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Artículo de método

Epitelio pigmentario primario de ratón transfectado con ARN Alu: un modelo in vitro patológicamente relevante para la degeneración macular relacionada con la edad

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DOI:

10.3791/68570

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17 de octubre de 2025

 ,  ,  ,  , 
1Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 2Department of Ophthalmology, Shanghai General Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 3National Clinical Research Center for Eye Diseases, 4Shanghai Key Laboratory of Ocular Fundus Diseases

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

En este protocolo, describimos el proceso completo de establecimiento de un modelo relevante para la patología para la degeneración macular relacionada con la edad (DMAE) en células epiteliales pigmentarias de la retina (EPR) primarias de ratón mediante transfección de ARN Alu.

Resumen

La degeneración macular relacionada con la edad (DMAE), en particular la DMAE no exudativa, requiere modelos experimentales que repliquen mejor la patología humana. Los modelos in vivo actuales siguen siendo técnicamente exigentes y requieren mucho tiempo, mientras que los sistemas in vitro convencionales no logran recapitular los desencadenantes patológicos específicos de la enfermedad. Aquí, presentamos un método para establecer un modelo de degeneración epitelial pigmentaria de la retina (EPR) utilizando células primarias de EPR de ratón transfectadas con ARN Alu, un retrotransposón directamente implicado en la patología de atrofia geográfica.

Este protocolo detalla el aislamiento enzimático de las células primarias del EPR de ratón, seguido de la transfección de ARN Alu para inducir la degeneración del EPR. La validación integra análisis morfológico (arquitectura hexagonal), funcional (pérdida de polaridad y disrupción de la proteína ZO-1 de ratón) y molecular (PCR cuantitativa). Como resultado, observamos cambios multifactoriales desencadenados por la transfección de ARN Alu: secreción de citoquinas inflamatorias (genes de ratón Ifn-β, Il-6, Tnf-α; p < 0,05) y senescencia celular (genes de ratón p21 y p53 regulación positiva; p < 0,05). En comparación con los modelos tradicionales de estrés agudo, este sistema recapitula las cascadas inflamatorias-degenerativas crónicas de DMAE a través de técnicas estandarizadas, lo que garantiza la reproducibilidad. Al combinar aspectos de ensayos in vitro simplificados y modelos in vivo complejos, este enfoque podría servir como una plataforma preliminar para explorar mecanismos impulsados por retrotransposones y detectar posibles candidatos terapéuticos.

Introducción

La degeneración macular asociada a la edad (DMAE) es una causa predominante de discapacidad visual global. Sin embargo, los tratamientos efectivos para la DMAE no exudativa siguen siendo limitados. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de modelos de investigación reproducibles y eficientes para descubrir los mecanismos de la enfermedad e identificar objetivos terapéuticos 1,2. Un elemento central de este esfuerzo es el epitelio pigmentario de la retina (EPR), una monocapa situada entre la membrana de Bruch (coroides) y los fotorreceptores (retina), que desempeña un papel fundamental en el mantenimiento de la homeostasis de la retina al apoyar la función de los fotorreceptores, regular la barrera hematorretiniana y facilitar la eliminación de desechos 3,4.

La disfunción o pérdida de células del EPR es una característica destacada de muchas enfermedades degenerativas de la retina, especialmente en la DMAE, donde la disfunción del EPR representa un paso temprano y crítico en su progresión 2,4,5. En particular, en pacientes que manifiestan atrofia geográfica (AG), la fase avanzada de la DMAE, los niveles reducidos de la enzima procesadora de microARN Dicer 1 ribonucleasa III (DICER1) dan como resultado una acumulación tóxica de ARN Alu, una transcripción de retrotransposones directamente relacionada con la degeneración del EPR e implicada en la patología humana6.

Los modelos in vivo tradicionales, como el modelo de yodato de sodio (NaIO3) y el modelo de β amiloide (Aβ), conservan la complejidad sistémica de la enfermedad, pero enfrentan limitaciones críticas. El modelo NaIO3 induce rápidamente estrés oxidativo retiniano y daño del EPR, sin embargo, su toxicidad aguda interrumpe tanto el EPR como los fotorreceptores, sin imitar la progresión crónica relacionada con la patología de la DMAE y oscureciendo la evaluación terapéutica de la disfunción sutil del EPR7. Del mismo modo, el modelo Aβ introduce factores estresantes específicos de la enfermedad, pero exige una amplia experiencia técnica y plazos prolongados en comparación con los enfoques in vitro 8,9. Los modelos convencionales de EPR in vitro, como los modelos de exposición al H2O2 y a la hidroquinona, por otro lado, carecen de relevancia patológica, ya que no recapitulan los factores estresantes específicos de la enfermedad, como los agregados de proteínas tóxicas o los desencadenantes inflamatorios1.

Aquí, proporcionamos un protocolo detallado para establecer un modelo de degeneración del EPR en células primarias de EPR de ratón utilizando ARN Alu, un ARN no codificante derivado de retrotransposones directamente implicado en la patogénesis de GA6. El ARN Alu activa las vías inflamatorias y compromete la integridad de la barrera del EPR10,11, imitando así las características patológicas asociadas con la DMAE no exudativa. Este método emplea el aislamiento enzimático y el cultivo de células del EPR, seguido de la inducción de la degeneración del EPR utilizando ARN Alu. Además, proporcionamos un sistema de validación integral, que combina lecturas morfológicas (arquitectura hexagonal), funcionales (integridad de barrera y pérdida de polaridad) y moleculares (marcadores inflamatorios y de senescencia) para evaluar este modelo de degeneración.

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Protocolo

Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética Animal del Hospital General de Shanghái afiliado a la Facultad de Medicina de la Universidad Jiao Tong de Shanghái. Este protocolo sigue estrictamente el Reglamento para la Administración de Asuntos Relacionados con Animales de Experimentación (emitido por la Comisión Estatal de Ciencia y Tecnología) y las pautas para el uso ético de animales en la investigación oftálmica y de la visión establecidas por la Asociación para la Investigación de la Visión y la Oftalmología (ARVO). Consulte la Tabla de materiales para obtener más detalles relacionados con los materiales utilizados en este protocolo.

1. Aislamiento de células primarias de RPE de ratón

  1. Preparación de placas recubiertas
    1. Diluir Matrigel en una proporción de 150 μL de Matrigel a 13 mL de DMEM/F12 (concentración final de aproximadamente 1,14%).
    2. Cubra uniformemente el fondo de la placa con el Matrigel diluido (aproximadamente 150 μL para una placa de 48 pocillos). Incubar durante la noche a 37 °C para formar un gel.
  2. Preparación de la solución
    1. Prepare el medio de cultivo RPE completo utilizando la mezcla modificada de medio / nutriente Eagle F-12 (DMEM / F12) de Dulbecco complementada con 10% de suero fetal bovino (FBS) y 1% de penicilina / estreptomicina.
    2. Prepare la mezcla de papaína agregando 4.5 ml de solución salina equilibrada (EBSS) de Earle a un vial de papaína (100 unidades/vial).
    3. Prepare la mezcla de ADNasa I agregando 500 μL de EBSS a un vial de ADNasa I (1,000 unidades/vial).
    4. Prepare la solución de digestión de papaína agregando 250 μL de DNasa I Mix a 4,5 mL de Papain Mix (ajuste el protocolo proporcionado por el proveedor para lograr una concentración final de papaína de 22 UI/mL), haciendo que el volumen final sea de 4,75 mL.
  3. Eutanasia y recolección de tejidos
    1. Eutanasia ratones de 2-3 semanas de edad mediante inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico al 5% a 150-200 mg/kg de peso corporal. Confirme la anestesia profunda y la muerte verificando el cese de los latidos del corazón y la respiración.
    2. Rocíe completamente la región ocular con etanol al 70% antes de la enucleación para eliminar los contaminantes de la superficie 12,13,14. Presione suavemente el borde periorbitario para que sobresalga el globo. Luego, use fórceps para extraer el globo ocular, preservando el nervio óptico para facilitar la disección.
      NOTA: Todas las herramientas (por ejemplo, fórceps, tijeras) se esterilizan en autoclave y los procedimientos se realizan bajo una campana de flujo laminar para mantener la esterilidad.
    3. Sumerja los globos oculares inmediatamente en medio de cultivo RPE completo estéril precalentado a 37 °C.
  4. Digestión enzimática
    NOTA: Todos los pasos, incluida la digestión enzimática y los procedimientos posteriores, deben realizarse bajo una campana de flujo laminar para mantener la esterilidad.
    1. Transfiera el globo ocular a un plato y use fórceps para eliminar el tejido conectivo adherido y los músculos extraoculares residuales bajo un microscopio estereoscópico.
    2. Enjuague suavemente los ojos 2 veces con solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco preenfriada (D-PBS; sin Ca2+/Mg2+; a 4 °C).
      NOTA: El medio de cultivo de EPR completo residual puede comprometer la actividad enzimática de la papaína.
    3. Sumerja completamente los ojos en 1 ml de solución de digestión de papaína e incube a 37 °C durante 45 min.
  5. Separación de células del EPR
    1. Después de la digestión, neutralizar la actividad enzimática con medio de cultivo completo de EPR.
    2. Transfiera el globo ocular a un plato y, bajo un microscopio estereoscópico, extirpe la córnea, el iris y el cristalino, y conserve el ocular posterior.
      NOTA: Las células del EPR se aislaron y mantuvieron como láminas intactas (en lugar de disociarse en células individuales) durante todo el proceso.
    3. Separe el complejo retina-EPR de la coroides, luego retire la capa de EPR de la retina como láminas continuas en medio de cultivo completo de EPR. Recoja las capas de EPR desprendidas de manera uniforme en un medio de cultivo de EPR completo y fresco como una mezcla y luego cultívelas en superficies recubiertas de Matrigel.
  6. Cultivo celular
    1. Siembre la mezcla en una placa de 24 pocillos recubierta de Matrigel (8-10 globos oculares por pocillo en el cubreobjetos, para inmunotinción), una placa de 48 pocillos recubierta de Matrigel (6-8 globos oculares por pocillo, para qPCR) o una placa de 96 pocillos recubierta de Matrigel (5-6 globos oculares por pocillo).
    2. Incubar a 37 °C con 5% de CO2. Realice el primer cambio de medio después de 48 h utilizando medio de cultivo RPE completo. Cambiar el medio cada 48 h después del primer cambio.
      NOTA: Para mantener la polaridad de las células del EPR tanto como sea posible, evite pasarlas siempre que sea posible, ya que el subcultivo repetido puede conducir a la pérdida de diferenciación e integridad funcional.
  7. Monitorización de la morfología celular
    1. Permitir que las células formen una monocapa con morfología hexagonal característica. Monitorizar la morfología bajo un microscopio de cultivo celular invertido.

2. Inducción del modelo de degeneración RPE

  1. Síntesis y verificación de ARN de aluminio
    1. Sintetizar ARN Alu utilizando un sistema de transcripción in vitro .
      NOTA: La síntesis de ARN Alu utilizada en nuestro estudio se basó en el protocolo descrito por el Laboratorio de Ambati6.
    2. Purifique el ARN y confirme su calidad con un microespectrofotómetro.
  2. Transfección de ARN de aluminio
    NOTA: Designamos el día de siembra de células RPE primarias como día 0. En el día 5, las células primarias del EPR adherentes exhibieron una morfología uniforme y alcanzaron más del 50% de confluencia celular, momento en el que se llevó a cabo la transfección de ARN Alu utilizando un reactivo de transfección a base de lípidos catiónicos, de acuerdo con las pautas del fabricante.
    Se incluyeron dos grupos control para validar los resultados: i) un control negativo (NC), en el que no se agregó ARN Alu ni el reactivo de transfección y se utilizó como sustituto medio de bajo suero; ii) control de liposomas (LC), en el que se omitió el ARN Alu pero se mezcló la misma cantidad de reactivo de transfección con medio de bajo suero y se aplicó a las células, para controlar los efectos asociados a la lipofección. Los siguientes pasos describen el procedimiento de transfección de ARN Alu.
    1. Reemplace el medio existente con 300 μL de medio de cultivo completo de EPR por pocillo (placa de 48 pocillos) antes de los procedimientos de transfección.
    2. Prepare complejos de transfección con ARN Alu y reactivo a base de lípidos catiónicos en medio con bajo contenido de suero.
      1. Prepare la mezcla 1 con 1,2 μl de reactivo a base de lípidos catiónicos y 18,8 μl del medio de bajo suero. Mezclar suavemente (no agitar) e incubar a temperatura ambiente durante 5 min.
      2. Prepare la mezcla 2 con 6 μL de ARN Alu (100 μg/mL) y 14 μL de medio con bajo contenido de suero.
      3. Prepare los complejos de transfección añadiendo 20 μl de mezcla 2 gota a gota en 20 μl de mezcla 1.
        NOTA: El ARN de Alu se transfectó a una concentración final de 0,6 μg por pocillo utilizando 1,2 μL de reactivo a base de lípidos catiónicos por pocillo (1,2 μL de reactivo: relación de ARN de 0,6 μg).
      4. Mueva suavemente para mezclar. Luego, déjelo a temperatura ambiente durante 20 min.
    3. Agregue 40 μL/pocillo de los complejos de transfección a cada pocillo de una placa de 24 pocillos. Coloque la placa en una incubadora deCO2 a 37 °C/5% durante 48 h.
    4. Realice qPCR, inmunotinción y otros procedimientos experimentales 48 h después de la transfección.

3. Validación del modelo de degeneración

NOTA: Se realizaron experimentos completos de validación del modelo el día 7.

  1. Tinción de inmunofluorescencia para la evaluación de la integridad de la polaridad y la barrera
    1. Fije las células de EPR cultivadas con formaldehído al 4% sin metanol durante 20 min a temperatura ambiente. Lavar 3 x 10 min con 1x PBS.
    2. Bloquear la unión inespecífica con albúmina sérica bovina al 5% (BSA) en solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante 1 h.
    3. Incubar con anticuerpos primarios anti-ZO1 (dilución 1:1.000 en BSA al 3%) y faloidina 488 (dilución 1:1.000 en BSA al 3%) durante la noche a 4 °C, evitando la luz.
    4. Lave las células 3 x 10 min suavemente con PBS.
    5. Incubar con anticuerpos secundarios (dilución 1:1.000 en BSA al 3%) durante 1 h a temperatura ambiente.
    6. Lave las muestras 3 x 10 min con 1x PBS.
    7. Contratinción con DAPI (dilución 1:1.000 en PBS) durante 10 min.
    8. Lave las muestras durante 3 x 10 min con 1x PBS.
    9. Retire con cuidado el cubreobjetos de la placa de 24 pocillos y colóquelo en un portaobjetos de vidrio precargado con una gota de medio de montaje. Capture imágenes confocales con un objetivo de 40x/0,95.
  2. PCR cuantitativa (qPCR) para senescencia y marcadores inflamatorios
    NOTA: La gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (gen de ratón Gapdh) se empleó como gen de referencia interno para la normalización de los valores del ciclo umbral (Ct). Todas las reacciones de PCR cuantitativa (qPCR) incluyeron tres réplicas biológicas por grupo experimental. Las secuencias de cebadores se proporcionan en la Tabla complementaria S1.
    1. Extracción de ARN
      1. Agregue tampón de lisis (kit de ARN total) a la placa de cultivo (1 ml por cada 10 cm² de superficie) e incube a temperatura ambiente durante 5 min.
      2. Centrifugar a 13.400 × g durante 5 min a 4 °C. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo libre de ARNasa.
        NOTA: Omita este paso si las muestras están libres de residuos (por ejemplo, lisado de células transparentes).
      3. Agregue 200 μL de cloroformo al sobrenadante, vórtice durante 15 s e incube a temperatura ambiente durante 3 min.
      4. Centrifugar a 13.400 × g durante 10 min a 4 °C. Transfiera la fase acuosa superior (~500 μL) a un nuevo tubo.
      5. Agregue 0,5 volúmenes de etanol a la fase acuosa. Mezclar suavemente pipeteando.
      6. Cargue la mezcla en una columna de membrana de sílice (incluida en el kit de ARN total). Centrifugar a 13.400 × g durante 30 s. Deseche el flujo continuo.
      7. Agregue 500 μL de tampón de eliminación de proteínas (kit de ARN total) a la columna. Centrifugar a 13.400 × g durante 30 s. Deseche el flujo continuo.
      8. Agregue 500 μL de tampón de lavado (kit de ARN total) a la columna. Centrifugar a 13.400 × g durante 30 s. Deseche el flujo continuo.
      9. Repita el paso anterior 3.2.
      10. Centrifugar la columna vacía a 13.400 × g durante 2 min para secar la membrana.
      11. Eluya el ARN agregando 30-100 μL de agua libre de ARNasa a la membrana. Incubar a temperatura ambiente durante 2 min. Centrifugar a 13.400 × g durante 2 min.
    2. Síntesis de ADN complementario (ADNc)
      1. Mida la concentración de ARN con un espectrofotómetro a 260 nm y 280 nm.
        NOTA: Se considera que una relación A260/A280 entre 1,8 y 2,0 está asociada con una pureza de ARN aceptable.
      2. Preparar la mezcla de reacción en un tubo libre de ARNasa: Molde de ARN (500-1.000 ng): X μL (relacionado con su concentración), 5x tampón de transcripción inversa: 4 μL, agua libre de ARNasa: hasta 20 μL.
      3. Incube la mezcla de reacción en un termociclador utilizando el siguiente programa: 37 °C durante 15 min, 85 °C durante 5 s y una retención indefinida a 4 °C.
    3. qPCR
      1. Prepare la mezcla maestra de qPCR para cada reacción (10 μL en total): TB Green (incluido en Premix Taq): 5 μL, colorante ROX (incluido en Premix Taq): 0,2 μL, Forward primer (1 μM): 0,2 μL, Reverse primer (1 μM): 0,2 μL, agua libre de ARNasa: 3,4 μL, plantilla de ADNc: 1 μL.
      2. Agregue 10 μL de la mezcla maestra en cada pocillo de una placa de 96 pocillos.
      3. Selle la placa con una cubierta óptica adhesiva. Centrifugar a 300 × g durante 1 min.
      4. Ejecute el siguiente programa en un sistema de PCR en tiempo real: Etapa 1: 95 °C durante 30 s; Etapa 2: 40 ciclos de: 95 °C durante 5 s, 60 °C durante 30 s; Etapa 3: Análisis de la curva de fusión.
      5. Calcule los niveles de expresión relativos de los ARNm diana utilizando el método 2−ΔΔCt 15.

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Resultados

Células primarias del EPR de ratón antes de la transfección de ARN Alu
En el día 0 (Figura 1), se aislaron células primarias de RPE de ratón y exhibieron la morfología hexagonal característica, que es típica de las células EPR sanas. Estas células mantenían una monocapa bien organizada. Las células se cultivaron para permitir la organización estructural inicial y la formación de uniones estrechas, como lo demuestra la forma hexagonal y los límites bien definidos. Esta mor...

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Discusión

Nuestro objetivo era establecer un modelo de lesión RPE reproducible y accesible que permitiera imágenes de alta resolución y análisis mecanicista con limitaciones mínimas de recursos. Este enfoque proporcionó una visualización clara de la disrupción estructural inducida por el ARN Alu en comparación con el grupo de control, incluida la fragmentación de la unión estrecha apical y la desorganización citoesquelética basal a través de imágenes confocales de pila Z (tamaño de paso de 0,5 μm)...

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Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que divulgar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado en parte por el Proyecto Especial de Investigación de Innovación Médica del Plan de Acción de Innovación Científica y Tecnológica (23Y11901300), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (82171076) y la Comisión de Educación Municipal de Shanghai (2023ZKZD18). Agradecemos al profesor L.Z por el amable regalo de Alu RNA.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Gabinete de seguridad biológica Clase II, tipo A2 de la serie 1300Thermo Scientific
37 &grados; Incubadora C/5% CO2Thermo Scientific
4% Paraformaldehído (PFA)ServicebioG1101-500ML
ARN Alu humanoRegalado por L.Z.
Anticuerpo secundario anti-conejo, Alexa Fluor 568 (cabra)Invitrogen Thermo ScientificReferencia A11011
Cubierta óptica adhesiva MicroAmp de Biosystems aplicadaThermo Fisher Scientific
Placas de reacción ópticas MicroAmp de 96 pocillos de Applied BiosystemsThermo Fisher Scientific
Sistema de PCR en tiempo real ViiA 7 de Applied BiosystemsThermo Fisher ScientificSistema de PCR en tiempo real para el análisis cuantitativo de la expresión génica
Albúmina de suero bovino (BSA, fracción V)BeyotineST023-50g
Microscopio de cultivo celular invertido Carl Zeiss PrimovertZeissPara el monitoreo de la morfología celular
Centrífuga 5424 Reppendorf
CloroformoSigmaSeparación de fases en la extracción de ARN.
Microscopio de barrido láser confocal (LSM900+Cell discover 7)ZeissImágenes de alta resolución de marcadores de inmunofluorescencia (p. ej., ZO-1 y F-actina).
Placa de pocillos Costar 24/48/96Corning
cubreobjetosThermo Fisher ScientificSe utiliza en placas de 24 pocillos para imágenes de inmunofluorescencia.
DAPITermo62248
Baño seco digitalMulab
DMEM/F12GibcoMedios para hacer crecer las células del EPR 
Tamponado con fosfato de Dulbecco (D-PBS)CompartirBioSB-CR017
Earle' s Solución salina equilibrada (EBSS)GibcoSolución salina equilibrada utilizada para la dilución de papaína y ADNasa I durante el aislamiento del EPR.
Etanol (absoluto)SigmaPrecipitación de ARN y lavado de columnas.
Suero fetal bovino (FBS)SigmaPara medios completos de cultivo celular EPR
fórcepsPara disección
Lipofectamine 3000 (reactivo de transfección a base de lípidos catiónicos)Termo FisherL300015Transfectar ARN Alu en células EPR
MatrigelCorning356234Matriz (dilución al 1,14%) para placas de recubrimiento para apoyar la adhesión y polarización del EPR.
Formaldehído sin metanolThermo ScientificFijador alternativo (4%) para preservar epítopos en inmunofluorescencia
Micropipetaeppendorf
Espectrofotómetro Nanodrop 2000Thermo ScientificMide la concentración y pureza del ARN
Nikon ECLIPSE Ti-S fluorescente Microscopio invertidoNikonImágenes de fluorescencia de muestras teñidas
Microscopio estereoscópico Olympus SZX16OlimpoPara la disección de globos oculares de ratón y aislamiento de EPR
Opti-MEMGibcoMedio con bajo contenido de suero para la preparación del complejo de transfección
Sistema de disociación de la papaínaWorthingtonLK003150Para enzima de trabajo
Penicilina-EstreptomicinaGibcoPara medios completos de cultivo celular EPR
Sal sódica de pentobarbitalSigmaAgente de eutanasia
Faloidina 488 Abcam176753Para la evaluación de polaridad
Kit de reactivos PrimeScript RTTakaraRR037AKit de transcripción inversa para síntesis de ADNc (preparación de plantillas de qPCR)
Kit de ARN total de ARNsimpleTIANGENDP419Para extraer ARN
TB Green  Premix Ex Taq  (Tli RNaseH Plus)TakaraRR420APara qPCR
ZO-1 Anticuerpo policlonal de conejoTecnología de proteínas21773Para la evaluación morfológica

Referencias

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Transfección de ARN de AluRPE primario de ratóndegeneración del RPEaislamiento enzimáticosecreción de citocinas inflamatoriassenescencia celularPCR cuantitativainflamación crónica

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