html
Tanque de nitrógeno líquido	H.Erben GmbH	94500
Nitrógeno (fluido)	VWR international GmbH	-
NMA	Ciencias de la Microscopía Electrónica	19000
Tetróxido de osmio	ChemPur Feinchemikalien und Forschungsbedarf GmbH	006051
Horno a 120 °C; C	Binder GmbH	9010-0194
PELCO easi-Glow	Ted Pella, Inc.	91000
Poly-L-Lisin 0,1% en q/v. Solución	Ted Pella, Inc.	18026
Tubos de bloqueo seguro 0,5 mL	Eppendorf SE	0030 121.023
Recipientes de muestra (cápsulas Beem)	Plano GmbH	G360-1
Diámetro del disco de zafiro 3 x 0,16 mm	Oficina de Ingeniería M. Wohlwend GmbH	500
Ultramicrotomo Leica EM UC7	Leica Microsystems GmbH	https://www.leica-microsystems.com/de/produkte/em-probenvorbereitung/p/leica-em-uc7/
Acetato de uranilo	Riedel de Haë n AG	31697
Cámara de luz ultravioleta	Dinies	ELG100S