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Artículo de método

Función de la arteria renal e histopatología relacionada con metabolitos plasmáticos y fecales en pacientes con insuficiencia cardíaca

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DOI:

10.3791/68583

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9 de septiembre de 2025

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1Department of Cardiology and Institute of Vascular Medicine, Peking University Third Hospital, State Key Laboratory of Vascular Homeostasis and Remodeling, Peking University, 2Institute of Cardiovascular Sciences, School of Basic Medical Sciences, Peking University Health Science Center; State Key Laboratory of Vascular Homeostasis and Remodeling, Peking University, 3Beijing Key Laboratory of Cardiovascular Receptors Research, 4Research Unit of Medical Science Research Management/Basic and Clinical Research of Metabolic Cardiovascular Diseases, Chinese Academy of Medical Sciences, Haihe Laboratory of Cell Ecosystem, 5Department of Cardiology, State Key Laboratory of Complex Severe and Rare Diseases, Peking Union Medical College Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, 6Department of Urology, Peking University First Hospital; Institute of Urology, Peking University; Beijing Key Laboratory of Urogenital Diseases (Male) Molecular Diagnosis and Treatment Center, National Urological Cancer Center, 7Institute of Cardiovascular Diseases, First Affiliated Hospital of Dalian Medical University, 8Research Center for Cardiopulmonary Rehabilitation, University of Health and Rehabilitation Sciences Qingdao Hospital (Qingdao Municipal Hospital), School of Health and Life Sciences, University of Health and Rehabilitation Sciences

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para desarrollar una plataforma multimodal para dilucidar la disfunción vascular renal impulsada por metabolitos cardíacos en el síndrome cardiorrenal.

Resumen

La microbiota intestinal y sus cometabolitos huésped-microbio asociados son cada vez más reconocidos como reguladores clave del equilibrio metabólico sistémico y del eje cardiorrenal, particularmente en el contexto del síndrome cardiorrenal. Aunque la evidencia clínica indica que la disfunción cardíaca puede iniciar o exacerbar alteraciones patológicas renales, las moléculas clave de señalización metabólica que median el eje cardiorrenal y sus mecanismos subyacentes siguen siendo difíciles de alcanzar. Este estudio establece una novedosa plataforma de investigación sistemática que integra firmas cardiometabólicas con análisis de la función vascular renal, que comprende: (1) Aislamiento y extracción de metabolitos plasmáticos/fecales de pacientes con insuficiencia cardíaca; (2) Técnicas de aislamiento vascular renal ex vivo y cultivo primario; (3) Un marco de evaluación multimodal para las interacciones metabólicas cardiorrenales, que incorpora ensayos funcionales vasculares, pruebas bioquímicas moleculares para marcadores de lesión vascular renal y análisis histopatológicos. En comparación con los controles sanos, los metabolitos de los pacientes con insuficiencia cardíaca deterioraron la función vascular renal e indujeron respuestas inflamatorias, destacando su potencial como biomarcadores funcionales en el síndrome cardiorrenal. Este estudio no se centra en un metabolito específico; por lo tanto, se requerirá una mayor identificación y validación de los tipos específicos de metabolitos que ejercen efectos patógenos en futuros estudios utilizando técnicas analíticas como LC-MS/MS y RMN. La aplicación de esta plataforma reveló que los metabolitos asociados a la enfermedad cardíaca afectan la función vascular renal y la homeostasis. Estos hallazgos proporcionan una visión mecanicista de los impulsores metabólicos de las interacciones cardiorrenales y ofrecen una herramienta traslacional para identificar nuevos biomarcadores y dianas terapéuticas.

Introducción

El síndrome cardiorrenal (SRC) es una afección patológica compleja caracterizada por un daño bidireccional entre el corazón y los riñones. La intrincada interdependencia entre estos dos órganos fue descrita por primera vez por Robert Bright en 1836, quien documentó sistemáticamente cambios estructurales significativos en el corazón asociados con enfermedad renal avanzada1. La prevalencia de SRC está fuertemente relacionada con la coexistencia de enfermedad cardiovascular (ECV) y enfermedad renal crónica (ERC). Los estudios indican que aproximadamente el 30% de los pacientes con insuficiencia cardíaca también tienen ERC, mientras que el 44%-51% de las muertes en pacientes con ERC se atribuyen directamente a eventos cardiovasculares2.

El manejo de CRS presenta varios desafíos importantes. En primer lugar, la atención clínica sigue estando fragmentada, con una falta de coordinación interdisciplinaria y mecanismos de alerta temprana, lo que a menudo conduce a intervenciones tardías durante la fase3 de descompensación. En segundo lugar, las estrategias de tratamiento actuales se enfrentan a un dilema paradójico. Las terapias convencionales, como los diuréticos y los inhibidores del sistema renina-angiotensina-aldosterona (SRAA), pueden aliviar los síntomas de la insuficiencia cardíaca4; sin embargo, su uso prolongado o en dosis altas puede activar el SRAA y el sistema nervioso simpático (SNS), exacerbando la hipoxia renal y la fibrosis, contribuyendo finalmente a la resistencia a los diuréticos y al empeoramiento de la función renal5. Del mismo modo, si bien los inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina (IECA) y los bloqueadores de los receptores de angiotensina (BRA) pueden mitigar el daño cardiorrenal, su uso clínico a menudo es limitado debido a preocupaciones sobre la creatinina sérica elevada o la hiperpotasemia, con solo el 30%-40% de los pacientes capaces de tolerar la terapia a largo plazo6.

Dados estos desafíos, existe una necesidad urgente de identificar biomarcadores tempranos efectivos y lograr una comprensión más profunda de la patogénesis del SRC para facilitar el descubrimiento de nuevas dianas terapéuticas. Sin embargo, las limitaciones actuales en la identificación de mediadores procesables de la diafonía cardiorrenal, en particular los metabolitos específicos de la enfermedad que vinculan directamente la disfunción cardíaca con la lesión vascular renal, dificultan el progreso en la resolución de estas necesidades clínicas insatisfechas. La evidencia emergente sugiere que los metabolitos asociados a la enfermedad cardíaca pueden servir como biomarcadores de diagnóstico e impulsores mecanicistas del CRS al reprogramar la homeostasis vascular renal, sin embargo, sus funciones espaciotemporales en el inicio o amplificación de la lesión renal siguen estando mal caracterizadas 7,8,9. Estudios recientes han demostrado que los metabolitos endógenos como las ceramidas pueden agravar activamente la inflamación y la remodelación vascular, particularmente en condiciones cardiorrenales, lo que destaca la relevancia más amplia de la detección de metabolitos en la patología vascular10.

Entre los compartimentos renales afectados en el SRC, la vasculatura se reconoce cada vez más como un objetivo primario y temprano de la lesión. La disfunción endotelial en la microcirculación renal, caracterizada por una biodisponibilidad de óxido nítrico alterada, estrés oxidativo y una expresión elevada de mediadores proinflamatorios y protrombóticos, contribuye a la rarefacción microvascular, al aumento de la permeabilidad vascular y a la hipoxia regional11. Paralelamente, las células del músculo liso vascular (CMLV), que son esenciales para regular el tono arterial y la distensibilidad, también son vulnerables a la desregulación metabólica en el SRC. La evidencia acumulada indica que los metabolitos asociados a la enfermedad pueden interrumpir la contractilidad de las CMLV, promover la remodelación desadaptativa y contribuir a aumentar la rigidez vascular y la perfusión renal deteriorada. A pesar de su papel fundamental, los mecanismos de disfunción vascular impulsados por el músculo liso siguen siendo poco explorados en los modelos actuales de SRC 8,12. Estos cambios fisiopatológicos no solo exacerban el daño renal, sino que también promueven la activación neurohormonal desadaptativa y las alteraciones hemodinámicas sistémicas, lo que perjudica aún más la función cardíaca y perpetúa la progresión del SRC13. Por lo tanto, dirigirse a la lesión vascular renal ofrece una ventana informativa mecanicista a la patogénesis temprana del CRS y proporciona un enfoque racional para investigar las interacciones metabólicas corazón-riñón.

Para abordar estas brechas, nuestro estudio prioriza la identificación sistemática y la validación funcional de los metabolitos asociados a la insuficiencia cardíaca como reguladores centrales de la progresión del CRS. Este trabajo salva la desconexión crítica entre el descubrimiento observacional de biomarcadores y la investigación de patogénesis mecanicista al delinear cómo estos metabolitos inducen disfunción vascular renal, activan cascadas inflamatorias y comprometen los mecanismos de reparación de tejidos. Los modelos tradicionales utilizados para estudiar el CRS, incluidos los modelos animales, los cultivos celulares in vitro y los organoides derivados de células madre pluripotentes inducidas (iPSC), tienen limitaciones14. Los modelos animales sufren diferencias entre especies que limitan la relevancia clínica. Los cultivos in vitro carecen de integración a nivel de órgano, mientras que los organoides derivados de iPSC, aunque capaces de modelar interacciones entre cardiomiocitos y células epiteliales tubulares, permanecen funcionalmente inmaduros y se limitan a las primeras etapas de desarrollo15. Además, los sistemas organoides vasculares actuales consisten principalmente en monocapas endoteliales o microvasos primitivos, que carecen de la capa de músculo liso contráctil y las lecturas funcionales necesarias para evaluar las respuestas a nivel de vaso a la lesión metabólica16.

Por el contrario, nuestra plataforma emplea metabolitos cardíacos derivados de humanos y vasculatura renal humana ex vivo , lo que permite arterias renales humanas ex vivo fisiológicamente relevantes y estructuralmente intactas, lo que permite un análisis fisiológicamente relevante y mecanísticamente informativo de las interacciones metabólicas cardiorrenales en la interfaz vascular. Esto proporciona una ventaja única en el modelado de la comunicación metabólica entre órganos que subyace a la progresión del síndrome cardiorrenal. Nuestra plataforma pionera de investigación cardiorrenal integrada sinergiza tres innovaciones principales: perfil metabolómico de metabolitos plasmáticos/fecales derivados de la insuficiencia cardíaca, sistemas de aislamiento/cultivo renovascular ex vivo y evaluación funcional-molecular-histopatológica multimodal. Cada componente de esta plataforma se optimizó para la reproducibilidad y la relevancia traslacional, incluido el uso de 200 μL de plasma o 0,1 g de material fecal por muestra, la incubación de segmentos de arteria renal humana de 2 mm a 37 °C con 5% de CO2 durante un máximo de 24 h y la detección cuantitativa basada en la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (qRT-PCR) de marcadores de lesión vascular. Este sistema no solo descifra el potencial diagnóstico de las firmas de metabolitos, sino que también vincula directamente sus contribuciones causales a la patología del SRC, lo que permite la identificación de dianas terapéuticas a través del mapeo a nivel molecular de la desregulación metabólica entre órganos. Al unir el descubrimiento mecanicista con la traducción clínica, este paradigma de doble enfoque cambia el manejo del CRS del control reactivo de los síntomas a las intervenciones proactivas impulsadas por biomarcadores.

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Protocolo

Los protocolos experimentales y las metodologías de casos empleadas en este estudio fueron aprobados éticamente por el Departamento de Urología del Primer Hospital de la Universidad de Pekín (Código de Revisión Ética: 2023yan500-002) y el Hospital de la Facultad de Medicina de la Unión de Pekín (aprobación No. I-23PJ585), con estricto cumplimiento de los principios descritos en la Declaración de Helsinki. Para este estudio, reclutamos pacientes masculinos o femeninos hospitalizados en el Hospital de la Facultad de Medicina de la Unión de Pekín (PUMCH) a partir de julio de 2019, diagnosticados con insuficiencia cardíaca (IC) por al menos dos cardiólogos experimentados. Se incluyeron un total de cuatro pacientes con IC (HF1-HF4) para la extracción de plasma y metabolitos fecales. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los sujetos antes de su inclusión en la investigación. El aparato experimental y los reactivos se muestran en la Tabla de Materiales.

1. Procesamiento de muestras plasmáticas y fecales: extracción de metabolitos polares

  1. Recogida de muestras
    1. Recoja todas las muestras de plasma y heces en tubos de recolección estériles y preenfriados y congélelas inmediatamente en nitrógeno líquido después de la recolección. Almacenar las muestras a -80 °C hasta su procesamiento.
    2. Para garantizar la estabilidad de los metabolitos, procese todas las muestras dentro de un ciclo de congelación y descongelación y no permita que el intervalo de tiempo entre la recolección y extracción de la muestra exceda las 2 semanas.
      NOTA: Estas medidas se tomaron para minimizar la degradación de metabolitos y garantizar la reproducibilidad en los análisis metabolómicos posteriores.
    3. Extraiga metabolitos de muestras fecales y plasmáticas siguiendo los pasos del protocolo 1.3 o 1.4, respectivamente.
  2. Población de estudio
    1. Tome mediciones de presión arterial de referencia y registre los historiales de medicamentos de todos los participantes.
    2. Recolectar muestras de pacientes antes de cualquier deterioro clínico agudo, excluyendo a las personas con comorbilidades metabólicas importantes (p. ej., diabetes, hipertensión primaria) para minimizar los factores de confusión en el análisis metabolómico (Tabla complementaria S1).
    3. Obtener información clínica para cada sujeto utilizando procedimientos estándar.
  3. Extracción de plasma
    1. Centrifugar suero crudo a 14.000 × g durante 10 min (4-8 °C). Recoja el sobrenadante en nuevos tubos de microcentrífuga de 1,5 ml.
    2. Agregue metanol de grado HPLC refrigerado (-80 °C) para lograr una concentración de metanol del 80% (v/v). Mezclar suavemente por inversión e incubar a -80 °C durante 6-8 h.
    3. Centrifugar a 14.000 × g durante 10 min (4-8 °C). Transfiera el sobrenadante metanólico a tubos nuevos para el perfil metabolómico.
      NOTA: Coloque las muestras de plasma después de la recolección en un congelador a -80 °C dentro de las 2 h y minimice los ciclos de congelación y descongelación para garantizar la estabilidad de los metabolitos.
  4. Extracción fecal
    1. Agregue 500 μL de metanol de grado HPLC (preenfriado a -80 °C) a muestras fecales frescas o congeladas en tubos de microcentrífuga de 1,5 mL. Homogeneizar con un homogeneizador de micromortero/tejido sobre hielo seco durante 1-2 min, seguido de vórtice (1 min a 4-8 °C) e incubación a -80 °C durante 4 h.
    2. Centrifugar a 14.000 × g durante 10 min (4-8 °C) utilizando una centrífuga refrigerada. Transfiera el sobrenadante a nuevos tubos de microcentrífuga de 1,5 ml; almacenar a -80 °C hasta el paso 1.4.4.
    3. Vuelva a suspender el pellet con 400 μl de metanol de grado HPLC preenfriado (-80 °C). Agite bien (1 min a 4-8 °C) e incube a -80 °C durante 30 min.
    4. Repetir la centrifugación (14.000 × g, 10 min, 4-8 °C). Combine los sobrenadantes de ambas fases de extracción.
    5. Realice una centrifugación de clarificación final (14.000 × g, 10 min, 4-8 °C). Transfiera el sobrenadante purificado a tubos estériles de 1,5 ml para su análisis posterior.
      NOTA: Coloque las muestras fecales después de la recolección en un congelador a -80 °C dentro de las 2 h y minimice los ciclos de congelación y descongelación para garantizar la estabilidad de los metabolitos.

2. Aislamiento de la arteria renal

  1. Selección de participantes y recolección de tejidos
    1. Examinar a los pacientes sometidos a nefrectomía radical para detectar carcinoma de células renales. Incluya solo a aquellos de ≥ 18 años sin comorbilidades metabólicas (p. ej., hipertensión primaria, diabetes mellitus). Durante la cirugía, recolecte el parénquima renal histológicamente normal ubicado al menos a 3 cm de los márgenes del tumor.
    2. Sumerja inmediatamente las muestras recolectadas en tampón Krebs-Henseleit oxigenado (4 °C, pH 7,4; composición en mM: 119,0 NaCl, 4,7 KCl, 2,5 CaCl2, 1,0 MgCl2, 25,0 NaHCO3, 1,2 KH2PO4, 11,0 glucosa). Complete los procedimientos de aislamiento dentro de las 6 h posteriores a la cirugía.
  2. Preparación del tejido renal
    1. Realice un corte coronal en tampón Krebs a 4 °C para obtener muestras heminefricas que contengan estructuras hiliares intactas. Realice una microdisección utilizando un sistema estereomicroscópico (aumento de 40x) para exponer las ramas de la arteria arqueada renal e identificar las arterias arqueadas.
  3. Disección microvascular
    1. Logre un aislamiento preciso de los segmentos arteriales mediante la extirpación secuencial del tejido adventicio perivascular con tijeras microcorneales.
    2. Conserve los segmentos arteriales con un diámetro de aproximadamente 500 μm.
    3. Minimice el esfuerzo cortante endotelial mediante la manipulación sin tensión con micropinzas. Realizar la disección en condiciones hipotérmicas (4 °C) con tampón Krebs renovado cada 15 min para preservar el pH fisiológico y la homeostasis iónica.
      NOTA: La cuantificación explícita de las dimensiones arteriales y la composición del tampón, un flujo de trabajo regulado térmicamente desde la obtención (4 °C) hasta el procesamiento (4 °C) y la disección microvascular completa dentro de las 6 h posteriores a la recolección de la muestra garantizan una viabilidad tisular e integridad funcional óptimas.

3. Incubación de la arteria renal con metabolitos de lesión cardíaca

  1. Preparación del tejido vascular: Diseccionar las arterias renales microquirúrgicamente en condiciones estériles y extraer meticulosamente el tejido conectivo perivascular adherido con pinzas oftálmicas finas. Seccionar las arterias renales aisladas en segmentos de 2 mm utilizando microtijeras estériles para su posterior cultivo organotípico.
  2. Descontaminación con antibióticos: Lave los segmentos vasculares durante 3 x 5 min con solución salina tamponada con fosfato (PBS) suplementada con un cóctel triple de antibióticos/antimicóticos para minimizar la contaminación microbiana y garantizar la esterilidad antes de la exposición a los metabolitos.
  3. Agrupación experimental: Asigne aleatoriamente segmentos vasculares a cuatro cohortes experimentales y transfiéralos a placas de cultivo de 24 pocillos que contienen 500 μL de medio Eagle modificado de Dulbecco por pocillo.
  4. Intervención de metabolitos
    1. Agregue metabolitos de los siguientes grupos: 1) Metabolitos derivados del plasma de control sanos (HC-P); 2) Metabolitos derivados del plasma de pacientes con insuficiencia cardíaca (HF-P); 3) Metabolitos derivados de heces de control saludable (HC-F); 4) Metabolitos derivados de las heces de los pacientes con insuficiencia cardíaca (HF-F).
    2. Reconstituya extractos de metabolitos en metanol (grado HPLC) y administre 10 μL de cada extracto en el pocillo correspondiente de la placa de cultivo de 24 pocillos, que contiene 500 μL de Dulbecco's Modified Eagle Medium y segmentos de la arteria renal (concentración final de disolvente del 2% (v/v)). Agregue volúmenes equivalentes de vehículo (mezcla de metanol / PBS) a los pozos de control.
  5. Condiciones de cultivo: Incubar los conjuntos de placas en condiciones estándar de cultivo celular (37 °C, 5% CO2, 95% de humedad) durante 24 h utilizando una incubadora humidificada.

4. Ensayo de anillo de arteria renal

  1. Suspensión y fijación del anillo arterial renal
    1. Preparación del alambre: Enhebre dos alambres paralelos de acero inoxidable de 2 cm (preequilibrados en Krebs, 95% O2/5% CO2) a través de la luz arterial bajo microscopía óptica, asegurando la misma protuberancia del alambre en ambos extremos.
    2. Montaje del miógrafo: Encienda el sistema de calefacción y el gas para mantener la temperatura fisiológica y la oxigenación. Asegure los cables horizontalmente en un baño de miógrafo de alambre con temperatura controlada (Krebs, 95% O2/5% CO2). Ajuste las perillas de los tornillos para mantener la relajación natural de los vasos.
  2. Determinación de la tensión inicial óptima con normalización específica del vaso
    NOTA: La tensión en reposo se ajustó utilizando un procedimiento de normalización para estandarizar las condiciones de referencia, optimizar la capacidad de respuesta de los vasos y garantizar la reproducibilidad. Equilibre durante 30 min antes de proceder con la normalización.
    1. Seleccione la configuración de normalización en el menú DMT , utilizando los siguientes parámetros: calibración del ocular: 1 mm/div; presión objetivo: 13,3 kPa; Relación IC1/IC100: 0,9 C; promedio en línea: 3 s; Tiempo de retardo: 60 s.
      NOTA: En el documento17 se proporcionan detalles adicionales sobre los antecedentes y la configuración del sistema.
    2. Para normalizar un recipiente, seleccione el canal de interés y rellene la pantalla de normalización con datos. Establezca los puntos finales del tejido en función de la lectura del micrómetro y el diámetro del alambre de 40 μm.
    3. Aplique estiramiento pasivo y espere 3 min. Administre 60K + para inducir una contracción mediada por potasio y espere hasta que la contracción alcance una meseta. Enjuague la preparación 3 x 5 min con la solución de Krebs para lavar el 60K+. Calcule la fuerza activa restando la fuerza pasiva en cada nivel de estiramiento de la fuerza inducida por potasio registrada en la traza.
    4. Repita el paso 4.2.3 hasta que se alcance la fuerza activa máxima. Defina la tensión de reposo óptima como el nivel que produce la tensión activa máxima en cada arteria, con respuestas máximas a K+ alto utilizadas como contracciones de referencia.
    5. Equilibre el anillo arterial durante 10 minutos antes de realizar más experimentos.
      NOTA: Debido a la variabilidad interindividual significativa en los grados, espesores y orígenes de los vasos, normalice cada vaso sanguíneo individualmente para garantizar la reproducibilidad. Utilice el módulo de normalización del sistema de miógrafo de alambre para determinar la tensión de referencia adecuada en función del diámetro pasivo y las propiedades mecánicas de cada vaso. Aplique el procedimiento de manera consistente en todas las muestras antes de las pruebas funcionales.
  3. Detección de reactividad de los anillos de la arteria renal
    1. Para investigar los efectos de diferentes metabolitos sobre la contractilidad vascular, realizar pruebas de función de contracción vascular utilizando arterias renales incubadas con plasma extraído y metabolitos fecales de voluntarios sanos y pacientes con IC durante 12 h. Para obtener detalles específicos, consulte la sección 3.
    2. Use 60K + para provocar una contracción mediada por potasio. Asegúrese de que cada cámara tenga 5 ml de solución de Krebs.
    3. Para determinar las contracciones dependientes de la concentración inducidas por fenilefrina (Phe) en los anillos arteriales, agregue Phe en incrementos de medio logaritmo de 10-9 a 10-4 M. Comience con la concentración más baja de Phe, introdúzcala en la cámara y espere una contracción constante.
    4. Marque el punto en el que se alcanza una contracción constante (es decir, registre el valor de tensión en la meseta), luego pase a la siguiente concentración. Repita hasta que la concentración final se haya agregado con éxito.
    5. Después de finalizar el experimento, guarde el archivo de datos y retire los anillos arteriales. Limpie bien la cámara con una solución de ácido acético al 8%, luego incube durante 3 min.
    6. Apague el sistema de calefacción y el gas, asegurándose de que se haya eliminado todo el líquido antes de apagar el gas.

5. Examen histopatológico de la arteria renal: tinción de hematoxilina-eosina

NOTA: Deseche los reactivos peligrosos y los desechos biológicos de acuerdo con los protocolos institucionales de bioseguridad e higiene química. Específicamente, el xileno y el paraformaldehído deben recolectarse en contenedores de desechos químicos etiquetados y sellables y almacenarse en un área designada para la campana extractora antes de su eliminación por manipuladores de desechos peligrosos certificados. El ácido acético utilizado para la limpieza de la cámara del miógrafo debe neutralizarse y eliminarse siguiendo los procedimientos estándar de eliminación de desechos ácidos. No descargue ninguno de estos reactivos en sumideros de laboratorio.

  1. Lave las arterias en PBS frío y fíjelas en paraformaldehído al 4% (pH 7.4) durante la noche. Corte secciones seriadas a 4 μm y procese para histología.
  2. Incube las secciones de tejido montadas en portaobjetos de vidrio en un secador de portaobjetos a 60 °C durante 1 h, luego transfiéralas inmediatamente al xileno. Sumerja las secciones en xileno (3 x 5 min).
  3. Someter las secciones a hidratación graduada con etanol: 100% etanol (2 x 5 min), 95% etanol (1 x 5 min), 90% etanol (1 x 5 min), 80% etanol (1 x 5 min), 70% etanol (1 x 5 min), enjuague con agua ultrapura (1 x 5 min).
  4. Tiñe con hematoxilina (0,5% p/v) durante 5 min; luego enjuague con agua corriente.
  5. Diferenciar con alcohol ácido al 1% (HCl-etanol) durante 5-10 s y enjuagar con agua corriente.
  6. Azular las secciones en agua con amoníaco al 0,6% y enjuagar con agua corriente.
  7. Sumerja las secciones en solución de eosina (1% p/v) durante 2 min.
  8. Deshidrate y limpie las secciones en etanol al 95% (2 x 5 min), etanol al 100% (2 x 5 min) y xileno (2 x 5 min).
  9. Seque al aire brevemente hasta lograr una transparencia óptica, móntelo en un medio de montaje, cúbralo con cubreobjetos y selle los cubreobjetos con un medio de montaje neutro.
  10. Realice imágenes de campo claro y evaluación histomorfométrica.

6. Detección de biomarcadores moleculares asociados a la lesión renal

  1. Extracción de ARNm de la arteria renal
    1. Agregue el tejido vascular criopreservado en nitrógeno líquido a 1 ml de reactivo de extracción de ARN y transfiéralo a un homogeneizador de tejido preenfriado para una homogeneización completa.
    2. Añadir 250 μL de cloroformo por cada 100 μL del reactivo de extracción, agitar vigorosamente durante 30 s e incubar durante 10 min a 25 °C.
    3. Centrifugar a 12.000 × g (10 min, 4 °C) y transferir la fase acuosa a un tubo nuevo.
    4. Añadir 500 μL de isopropanol a la fase acuosa, mezclar por inversión e incubar durante 20 min a 25 °C.
    5. Centrifugar a 12.000 × g (10 min, 4 °C) y desechar el sobrenadante.
    6. Lave el gránulo con 1 ml de etanol al 75% (2 x 5 min), seque al aire el gránulo de ARN y vuelva a suspender en DEPC-H2O (0,1% v/v).
      NOTA: Verifique la pureza del ARN (OD260 / OD280 = 1.9-2.0) y confirme las bandas de ARNr 28S / 18S intactas.
  2. Síntesis de ADNc
    1. Mezcle 2 μg de ARNm + 1 μL de cebador oligo(dT), ajuste a 8 μL con DEPC-H2O (0,1% v/v), caliente a 70 °C durante 5 min y enfríe rápidamente en hielo durante 5 min.
    2. Prepare la mezcla maestra de transcripción inversa en 10 μL de 2x TS Reaction Mix, 1 μL de RT/RI Enzyme Mix y 1 μL de gDNA Remover. Agregue los 12 μL de mezcla maestra a los 8 μL de mezcla de ARN/cebador del Paso 6.2.1 para lograr un volumen total de reacción de 20 μL.
    3. Calentar la mezcla del paso 6.2.2. a 42 °C durante 60 min y terminar el proceso calentando a 85 °C durante 5 min.
    4. Diluya los 20 μL de reacción de transcripción inversa agregando 80 μL de H2O libre de nucleasas, lo que da como resultado un volumen final de 100 μL (dilución 4x). Utilice el ADNc diluido como plantilla para la PCR cuantitativa.
  3. Análisis cuantitativo de PCR
    1. Configure la reacción mezclando 2,0 μl de plantilla de ADNc, 0,5 μl de cebador directo (10 μM), 0,5 μl de cebador inverso (10 μM), 10 μl de mezcla maestra SYBR Green (2x) y 7 μl de ddH2O.
    2. Realice la PCR utilizando los siguientes ajustes: desnaturalización inicial: 95 °C/3 min; 40 ciclos: 95 °C/30 s; Tm-5 °C/30 s; 72 °C/30 s; curva de fusión: 65-95 °C (+0,5 °C/5 s).
    3. Analizar la expresión génica mediante el método 2-ΔΔct. Las secuencias de cebadores se muestran en la Tabla complementaria S2.

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Resultados

La cohorte estuvo formada por dos mujeres y dos hombres, con un rango de edad de 46 a 73 años (edad media: 64,0 años). Las mediciones basales de la presión arterial mostraron una presión arterial sistólica que oscilaba entre 109 y 168 mmHg y una presión diastólica de 68 a 115 mmHg. Todos los pacientes con IC tenían antecedentes de medicación registrados, incluidos agentes cardioprotectores comunes como betabloqueantes, estatinas y antiagregantes plaquetarios, con variaciones individuales en los inhibidores del sistema re...

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Discusión

Investigaciones recientes en CRS han identificado la reprogramación metabólica como un mecanismo patológico clave, con metabolitos que regulan la homeostasis vascular renal 7,8,9. Si bien las CMLV juegan un papel fundamental en la regulación del tono vascular y la distensibilidad en el CRS, nuestro estudio proporciona evidencia directa de que los metabolitos asociados a la lesión cardíaca afecta...

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Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que divulgar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Programa Nacional de Investigación y Desarrollo Clave de China (2021YFF0501401, 2018YFA0800501 a Y. Z., 2021YFF0501404 a Y. L.), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (82325004 y 92168114 a Y. Z., 82300286 a J. Z., 92168113 a E. D., 82170422 a Y. L.), el Fondo de Innovación del Ecosistema Celular del Laboratorio de Haihe (No. HH22KYZX0047 a E. D), Fundación de Ciencias Postdoctorales de China (BX20220023, 2022M720288 a J. Z.), Fundación de Ciencias Naturales de Beijing (7252157 a J. Z.). Fundación Municipal de Ciencias Naturales de Beijing (7232096 a Y. L.), Proyecto de investigación del Tercer Hospital de la Universidad de Pekín en el Laboratorio Estatal Clave de Homeostasis y Remodelación Vascular (Universidad de Pekín; 2024-VHR-SY-07 a Y.Z.). La Figura 1 se creó con Biorender.com con licencias aprobadas.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
DMEM Glucosa altaGibcoGato# 06-1055-57-1-ACS
PBSSolarbioCategoría # P1010
Penicilina-Estreptomicina-Anfotericina BThermo Fisher ScientificCat# 15240062
FenilefrinaMCECategoría#HY-B0769
Sistema de transcripción inversaPromegaGato# A5001
Sistema estereomicroscópicoLeicaM80
Mezcla maestra SYBR GreenThermo Fisher ScientificCat# 4309155
Sistema de medición de la tensión vascularDMT620 millones

Referencias

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