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Artículo de método

Microdisección multinivel y perfil funcional-estructural de ramas arteriales renales humanas

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DOI:

10.3791/68579

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5 de septiembre de 2025

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1Institute of Cardiovascular Sciences, School of Basic Medical Sciences, Peking University Health Science Center; State Key Laboratory of Vascular Homeostasis and Remodeling, Peking University, 2Beijing Key Laboratory of Cardiovascular Receptors Research, 3Department of Cardiology and Institute of Vascular Medicine, Peking University Third Hospital, Peking University, 4Department of Urology, Peking University First Hospital; Institute of Urology, Peking University; Beijing Key Laboratory of Urogenital Diseases (Male) Molecular Diagnosis and Treatment Center, National Urological Cancer Center, 5Institute of Cardiovascular Diseases, First Affiliated Hospital of Dalian Medical University, 6NHC Key Laboratory of Cardiovascular Molecular Biology and Regulatory Peptides, Peking University

En este artículo

Resumen

Este artículo presenta un protocolo paso a paso para el aislamiento y la evaluación funcional de las ramas arteriales renales humanas, facilitando los estudios preclínicos para el desarrollo farmacéutico.

Resumen

La disfunción vascular renal juega un papel crítico en la patogénesis de múltiples afecciones clínicas, incluida la lesión renal aguda, la isquemia renal y la hipertensión, lo que presenta desafíos significativos en el manejo clínico y afecta negativamente los resultados de los pacientes. El aislamiento y la caracterización funcional de las arterias intrarrenales son cruciales para dilucidar los mecanismos subyacentes a la disfunción vascular renal, particularmente relacionados con la lesión renal, y guiar el desarrollo terapéutico dirigido. A pesar de su importancia clínica, los enfoques estandarizados para aislar y evaluar funcionalmente las arterias intrarrenales humanas en diferentes niveles de ramificación siguen estando poco desarrollados. Este protocolo proporciona un marco integral para el aislamiento sistemático y la evaluación multimodal de las ramas arteriales intrarrenales, incorporando evaluaciones funcionales y estructurales en condiciones fisiológicas y patológicas. La metodología abarca tres componentes clave: (1) identificación anatómica precisa y microdisección de arterias intrarrenales de riñones de donantes, acompañada de tinción de hematoxilina-eosina (H&E) para confirmación estructural; (2) procedimientos rigurosos de normalización en la miografía de alambre para mejorar la reproducibilidad y confiabilidad de la medición; y (3) análisis cuantitativo de respuestas vasomotoras utilizando técnicas de miografía con alambre de precisión. La normalización se basa en la relación longitud-tensión muscular, donde el estiramiento incremental de los segmentos arteriales establece una tensión de reposo óptima para maximizar la superposición actina-miosina, provocando así respuestas contráctiles máximas. En la miografía con alambre, los segmentos de vasos aislados se suspenden entre dos cables paralelos, lo que permite una medición precisa de la tensión vascular. Mediante la aplicación de rigurosos protocolos de normalización, esta técnica permite una cuantificación reproducible y fiable de la reactividad vascular en diversas condiciones fisiopatológicas e intervenciones farmacológicas.

Introducción

El riñón es un órgano vital responsable de mantener la homeostasis humana a través de la eliminación de desechos metabólicos, el equilibrio electrolítico y la regulación de líquidos, funciones que exigen un flujo sanguíneo excepcionalmente alto. En condiciones fisiológicas, los riñones reciben aproximadamente el 25% del volumen total de sangre bombeado por el corazón cada minuto (gasto cardíaco), lo que subraya su papel sustancial en el flujo sanguíneo sistémico y la importancia crítica de la perfusión renal en el mantenimiento del equilibrio fisiológico general1. El sistema arterial renal regula con precisión este suministro masivo de sangre para mantener la TFG mientras se adapta a los cambios hemodinámicos sistémicos. En consecuencia, el deterioro de la perfusión renal representa un mecanismo patológico crítico que contribuye a la reducción de la tasa de filtración glomerular (TFG) en afecciones como la lesión renal aguda y la isquemia renal. Además, con frecuencia ocurre secundario a trastornos sistémicos que comprometen el flujo sanguíneo renal, incluyendo shock, disfunción cardíaca y sepsis 2,3,4,5. La arteria renal sufre una ramificación secuencial dentro del riñón, dividiéndose primero en arterias interlobulares que recorren las columnas renales entre las pirámides medulares. Al llegar a la unión corticomedular, estos vasos dan lugar a arterias arqueadas, que se arquean a lo largo del límite entre la corteza y la médula. De estos vasos curvilíneos emergen arterias interlobulillares que penetran radialmente en el parénquima cortical, y finalmente llevan sangre a los capilares glomerulares a través de arteriolas aferentes para perfundir las nefronas individuales 1,6,7. Las arterias interlobular, arqueadas e interlobulares constituyen la vasculatura de resistencia clave en el riñón, sirviendo como reguladores primarios de la hemodinámica intrarrenal y el control de la presión 1,8. El aislamiento y la caracterización precisos de estos vasos son cruciales para dilucidar los mecanismos fundamentales que gobiernan la homeostasis de la perfusión renal9. Además, su reactividad vascular heterogénea en diversas condiciones fisiopatológicas ofrece un marco estratégico para el desarrollo de nuevos agentes vasodilatadores con potencial protector renal10,11.

Actualmente, las técnicas de imagen clínica (por ejemplo, ultrasonido) se utilizan de forma rutinaria para monitorear los cambios en el flujo sanguíneo renal; Sin embargo, las metodologías experimentales en investigación básica para evaluar directamente la tensión vascular renal, un determinante clave de la perfusión renal, siguen siendo limitadas 12,13,14,15. El sistema de miografía con alambre es una plataforma experimental bien establecida que mide los cambios de tensión en pequeños tejidos biológicos in vitro, incluidos los vasos sanguíneos, la tráquea 16,17,18, con diámetros que van desde 50 μm a 10 mm 16,19,20. Aunque la miografía con alambre se ha aplicado ampliamente en estudios con animales, las diferencias entre especies en la estructura y función vascular limitan el grado en que los vasos de roedores pueden representar la fisiología vascular humana21. Por lo tanto, la identificación y el aislamiento precisos de las arterias intrarrenales humanas en varios niveles anatómicos (interlobar, arqueado e interlobulillar) son cruciales para permitir investigaciones integrales in vitro sobre sus propiedades fisiológicas, así como las alteraciones funcionales relacionadas con la enfermedad y los mecanismos de lesión patológica. Cuando se combina con intervenciones farmacológicas que utilizan varios compuestos vasoactivos, este sistema permite la evaluación dinámica y el registro cuantitativo de las respuestas de vasoconstricción/vasodilatación en anillos arteriales aislados, proporcionando una poderosa herramienta para investigar la reactividad vascular en condiciones experimentales controladas 19,22,23.

Este protocolo detalla una metodología integral para la localización anatómica precisa y la microdisección de las ramas de la arteria intarenal humana (arterias interlobares, arqueadas e interlobulillares), seguida de una caracterización funcional utilizando un sistema de monitoreo de la tensión vascular in vitro para evaluar su reactividad diferencial a los fármacos vasoactivos, estableciendo así distinciones estructurales y funcionales entre estos segmentos vasculares. Al combinar la localización anatómica con el perfil de reactividad farmacológica y el análisis histopatológico, establecemos una plataforma ex vivo que permite una evaluación integral de las respuestas vasculares específicas de la región a los agentes vasoactivos.

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Protocolo

El protocolo y los ejemplos descritos aquí fueron revisados y aprobados por el Departamento de Urología del Primer Hospital de la Universidad de Pekín (aprobación No. 2023yan500-002) y realizados de acuerdo con la Declaración de Helsinki. Todos los participantes dieron su consentimiento informado por escrito antes de participar.

1. Preparación de la solución

  1. Preparar solución de Krebs-Ringer (Krebs) que contenga 119,0 mM de NaCl, 4,7 mM de KCl, 2,5 mM de CaCl2, 1,0 mM de MgCl2, 25,0 mM de NaHCO3, 1,2 mM de KH2PO4 y 11,0 mM de D-glucosa a pH 7,4.
  2. Prepare una solución salina con alto contenido de potasio (60K+) que contenga 64,0 mM de NaCl, 60 mM de KCl, 2,5 mM de CaCl2, 1,0 mM de MgCl2, 25,0 mM de NaHCO3, 1,2 mM de KH2PO4 y 11,0 mM de D-glucosa a pH 7,4.

2. Preparación del reactivo

NOTA: Almacene los medicamentos según los detalles proporcionados en la Hoja de datos de seguridad del material (MSDS) inmediatamente después de recibirlos.

  1. Prepare la fenilefrina (Phe, 10-1 M en stock) disolviendo 167,21 mg de fenilefrina en 10 ml de dimetilsulfóxido (DMSO). Almacenar la solución madre a -80 °C, diluir a 10-6, 10-5, 10-4, 10-3, 10-2 M como concentración de trabajo el día de uso.
  2. Preparar la acetilcolina (ACh, 10-2 M en stock), disolviendo 18,166 mg de acetilcolina en 10 mL de dimetilsulfóxido (DMSO). Almacenar la solución madre a -80 °C, diluir a 10-5, 10-4, 10-3, 10-2 M como concentración de trabajo el día de uso.

3. Recolección de tejido renal y aislamiento de la arteria intrarrenal

  1. Reclutar pacientes adultos diagnosticados con carcinoma de células renales, confirmado histológicamente por biopsia con aguja gruesa preoperatoria o sección congelada intraoperatoria.
    NOTA: Los pacientes programados para nefrectomía radical se eligen específicamente porque sus muestras quirúrgicas brindan acceso a segmentos arteriales intrarrenales intactos ubicados distales a los márgenes del tumor. Estos segmentos se pueden diseccionar y aislar con precisión, lo que permite un estudio detallado de la fisiología vascular renal humana sin interferencia de tejido maligno. La confirmación histológica garantiza una identificación precisa del carcinoma y una delimitación clara de los límites del tumor, lo que facilita la selección de segmentos arteriales normales y libres de tumores para investigaciones experimentales.
    1. Excluir a los pacientes con comorbilidades significativas (hipertensión, diabetes mellitus u otras enfermedades sistémicas) para evitar influencias confusas en la función vascular, mejorando así la confiabilidad y relevancia de las evaluaciones fisiológicas.
      NOTA: Las muestras para este experimento se recolectaron de pacientes programados para nefrectomía radical en el Primer Hospital de la Universidad de Pekín.
  2. Durante la nefrectomía radical, recolecte muestras de riñón humano recién extirpadas y sumérjalas inmediatamente en una solución de Krebs helada para preservar la viabilidad del tejido. Solo las regiones de apariencia macroscópicamente normal distales a los márgenes tumorales se conservan para la disección arterial (Figura 1A).
    NOTA: Para un aislamiento óptimo de la arteria intrarrenal, el tejido sano adyacente debe recolectarse como una cuña corticomedular de espesor total durante la nefrectomía radical, preservando así el árbol arterial completo desde la vasculatura cortical hasta la medular.
    1. Almacene inmediatamente el tejido extirpado en 200 ml de solución fría de Krebs. Coloque el recipiente sobre hielo y transpórtelo en una bolsa térmica aislada al laboratorio dentro de las 2 h posteriores a la recolección. Asegúrese de que el tejido permanezca completamente sumergido durante todo el transporte para preservar la viabilidad y la integridad estructural para la disección posterior y el análisis funcional.
      NOTA: Para mantener la viabilidad tisular y la función fisiológica, todo el proceso de aislamiento y posterior almacenamiento en solución de Krebs a 4 °C debe completarse en 6 h 24,25,26,27. La solución debe reemplazarse regularmente durante los procedimientos para mantener la oxigenación y la viabilidad de los tejidos, al tiempo que facilita la eliminación de los componentes sanguíneos de la luz vascular.
  3. Identifique visualmente el plano coronal localizando el hilio renal y alineando el corte para que pase a través de la pelvis renal y el borde convexo lateral. Con un bisturí estéril, divida el riñón a lo largo del plano coronal para producir dos mitades simétricas. Este enfoque expone la arquitectura interna, incluidas las pirámides y columnas renales, lo que facilita la identificación precisa y la posterior disección de las arterias intrarrenales (Figura 1A).
    NOTA: Para facilitar la separación de las arterias renales, primero se debe eliminar una porción de la pelvis renal, las pirámides renales y la grasa en la superficie de la sección transversal para exponer más vasos sanguíneos (Figura 1B). Tenga cuidado de no cortar los vasos sanguíneos.
  4. Bajo un microscopio estereoscópico, separe meticulosamente las arterias interlobar, arqueada e interlobular utilizando tijeras de microdisección y fórceps en una placa de cultivo de fondo negro de 10 cm (Figura 1C).
    NOTA: En el riñón humano, la arteria interlobulillar atraviesa las pirámides renales, presentando la pared vascular más gruesa entre las tres ramas arteriales 1,8, con un diámetro promedio de aproximadamente 1-2 mm. En la unión corticomedular, la arteria interlobular pasa a la arteria arqueada, formando un arco semicircular a lo largo del borde corticomedular, con un diámetro promedio de aproximadamente 500 μm. Los vasos sanguíneos se ramifican aún más en la corteza renal, que es la arteria interlobulillar, con la pared vascular más delgada y el diámetro más pequeño entre los tres, alrededor de 200 μm (Figura 1C). Además, al diferenciar las tres ramas vasculares, la localización anatómica proporciona información más crítica que las mediciones del diámetro vascular absoluto 1,8.
    1. Retire suavemente el tejido y la grasa circundantes de las arterias, asegurándose de limpiarlas a fondo en una placa de cultivo de fondo negro de 10 cm (Figura 1B).
  5. Use las arterias renales aisladas (arterias interlobulares, arqueadas e interlobulares) para los siguientes experimentos:
    1. Prepare los segmentos arteriales para el procesamiento histológico recortando cuidadosamente los tejidos aislados a una longitud estandarizada de aproximadamente 3 mm, lo que es adecuado para la inclusión de parafina y el corte histológico. Fije cada muestra en 2 ml de paraformaldehído (PFA) al 4% a temperatura ambiente durante 1 h para preservar la morfología del tejido. Después de la fijación, procese con protocolos estándar de deshidratación, limpieza e inclusión de parafina para la posterior tinción de hematoxilina y eosina (H&E) de acuerdo con los protocolos histológicos establecidos (Figura 2).
      NOTA: Para posibles evaluaciones histológicas, las muestras pueden someterse a tinción tricrómica de Masson para evaluar la deposición de colágeno o tinción de Verhoeff-Van Gieson (EVG) para visualización de fibras elásticas, de acuerdo con los protocolos histológicos establecidos28,29.
    2. Para estudios de función vascular, almacene los anillos intrarrenales en una solución de Krebs helada hasta la prueba. Los anillos arteriales deben estar completamente sumergidos.
      NOTA: Para ensayos moleculares posteriores como western blot/qPCR, congele inmediatamente las muestras frescas en nitrógeno líquido después de la disección, luego guárdelas a -80 °C siguiendo los procedimientos publicados anteriormente para preservar la integridad del ARN y evitar la degradación de las proteínas30,31.

4. Montaje del anillo arterial

  1. Identifique la arteria interlobar, arqueada e interlobular por sus distintas posiciones anatómicas (Figura 1C) y rangos de diámetro (Figura 2), luego seccionarlas cuidadosamente en anillos de aproximadamente 2 mm de largo con tijeras de microdisección para estudios de función vascular (Figura 3A).
    NOTA: Almacene inmediatamente cada anillo arterial aislado por separado en 5 ml de solución de Krebs helada hasta la prueba funcional. Para las pruebas funcionales, seleccione anillos vasculares no ramificados de entre 1,5 y 2,0 mm de longitud con cortes perpendiculares limpios. Excluya los anillos que superen los 2,0 mm para evitar dificultades de montaje o los anillos de menos de 1,5 mm para evitar registros de tensión inestables.
  2. Prepare todos los anillos arteriales (de las arterias interlobar, arqueada e interlobular por separado) como se menciona en el paso 4.1 y lleve las soluciones Krebs y 60K + a temperatura ambiente. Luego encienda la computadora conectada, seguida del sistema de miógrafo de cable, asegurándose de que todos los componentes estén correctamente inicializados antes de continuar con los experimentos.
  3. Antes de montar los anillos arteriales en las cámaras de miograma de alambre, enjuague cada cámara dos veces con 5 ml de solución de Krebs para garantizar la limpieza y eliminar las sustancias residuales, luego agregue 5 ml de solución de Krebs a cada cámara.
    1. Caliente la solución a 37 °C utilizando el sistema de control de temperatura incorporado en el miógrafo. Simultáneamente, airee continuamente la solución con gas (una mezcla de 95% de O2 y 5% de CO2) a través de una línea de gas conectada para mantener la oxigenación adecuada y el equilibrio de pH durante el experimento.
  4. Prepare dos alambres guía de 3 cm de largo con un diámetro de 40 μm para cada anillo arterial y transfiera cuidadosamente los anillos arteriales aislados a otra placa de cultivo de fondo negro de 10 cm que contenga solución de Krebs.
    NOTA: Se deben seleccionar diferentes diámetros de alambres guía para vasos sanguíneos de diferentes diámetros. Para el anillo arterial con un diámetro de aproximadamente 100 μm o menos, se requiere un alambre guía de 15 μm; si el diámetro está entre 100 μm y 200 μm, se utiliza un alambre guía de 25 μm; Si el diámetro es superior a 200 μm, se puede utilizar un alambre guía de 40 μm. Para la consistencia del experimento, se recomienda utilizar el mismo diámetro para todos los recipientes del mismo tipo dentro de un solo experimento. Artículo 19.
  5. Inserte con cuidado el primer alambre guía en el anillo arterial dentro del plato, doble un lado del alambre guía 90 ° y luego transfiéralo a la cámara para fijarlo en el soporte de muestra tipo abrazadera utilizando los tornillos especializados provistos por el instrumento para apretar los tornillos en el sentido de las agujas del reloj (Figura 3B).
    NOTA: El alambre guía se inserta para proporcionar soporte estructural durante la transferencia del anillo arterial al montarlo en el portamuestras, lo que minimiza el daño o la distorsión inducidos por la manipulación.
  6. Antes de fijar el anillo arterial en el soporte, registre la longitud y el ancho del vaso. Coloque el anillo arterial entre los dos soportes (Figura 3C) y lea la escala micrométrica, donde 1 escala representa 10 μm. Reste el valor de la escala medido cuando los soportes apenas se tocan entre sí (Figura 3D) para determinar la longitud y el ancho del anillo arterial.
  7. Pase otro alambre guía a través del vaso sanguíneo y finalmente fíjelo en el otro lado. Enrolle el alambre guía en el sentido de las agujas del reloj alrededor de los tornillos de fijación en ambos lados y asegúrese de que esté bien sujeto a la superficie del portamuestras.
    NOTA: Durante todo el proceso de fijación, es necesario evitar tirar del vaso sanguíneo o rayar la pared interna del vaso sanguíneo con el alambre guía para evitar dañar el endotelio vascular. El alambre guía debe enrollarse alrededor del tornillo de fijación en una sola capa sin superponerse. Los dos cables guía deben estar en el mismo plano horizontal, paralelos entre sí y no cruzarse entre sí. Además, después de fijar el cable guía, ajuste el portamuestras en ambos lados más cerca; sin embargo, deben estar cerca unos de otros sin entrar en contacto, para evitar la fuerza, como se muestra en la Figura 3E y la Figura 3F.
  8. Vuelva a instalar la cámara en el sistema de miógrafo de alambre. Luego, cubra la tapa y ventile el gas. Conecte el sensor y abra el software de adquisición de datos para la prueba de tensión vascular.

5. Normalización específica del vaso para una determinación óptima de la tensión inicial

NOTA: Establecer condiciones de referencia estables, definidas como la tensión de reposo óptima para una máxima capacidad de respuesta contráctil, es fundamental para mediciones funcionales reproducibles. Sin embargo, debido a las diferencias fisiológicas interindividuales inherentes, los vasos sanguíneos humanos exhiben una mayor variabilidad en las propiedades mecánicas basales en comparación con los vasos sanguíneos animales 32,33,34,35,36. Estos factores, combinados con la heterogeneidad vascular intrínseca (p. ej., disparidades estructurales y funcionales en diámetro, grosor de pared y propiedades contráctiles), conducen colectivamente a variaciones significativas en la tensión basal. Por lo tanto, para garantizar la reproducibilidad experimental, se recomienda normalizar cada vaso sanguíneo individualmente. El sistema de miógrafo de alambre incluye un módulo de normalización dedicado, que permite determinar con precisión la tensión de referencia para cada vaso.

  1. Monte los anillos arteriales en la cámara como se describe en los pasos 4.1 a 4.8. Comience la grabación del gráfico, ponga a cero el canal (Figura 4A), permita la estabilización durante al menos 30 minutos, luego vuelva a poner a cero el canal nuevamente antes de continuar con la normalización.
  2. Seleccione Configuración de normalización en el menú DMT (Figura 4B) y configure los parámetros de la siguiente manera (Figura 4C):
    1. Calibración del ocular (mm/div): 1; Presión objetivo (kPa): 13,3; IC1/IC100: 0,9; Tiempo promedio en línea (segundos): 3; Tiempo de retardo (segundos): 60.
      NOTA: IC1 denota la circunferencia interna del vaso en la producción máxima de fuerza activa, mientras que IC100 representa la circunferencia correspondiente a una presión transmural de 100 mmHg. Las arterias renales humanas exhiben una variabilidad sustancial entre muestras, lo que requiere estandarización, a diferencia de los modelos animales que tienen propiedades vasculares consistentes para la determinación experimental y la reutilización de las relaciones IC1 / IC100. Debido a las variaciones significativas en el diámetro del recipiente, el grosor de la pared y las propiedades mecánicas entre los especímenes humanos individuales, cada recipiente debe someterse a una normalización independiente para establecer sus características de referencia únicas. Por lo tanto, la proporción de 0,9 se estableció como marcador de posición para la inicialización del protocolo aquí y no se utilizó en la práctica en este protocolo.
  3. Seleccione el canal correspondiente a la arteria objetivo y abra la pantalla de normalización desde el menú DMT (Figura 4C), rellénela con los datos apropiados:
    1. Puntos finales del tejido: a1 debe ser 0, a2 debe ser la longitud del vaso (en mm); diámetro del alambre: 40 μm (ingrese el diámetro del alambre utilizado); Lectura de micrómetro: el valor de la escala de micrómetro, haga clic en Agregar punto para registrar el punto.
  4. Cuando esté listo, haga clic en Agregar punto para registrar el primer punto e iniciar el procedimiento de normalización.
  5. Aplique estiramiento pasivo, espere 3 min, ingrese la lectura del micrómetro como el siguiente punto, luego agregue 5 ml de 60K + para provocar una contracción del vaso mediada por potasio (Figura 5).
  6. Espere hasta que la contracción alcance una meseta. Luego, lave la solución de 60K + con 5 ml de solución de Krebs 3 veces y calcule los datos de fuerza activa de la traza restando la fuerza pasiva en cada estiramiento de la fuerza activada por potasio (Figura 5).
  7. Repita los pasos 5.5 a 5.6 (pasos de "Estiramiento-60K + estimulación-lavado") hasta que la fuerza activa alcance su máximo, luego determine la tensión de referencia óptima en la que la producción de fuerza activa del vaso es máxima (Figura 5).
  8. Equilibre el anillo arterial en la cámara durante 10 minutos antes de continuar con los siguientes pasos del experimento.

6. Detección de la reactividad del anillo de la arteria renal

  1. Asegúrese de que el volumen de Krebs en cada cámara sea de 5 ml antes del inicio del experimento.
  2. Para evaluar la contracción dependiente de la concentración inducida por fenilefrina, aplique Phe acumulativo en incrementos de medio logaritmo (10-9 a 10-4 M)37.
  3. Comience con la concentración de Phe más baja (10-9 M). Agregue 5 μL de stock de Phe (10-6 M) a la cámara que contiene 5 mL de tampón Krebs, monitoree continuamente y espere hasta que la contracción se estabilice (2-3 min de tensión sin cambios), marque el punto, luego agregue la siguiente concentración en un incremento de medio log. Repita hasta alcanzar la concentración final (10-4 M), manteniendo un monitoreo constante en todo momento (Figura 6).
  4. Para realizar pruebas de drogas adicionales, lave la cámara con 5 ml de solución tibia de Krebs al menos 5 veces hasta que la tensión vuelva a la línea de base y permanezca estable durante al menos 10 min.
  5. Para evaluar la vasodilatación dependiente de la concentración inducida por acetilcolina, aplique ACh acumulada en incrementos de medio logaritmo (10-8 a 10-5,5 M).
    NOTA: En la vasculatura normal, la respuesta a la acetilcolina (ACh) sirve como indicador funcional de la integridad endotelial 37,38. La respuesta vasodilatadora a la ACh refleja la función endotelial a través de la relajación mediada por NO en vasos sanos. Sin embargo, en condiciones patológicas, esta respuesta puede atenuarse o abolirse debido a la alteración de la biodisponibilidad del óxido nítrico (NO) y/o a la alteración de las vías de señalización del receptor.
  6. Precontrate los recipientes con 10-4 M Phe, agregue 5 μL de stock de Phe (10-1 M) a la cámara que contiene 5 mL de tampón Krebs e incube durante 15 min. Comenzando desde la concentración más baja de ACh, agregue 5 μL de stock de Ach (10-5 M) a la cámara que contiene 5 mL de tampón Krebs, monitoree continuamente y espere la respuesta de vasodilatación (confirmada por la detección sostenida de trazas), marque el punto y luego continúe con la siguiente concentración. Repita hasta que se prueben todos (Figura 7).
  7. Complete el experimento guardando el archivo y quitando los anillos arteriales. Limpie a fondo la cámara incubando con 10 ml de solución de ácido acético al 8% durante 3 min, luego enjuague con 10 ml de agua 3 veces. A continuación, incubar en 10 mL de etanol al 95% durante 3 min y enjuagar nuevamente con 10 mL de agua 3 veces. Finalmente, apague tanto el calentador como el gas, asegurándose de eliminar todo el líquido antes de cerrar el gas.

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Resultados

En el riñón humano, la arteria interlobular corre entre pirámides renales a lo largo de su vena correspondiente. Caracterizada por una pared vascular relativamente gruesa y un revestimiento significativo de tejido adiposo, esta arteria requiere una disección particularmente cuidadosa. El tejido adiposo circundante debe eliminarse meticulosamente para evitar la aplicación de fuerza excesiva durante el procedimiento de aislamiento (Figura 1C).

La arteria arqueada se...

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Discusión

La estabilidad de la perfusión renal sirve como un objetivo terapéutico crítico y una ventana a la fisiopatología hemodinámica39,40. Presentamos un protocolo para el aislamiento jerárquico y la evaluación funcional de las arterias renales humanas a partir de muestras frescas de nefrectomía, abordando brechas significativas en las metodologías actuales. A diferencia de los enfoques existentes limitados a especímenes cadavéricos o ...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Los autores desean agradecer a los voluntarios por su participación en este estudio, y también agradecer al personal quirúrgico del Departamento de Urología del Primer Hospital de la Universidad de Pekín por proporcionar tejido renal. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Municipal de Ciencias Naturales de Beijing (F251013 a Y. Z., 7232096 a Y. L.); Fundación Nacional de Ciencias de China (82325004, 92168114 a Y. Z., 82170422 a Y. L.); Programa Nacional de Investigación y Desarrollo Clave de China (2021YFF0501401, 2018YFA0800501 a Y. Z., 2021YFF0501404 a Y. L., 2023YFC2415500 a L. Y.); Proyecto de investigación del Tercer Hospital de la Universidad de Pekín en el Laboratorio Estatal Clave de Homeostasis y Remodelación Vascular (Universidad de Pekín; 2024-VHR-SY-07 a Y.Z.); 2023 Comisión Municipal de Salud de Beijing Proyecto del Programa de Promoción Excelente de Transformación de Innovación en Ciencia y Tecnología Médica de la Capital (YC202301QX0162 a L. Y.); Financiación de la investigación clínica hospitalaria nacional de alto nivel (Proyecto del Fondo de Orientación de Incubación de Transformación de Logros Científicos y Tecnológicos del Primer Hospital de la Universidad de Pekín, 2024CX24 a L. Y.).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Cloruro de acetilcolinaSigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, AlemaniaReferencia A6625
Plato de cultivo de fondo negroDanish Myo Technology, Aarhus, Dinamarca300412
CaCl2Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghái, ChinaA501330
D-glucosaSangon Biotech Co., Ltd., Shanghái, ChinaA610219
Pinzas DumontDanish Myo Technology, Aarhus, Dinamarca300413
Tijera de disección GeuderDanish Myo Technology, Aarhus, Dinamarca400431
Alambre guíaDanish Myo Technology, Aarhus, Dinamarca400447Diámetro 40 µ m
KclSangon Biotech Co., Ltd., Shanghái, ChinaA100395
KH2PO4Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghái, ChinaA100781
LabChart Professional versión 8.3 ADInstruments, Australia-
MgCl2· 6H2OSangon Biotech Co., Ltd., Shanghái, ChinaA100288
Sistema de multimiógrafoDanish Myo Technology, Aarhus, Dinamarca620 millones
NaClSangon Biotech Co., Ltd., Shanghái, ChinaA100241
NaHCO3Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghái, ChinaA100865
FenilefrinaSigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, AlemaniaP6126

Referencias

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